Name: Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Migration von Trunk Neural Crest Zellen mit einem modifizierten Zigmond Chamber Assay analysieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Unterscheidung von Chemotaxis und anderen Migrationsmustern.

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Wir geben besonderen Dank an Lino Kim, Steve Guzman und Ujit Satyarthi für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel und Roberto Rojas bearbeitet die Kammern verwendet hier und dringend benötigte technische Unterstützung. Bemerkenswert ist, produziert Roberto Rojas Abbildung 4. Wir sind auch dankbar für wertvolle Ratschläge Scott Fraser vor der Entwicklung der oben genannten Chemotaxis Assay. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 bis MEDB und durch eine Auszeichnung von der CSU, Northridge Diplomarbeit Support Program CW unterstützt.

Ein. Tag 1: Isolierung von Stamm neuronalen Rohre für Übernacht-Kultur auf Deckgläsern <ol><li> Inkubieren chick Eier für 56 h bei 38 ° C. Entfernen Sie die Eier aus der Inkubation, leicht besprühen sie mit 70% Ethanol und dann trocknen lassen. Die Eier öffnen sich in einem UV-sterilisiert Glasschale. </li><li> Extrahieren Sie jede Embryo aus Dotter und legen Sie sie in chick Ringer. Tun Sie dies, indem zuerst um seine Blutinseln mit gebogenen Schere, dann mit stumpfen Pinzette, wählen Sie die Embryos von seinem extraembryonalen Membran und legen Sie sie in einem sterilen Petrischale mit chick Ringer-Lösung. </li><li> Isolieren den Kofferraum jedes Embryos durch Trimmen überschüssige extraembryonalen Membranen sowie Schädel-, vagalen und sakralen axialen Ebenen mit einem Wolfram-Nadel (Abb. 1). Wählen Sie zunächst ca. 9 Embryonen, die zwischen den Stufen HH15-17 11 sind. Für Bühnen HH15 oder höher, bilden die Vorderhirns und Rautenhirn Achsen einen spitzen Winkel und damit der Kopf scheint kaudal kippen. BeiBühne HH17, der Schwanz ist bud Gegenwart und kippt ventral aber noch nicht enthalten Somiten. Mit einer Wolfram-Nadel, schneiden Sie extraembryonalen Membranen bis etwa 2 mm aus dem Embryo und schneiden Sie embryonalen Geweben vorderen bis 10 Somiten. Entfernen Sie auch alle caudal embryonalen Geweben ab etwa dem fünften meisten neu gebildeten Somiten. </li><li> Legen Sie die isolierten embryonalen Stämme in Dispase (0,24 U / ml DMEM) und inkubieren sie für 1 h 15 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Sobald die Stämme der Inkubation beginnen, starten Herstellung von 6 Deckgläser (CS) für die Kultivierung NT Explantate (Schritte von 1,5 bis 1,8). </li><li> Spülen 6 CS in 70% Ethanol (verdünnt in sterile, Reinstwasser) und dann trocknen lassen. Mit einem Labor-Marker, einen Kreis in der Mitte jeder CS, die etwa 1 cm im Durchmesser (dieser Kreis wird später helfen, herauszufinden, wo ein Fibronektin Mantel angewendet wurde) ist. Auf der gleichen Seite jedes CS, schreibt das Wort "be" (oder eine andere asymmetrische Wort oder Form) außerhalb des gezeichneten Kreis (dies y helfenou ermitteln, ob die markierte Seite des CS nach oben oder unten). </li><li> Platzieren Sie jede CS in einem separaten 40 x 10 mm sterile Schale mit der markierten Fläche nach unten und lassen Sie das Gericht zu sitzen unter einem keimtötende UV-Lampe für 10 min geöffnet. </li><li> Anwenden 60 ul Fibronektin (FN; 10 ug / ml DMEM) mit dem unmarkierten Oberfläche des CS gleichzeitig dafür der gesamte Bereich innerhalb des Kreises 1 cm beschichtet wird. Die Schalen werden bei 37 ° C für 30 min inkubieren und dann sorgfältig absaugen Fibronektin aus jedem CS. </li><li> Eintragen von 250 ul "Kultur"-Medium [DMEM mit L-Glutamin (2 mM), Penicillin (100U/ml), Streptomycin (100 mcg / ml), 8% fetales Rinderserum (FBS)] zu dem FN-beschichtete Fläche die CS. Die Schalen werden mit jeder CS bei 37 ° C und 5% CO 2 wieder, bis die NTs isoliert wurden. </li><li> Übertragen Sie alle bebrüteten Embryo Stämme zu einem 5 cm Glas-Petrischale mit L15 Medium und starten Sezieren aus jeder NT mit feinen Pinzette und eine Wolfram-Nadel (Abb. 1). Ct ein sorgfältig entlang der Grenze des NT und Somiten scheibe mit einem scharfen Wolframnadel während es nicht auf die vorsichtige NT beschädigen. Es ist oft einfacher zu beginnen Isolieren jeder NT aus dem kaudalen fast Ende des Rumpfes. </li><li> Wählen Sie 6 der geradesten und längste NTs die Kultur über Nacht (NTs zwischen etwa 8 und 15 Somiten lange werden empfohlen). Verwendung einer Mikropipettenspitze mit Kulturmedium grundiert übertragen jeder der 6 NTs seinen eigenen zuvor hergestellten CS (ab Schritte 1.5 bis 1.8). Achten Sie darauf, dass das NT bleibt nicht an der Oberfläche schwimmen. Wenn das NT schwebt, tropft Medium auf ihn, bis er mit einer Mikropipette sinkt. </li><li> Platzieren Sie jede Schale bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht. Vorsichtig sein, um sicherzustellen, dass jedes NT ist innerhalb der FN-beschichteten Bereich seiner jeweiligen CS unmittelbar vor dem Platzieren der Schale in den Inkubator (mithilfe des Kreises im Schritt 1.5 als Referenz gezeichnet). Ein Mikropipette kann zur besseren Einstellung der Position jedes NT, wenn nötig. </li><li> Place atmindestens 2 ml Kultur-Medium (ohne Serum) in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht. Lassen Sie die Kappe leicht abgeschraubt, um den pH-Wert des Mediums über Nacht anpassen können. Pre-Inkubieren des Mediums ist wichtig, um zu verhindern Blasenbildung in deine Kammer, die die Einrichtung eines molekularen Gradienten stören können. Solche "vorinkubierten" Medium sollte bei allen künftigen Maßnahmen verwendet werden. Wenn nicht verwendet wird, sollte dieses Medium bei 37 werden Inkubation ° C. </li></ol> 2. Tag 2: Laden des modifizierten Zigmond Kammer und Zeitraffer-Analyse der Zellmigration <ol><li> Von den 6 NTs kultiviert, wählen Sie die 3 Kulturen am besten für die Analyse geeignet. Im Allgemeinen sollte NCC Kulturen, die mindestens eine lange, gerade Kante haben, ausgewählt (2A) ist. Die 3 besten Kulturen zum Laden und Film 3 geändert Zigmond Kammern den ganzen Tag, jeder mit einer anderen Behandlung. Von den 3 Kulturen, wählen Sie ein für loading die erste Kammer und händigt die übrigen in den Inkubator für die spätere Verwendung. </li><li> Mit einem Wattestäbchen, eine dünne, gleichmäßige Schicht Vaseline rund um die Stauseen und Brücke ein modifiziertes Zigmond Kammer. </li><li> Mit einem Wolframnadel, entfernen die vom NT CS, während er die umgebenden NCCs an der Oberfläche des CS. Markieren Sie die Schale mit einem Stift, um die Ausrichtung der geradesten Rand des NCC Kultur erinnern. </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen vorinkubierten Medium auf der Brücke. Nehmen Sie den CS mit feinen Pinzetten, dab die Kante der CS gegen einen Kimwipe die meisten der alten Kulturmedium zu entfernen, dann sofort den CS auf der modifizierten Zigmond Kammer, so dass die gerade Kante der Kultur gefilmt werden über zentriert ist die Länge der Brücke und etwa senkrecht zu der Brücke-Reservoir Rand (2A, B). </li><li> Mit einem inversen Mikroskop, bewegen Sie den geraden NCC Grenze auf der Seite der Brücke am nächsten th werdene Reservoir, das den mutmaßlichen chemotactant enthalten wird (Abb. 2B; für die Kontrollen wird dies auf den niedrigeren Reservoir geladen Sekunden entsprechen). Auch feiner auszurichten die gerade Kante der Kultur auf senkrecht zur Brücke-Reservoir Grenze sein. </li><li> Sorgfältig, aber sicheren drücken CS in die Vaseline auf dem Zigmond Kammer ein, dass sie vollständig auf die Kammer versiegelt, dann stellen zusätzliche Vaseline entlang der Kante des CS weiter sicherzustellen, dass es luftdicht sein. Feineinstellung des Winkels des NCC Grenze wieder für jede Bewegung beim Siegeln zu korrigieren. </li><li> Legen Sie den Behälter, die nicht enthalten, werden die vermuteten chemotactant ersten (Abb. 2B). Tun Sie dies, indem er ein 1-ml-Spritze (25 G x 1,5 in. Kanüle) mit rund 300 ul vorinkubierten mittel-und injizieren das Medium in den Behälter bis zur vollständigen (dabei darauf achten, dass keine Luftblasen in den Behälter zu erzeugen). Stecken des Reservoirs auf beiden Seiten mit einer ausr.iziente Menge Vaseline vor dem Laden des nächsten Behälter. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,7, außer dieser Zeit mit vorinkubierten Medium mit den Kandidaten chemotactant. Es ist wichtig, bei der Erzeugung eines molekularen Gradienten über die Kultur immer laden das Reservoir enthält das Molekül nach dem Laden das Reservoir fehlt den getesteten Molekül getestet werden. </li><li> Setzen Sie den geladenen Zigmond Kammer bei 37 ° C für 1 h vor den Dreharbeiten zu inkubieren. Bild der geradeste Rand des NCC Kultur für 3 h bei 90 s-Intervallen während der Inkubation bei etwa 37 ° C (Abb. 2A, B). Vor dem Erstellen jeden Film ist, lesen Sie die Kamera so ausrichten, dass der Rand der Bilder zu erhalten und mit berühren den Rand der Brücke, die die letzte Reservoir geladenen grenzt (2B, obere Platte ausgerichtet sind; gestrichelten Kasten stellt ideale Position für imaging). Dies wird später Softwareanalyse durch Standardisieren die Direktionalität des molekularen angelegt, und th erleichterne Abstand von dem Reservoir in jedem Film gedreht hergestellt. </li><li> Für Steuerelemente, die Schritte 2,2-2,9 für jede der zwei anderen Kulturen NCC ausgewählte (Schritt 2.1), aber erfüllen jedes Reservoir mit einem geeigneten Medium. Für eine Regelungsart füllen beide Reservoire mit vorinkubierten Medium ohne das Molekül getestet werden. Für eine zweite Kontrolle der Behandlung, prime die Brücke mit ein paar Tropfen vorinkubierten Medium mit dem Verdacht auf chemotactant vor der Montage der CS. Dann laden beide Reservoire mit dem gleichen Medium, enthaltend den mutmaßlichen chemotactant. </li><li> Verwenden ImageJ (NIH) Manuelle Spur <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / Track / track.html)</a> und Chemotaxis und Migration Tool v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de / applications / ap_chemo.html)</a> plugins zu verfolgen die Migration von peripheren NCCs entlang der geraden Rand der Kultur just abgebildet und auf verschiedene Parameter der wandernden Trajektorien erhalten (2B-C) zu analysieren. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Eine Probe von Zellen aus einem Film Trajektorien wo viele Stamm NCCs waren auf ein Kandidaten-chemoattraktive Verwendung des oben gezeigten Technik wird (2D). Die meisten Zellen in diesem Beispiel einer positiven Antwort erscheint eine Netto-Bewegung bis der Lockstoff-Gradienten (in Rot dargestellt). Trajektoriendaten verwendet, um andere Eigenschaften der Zellwanderung und analysieren. Um visuell auswerten einer angelegten Gradienten in einer modifizierten Zigmond Kammer, eine Alexa Fluor 488 IgM-Konjugat (MW ~ 900 kDa) wurde in das zweite Reservoir eines modifizierten Zigmond Kammer (bei ​​etwa 40 pg / ml H 2 O) geladen. Ein Gradient wurde durch 1 h festgelegt und noch etwas vorliegenden nach 26 h, aber stark von 50 h vermindert (Abb. 3). Wenn das Molekül zu testenden kleiner ist, dann wird die angewandte Gradienten will schneller abbauen als das, was angezeigt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Explantation der Stamm-Ebene NTs über Nacht Kultivierung auf Fibronektin-beschichteten Deckgläschen. Weil Stamm NCCs delaminieren aus dem dorsalen NT befindet sich neben Somiten 8-28 wird dieses Segment des NT durch Mikrodissektion und über Nacht auf einem fibronektinbeschichtete CS für Auswanderung von NCCs aus dem NT Explantat ermöglichen isoliert. Isolated NTs, die zwischen 8-15 Somiten langen und relativ gerade sind am besten über Nacht Kultivierung geeignet, da sie an NCC Kulturen mit längeren geraden Grenzen ergeben neigen. Regionen des Neuralrohrs, die zu anderen Neuralleiste axialen Ebenen geben in einer kleineren Schrift dargestellt. s, Somiten. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Verfahren zur Auswertung der Migration von explantierten Trunk NCCsmit einem modifizierten Zigmond Kammer. (A) langgestreckten Rumpfes NCC Kulturen werden über Nacht kultiviert und von NTs resultierende NCC Kulturen mit wenigstens einem langen geraden Rand hergestellt werden für das Experiment ausgewählt. Die längste gerade Rand eines ausgewählten Kultur wird dann senkrecht zu der Brücke-Reservoir Rand positioniert ist, und somit parallel zum Vektor der Zukunft angewendet Gradienten. (B) Nach Feineinstellung der Position des NCC Kultur auf der Kammer und Abdichten Zigmond das Deckglas auf der Kammer, wird die Kammer geladen. Beim Testen Chemotaxis, das Reservoir, der nicht enthalten, werden die verdächtige chemotactant (-) geladen ersten und versiegelt. Dann wird das Reservoir mit dem anderen mutmaßlichen chemotactant (+) und versiegelten geladen. Peripheral NCCs entlang der zuvor ausgewählten Grenze kann dann abgebildet und verfolgt werden mit der manuellen Tracking-Plugin für ImageJ (unten). (C) Zahlreiche Zugvögel Eigenschaften als Reaktionum die aufgebrachte Gradient kann basierend auf Tracking-Daten beurteilt werden. Zum Beispiel kann ein Chemotaxis-Index durch Teilen einer Zelle Verschiebung entlang der x-Achse um die Gesamtdistanz es gewandert ableiten. (D) Ein Beispiel eines attraktiven Reaktion durch eine Zelle Trajektorie Plot ursprünglich von der Chemotaxis und Migration erzeugt wird gezeigt Tool Plugin für ImageJ. Der Ausgangspunkt jeder Trajektorie mit dem Ursprung (0,0) eingestellt. Man beachte, wie viel mehr Zellen in Richtung der Quelle anschließen chemoattraktive Massezentrum aller Zellen auf ihre endgültige Position zu migrieren (blaues Kreuz; alle Zellen gleich gewichtet) ebenfalls näher zu dem Chemoattractant Quelle. NCCs, Neuralleistenzellen; Red Spuren, Zellen, die zum Vorratsbehälter geladen mit migriert ein vermuteter chemoattraktive; Schwarz Spuren, Zellen, die auswärts migriert, (+), höhere chemotactant Konzentration; (-), niederes chemotactant Konzentration. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Intensitätsprofile über die Brücke eines modifizierten Zigmond Kammer zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe eines Alexa Fluor 488 IgM Konjugat ist. Die Kammer wurde in ähnlicher Weise wie in dem Protokoll mit den wichtigsten Ausnahmen beschrieben geladen daß vorinkubierten Wasser (statt vorinkubierten Medium) benutzt, um den Antikörper zu 40 pg / ml zu verdünnen, und kleine Lufteinschlüsse waren an den Enden der Brücke (weg von der Scheibe, wo die oben Intensitätsprofile wo angenommen) vorhanden ist. Anfangs war kein Gefälle vorhanden in den meisten der Brücke. Mit 1 ha Gradient wurde gegründet und blieb bis 26 h vorhanden. Von 50 h die Anwesenheit des Gradienten inkonsistent zu unterschiedlichen Bereichen der Brücke war, und wenn vorhanden, wurde die Steilheit des Gradienten stark vermindert. Sämtliche Profile wurden von einer identischen scheibe über die Brücke (von einem brückenartigen Reservoir Rand zum anderen) mit AxioVision 4,6 Software generiert. Beachten Sie, dass auch während der LuftTaschen vorhanden waren, wurde die Steigung nicht gestört. Hohe, hohe Intensität, niedrig, niedriger Intensität, x-Achse, Abstand über die gesamte Breite der Brücke (2 mm), (+), mit dem Reservoir Alexa Fluor 488 IgM-Konjugat beladen; (-), Behälter nicht mit dem Konjugat beladen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Modifizierte Zigmond Kammer Spezifikationen. Dargestellt ist ein Diagramm des modifizierten Zigmond Kammer welche hier zusammen mit seiner Maßangaben (± 0,2 mm). Die Messungen können moderat angepasst werden, um den individuellen Wünschen entsprechen. Supplemental Protokoll: Herstellung eines Modified Zigmond Kammer Bitte beachten Sie 4 als Referenz für das Protokoll in der folgenden Abbildung: <ol><li> Erwerben Sie ein Blatt 3/16 "dick poliert Acryl (4,45 mm tatsächliche Dicke). </li><li> Mit einer Tischkreissäge, schneiden Kammer Rohlinge überdimensioniert, um diegroben Abmessungen von 33,25 mm x 64,57 mm. Dies ermöglicht 3,175 mm zusätzliches Material für die Bearbeitung. </li><li> Die Kammer leer in einem Schraubstock. Mit einer Fräsmaschine und einer 6,35 mm (1/4 ") end mill bit, Fertigbearbeitung die Seiten der Kammer, um ihre genauen Abmessungen: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Positionieren Sie die Kammer leer auf der Fräsmaschine und suchen Sie die Mitte des Rohlings entlang der x-und y-Achse mit einem Kantentaster, dann Null das Stadtzentrum. </li><li> Erwerben die Kammer Höhe (z-Achse) durch Berühren des Schaftfräsers Bit auf der oberen Fläche und die Höhe Null. </li><li> Verwendung einer 3,91 mm (0,154 ") Schaftfräser Bit, das Bit-Offset 3,03 mm entlang der x-Achse (positive Richtung) für das erste Reservoir. Beginnen Bearbeitung in die Kammer bis zu einer Tiefe von 2,84 mm während der Bewegung entlang der y-Achse (positive Richtung) bis 7,62 mm (0,300 ") und dann zu durchqueren, um 7,62 mm (0,300") in der entgegengesetzten (negativen) Richtung bis zu einem vollständigen Reservoir Länge von 15,24 mm (0,600 "). Offsetdruckdas Bit auf 3,03 mm (0,119 ") entlang der x-Achse (negative Richtung) und Wiederholen des gleichen Verfahrens für die zweite Reservoir. </li><li> Positionieren der die Kammer an ihrem Rand und ein Loch mit einem 1,09 mm (0,043 Zoll) Bohrmeißel am Ende eines jeden Behälters (4 total), das das Ende des Reservoirs verbindet zu der Seite der Kammer für das Laden Medium während Experimentieren. </li><li> Weichen Sie die Kammer auch in warmem Seifenwasser zu helfen, entfernen Sie keine chemischen Verunreinigungen. </li><li> Spülen Sie die Kammer auch in doppelt destilliertem Wasser keine Seife entfernen. Die Kammern sind jetzt einsatzbereit wie oben beschrieben. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dirigieren Chemotaxis Forschung am Stamm NCCs erwiesen Herausforderung für eine Reihe von Gründen. Trunk NCCs sind eine heterogene Stammzellen Bevölkerung unterscheiden, ob kultivierten langfristigen wird, daher trunk NCCs aus primären Explantation des Stamm-Ebene NT eingeholt werden muss. Herkömmliche Verfahren, die chemotaktische Reaktion von homogen verteilt Zellpopulationen in vitro zu untersuchen sind schwierig auf Trunk NCCs testen, da sie zuerst erforderlich, dass Zellen getrennt und homogen wiederplatti...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Scientific </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin Streptomycin-Lösung </td><td> Omega Scientific </td><td> PS-20 </td><td> 100X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Omega Scientific </td><td> GS-60 </td><td> 100X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Omega Scientific </td><td> FB-11 </td><td> Lot # 105247 (oder eine andere, die vergleichbar ist) </td></tr><tr><td> Modified Zigmond Kammer </td><td> Hausgemachte </td><td> N / A </td><td> Behältervolumen: ~ 160 ul ea, für zusätzliche Spezifikationen, siehe Abb. 4 und die ergänzende Herstellung Protokoll </td></tr><tr><td> Zellkulturschale </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> 10X Lager vorbereitet durch Verdünnen von 1 mg FN in 1 ml H 2 O und 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fischer </td><td> 12-548-B </td><td> Vorgereinigt; 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 Medium </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td> Comforts </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Cell Systems </td><td> 4Z0-850 </td><td> 10X Lager Konzentration </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Nadel </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 Zoll </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Ichnvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Stock ist 2 mg / ml; 7 Mol Farbstoff / Mol IgM </td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont # 5 oder 55; geraden gekippt; Edelstahl oder Titan </td></tr><tr><td> Tungsten Needle </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Hausgemachte; platziert in einem Stifthalter </td></tr><tr><td> Blunt Forceps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Wird für die Übertragung Embryonen Ringer aus Eigelb </td></tr></tbody></table> Supplemental Protokoll: Herstellung eines Modified Zigmond Kammer Bitte beachten Sie 4 als Referenz für das Protokoll in der folgenden Abbildung: <ol><li> Erwerben Sie ein Blatt 3/16 &quot;dick poliert Acryl (4,45 mm tatsächliche Dicke). </li><li> Mit einer Tischkreissäge, schneiden Kammer Rohlinge überdimensioniert, um den groben Abmessungen von 33,25 mm x 64,57 mm. Dies ermöglicht 3,175 mm zusätzliches Material für die Bearbeitung. </li><li> Die Kammer leer auf einer vise. Mit einer Fräsmaschine und einer 6,35 mm (1/4 &quot;) end mill bit, Fertigbearbeitung die Seiten der Kammer, um ihre genauen Abmessungen: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> Positionieren Sie die Kammer leer auf der Fräsmaschine und suchen Sie die Mitte des Rohlings entlang der x-und y-Achse mit einem Kantentaster, dann Null das Stadtzentrum. </li><li> Erwerben die Kammer Höhe (z-Achse) durch Berühren des Schaftfräsers Bit auf der oberen Fläche und die Höhe Null. </li><li> Verwendung einer 3,91 mm (0,154 &quot;) Schaftfräser Bit, das Bit-Offset 3,03 mm entlang der x-Achse (positive Richtung) für das erste Reservoir. Begin Bearbeitung in die Kammer bis zu einer Tiefe von 2,84 mm während der Bewegung entlang der y-Achse ( positive Richtung) bis 7,62 mm (0,300) &quot;) und dann zu 7,62 mm (0,300 durchqueren&quot; in der entgegengesetzten (negativen) Richtung bis zu einem vollständigen Reservoir Länge von 15,24 mm (0,600 &quot;). Offset das Bit auf 3,03 mm (0,119 &quot;) entlang der x-Achse (negative Richtung) und wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Reservoir. </li><li> Positionieren Sie die Kammer an ihrem Randund Bohren eines Loches mit einem 1,09 mm (0,043 Zoll) Bohrmeißel am Ende eines jeden Behälters (4 total), das das Ende des Reservoirs verbindet zu der Seite der Kammer für das Laden Medium während Experimentieren. </li><li> Weichen Sie die Kammer auch in warmem Seifenwasser zu helfen, entfernen Sie keine chemischen Verunreinigungen. </li><li> Spülen Sie die Kammer auch in doppelt destilliertem Wasser keine Seife entfernen. Die Kammern sind jetzt einsatzbereit wie oben beschrieben. </li></ol>

analyse der trunk neural crest cell migration mit hilfe eines modifizierten zigmond chamber assay

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neuralleistenzellen (NCC) ist eine transiente Population von Zellen, die in Entwicklung von Wirbeltieren, dass aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern nach Durchlaufen eines epithelial-mesenchymale Transition 1,2. Nach EMT, migrieren NCCs große Entfernungen entlang stereotypes Wege, bis sie ihre Ziele zu erreichen. NCCs differenzieren sich in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Melanozyten und Chromaffinzellen 1-3. Die Fähigkeit von NCCs zu erreichen und erkennen ihre richtigen Zielregionen für die entsprechende Ausbildung aller Strukturen mit trunk NCC-abgeleiteten Komponenten 3 grundlegend. Aufklärung der Mechanismen von Leitlinien für Trunk NCC Migration hat deshalb eine Angelegenheit von großer Bedeutung. Zahlreiche Moleküle nachgewiesen, dass NCC Migration 4 führen. Beispielsweise werden Trunk NCCs bekanntermaßen von negativen Führung Zeitgeber wie Semaphorin, Ephrin und Slit Liganden 5-8 abgestoßen werden. Allerdings sind nichtbis vor kurzem keine Lockstoffe des Rumpfes NCCs identifiziert worden 9. Herkömmliche Ansätze zur in vitro Untersuchung der chemotaktischen Verhalten von adhärenten Zellen funktionieren am besten mit immortalisierten, homogen verteilt Zellen, sind jedoch schwieriger zu bestimmten primären Stammzellkulturen die zunächst fehlt eine homogene Verteilung und rasch zu unterscheiden (wie NCCs) anzuwenden. Ein Ansatz, um die Verteilung der Stamm NCCs für Chemotaxisstudien homogenisieren ist die Trunk NCCs aus primären NT Explantatkulturen isolieren, dann heben und replate ihnen zu fast 100% konfluent. Dies erfordert jedoch plating Ansatz erhebliche Mengen an Zeit und Mühe, um genügend Zellen Explantation, ist hart und vertreibt trunk NCCs in einem ungleichen Weise wie in in vivo-Bedingungen gefunden. Hier berichten wir über eine in vitro Ansatz, der in der Lage, Chemotaxis und andere wandernde Reaktionen des Rumpfes NCCs ohne requirin bewerten istga homogene Zellverteilung. Diese Technik nutzt Zeitraffer-Aufnahmen von primären, unbeirrt trunk NCCs in einem modifizierten Zigmond Kammer (ein Standard Zigmond Kammer wird an anderer Stelle 10 beschrieben). Durch Belichten Trunk NCCs am Umfang der Kultur auf eine chemotactant Gradienten, die senkrecht zu ihrer vorhergesagten natürliche Richtung, können Veränderungen in wandernden Polarität durch die angelegte chemotactant Gradienten induzierte detektiert werden. Diese Technik ist kostengünstig, erfordert das Züchten von nur zwei NT je Wiederholung Explantate Behandlung vermeidet rauen Zelle Anheben (wie Trypsinisierung) verlässt Trunk NCCs in eine ähnliche Verteilung in vivo-Bedingungen, verkürzt sich die Zeitspanne zwischen Explantation und Experimente (was wahrscheinlich verringert das Risiko der Differenzierung), und ermöglicht Zeitraffer Auswertung zahlreicher wandernden Merkmale.

Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine transiente Zellpopulation in der Entwicklung von Wirbeltieren, die nach ... aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit eines Moleküls zu bewerten, Chemotaxis und andere wanderungsbedingte Reaktionen in ausgelösten Rumpf-Neuralleistzellen hervorzurufen. Dies wird erreicht, indem zunächst Rumpf-Neuralrohre im Bereich von etwa acht bis 15 Somiten Länge isoliert und jedes der Neuralrohre über Nacht auf getrennten, mit Fibronectin beschichteten Deckgläsern kultiviert wird, um die Auswanderung der Neuralleiste zu ermöglichen. Anschließend wird eine optimale Neuralleistkultur ausgewählt.Der Neuralrohr wird aus der Kultur entfernt, und die Deckglasplatte mit der Kultur wird in einer modifizierten Zigmund-Kammer so montiert, dass die geradeste Begrenzung der Kultur parallel zum Vektor des über die Kultur hinweg anzuwendenden molekularen Gradienten verläuft. Der dritte Schritt besteht darin, einen molekularen Gradienten über die Kultur zu erzeugen und anschließend die Migration der peripheren Neuralleistenzellen entlang der zuvor ausgewählten geraden Begrenzung der Kultur aufzuzeichnen. Der letzte Schritt ist die Verfolgung und Analyse der Migration der entlang der ausgewählten Begrenzung der Kultur positionierten peripheren Neuralleistenzellen mithilfe der Image-J-Software.Schließlich kann anhand der Analyse der gewonnenen Daten zur Zelltrajektorie bestimmt werden, ob das ausgewählte Molekül die Zellrichtung oder andere Migrationsmerkmale wie die Geschwindigkeit beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Boyden-Kammer-Assay liegt in den sehr geringen Kosten. Diese Methode kann verwendet werden, um die Migration bereits polarisierter Zellen am Rand primärer Explantkulturen mittels Zeitrafferaufnahmen zu analysieren.Nach einer Inkubation der Hühnereier für 56 Stunden bei 38 Grad Celsius die Eier aus dem Inkubator nehmen, leicht mit 70 %igem Ethanol besprühen und anschließend trocknen lassen, während die Eier trocknen. Eine sterile Kunststoff-Petri-Schale mit Hühner-Ringer-Lösung füllen und ein Glasbrett mit UV-Licht sterilisieren. Eine fünf Zentimeter große Glas-Petri-Schale mit dis displays füllen.Öffnen Sie nun die Eier in die UV-sterilisierte Glaswanne. Entfernen Sie jedes Embryo aus dem Eigelb, indem Sie zuerst mit einer gebogenen Schere um die Blutinseln des Embryos herumschneiden. Heben Sie dann mit stumpfen Pinzetten den Embryo an seiner extraembryonalen Membran auf und legen Sie ihn in die vorbereitete Petrischale, die Ringer-Lösung enthält.Wählen Sie anschließend etwa neun Embryonen aus, die sich zwischen dem Hamburger- und dem Hamilton-Entwicklungsstadium befinden. Schneiden Sie mit einer Wolframnadel bei den Stadien 15 bis 17 alle embryonalen Gewebe anterior zu Somit 10 ab und entfernen Sie alle chordalen embryonalen Gewebe ausgehend vom etwa fünftletzten neu gebildeten Somit. Anschließend werden die extraembryonalen Membranen bis auf etwa zwei Millimeter in der Nähe des Embryos abgetrennt.Legen Sie die isolierten Embryonalr&uuml;mpfe in Dis-B&auml;der und inkubieren Sie sie f&uuml;r eine Stunde und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5&nbsp;% Kohlendioxid, w&auml;hrend die Embryonalr&uuml;mpfe inkubiert werden. Bereiten Sie sechs Deckgl&auml;ser zum Kultivieren vor, indem Sie sie zuerst mit 70&nbsp;%igem Ethanol sp&uuml;len und sie trocknen lassen.Verwenden Sie dann einen Labor-Marker, um in die Mitte jedes Deckgläschens einen etwa einen Zentimeter durchmessenden Kreis zu zeichnen, um später die Fibrin-Verbindungsschicht auf derselben Seite jedes Deckgläschens identifizieren zu können. Schreiben Sie ein asymmetrisches Wort oder Symbol außerhalb des gezeichneten Kreises, um die Identifizierung von Ober- und Unterseite des Deckgläschens zu erleichtern. Legen Sie nun jedes Deckgläschen einzeln in eine sterile Petrischale (40 × 10 mm) mit der beschrifteten Seite nach unten und lassen Sie die Schale 10 Minuten lang geöffnet unter einer keimabtötenden UV-Lampe stehen.Tragen Sie dann 60 Mikroliter Fibronectin auf die nicht markierte Oberfläche des Deckgläschens innerhalb des einen Zentimeter durchmessenden Kreises auf, wobei sichergestellt werden muss, dass der gesamte Bereich des Kreises bedeckt ist. Stellen Sie die Schalen 30 Minuten lang in den Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubationszeit wird das Fibronectin vorsichtig von jedem Deckgläschen abgesaugt.Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter Kulturmedium auf den FI-nin-beschichteten Bereich. Die Deckgläser abdecken und die Deckgläser erneut inkubieren, bis die Neuralrohre isoliert wurden. Während die Deckgläser inkubieren, füllen Sie eine fünf Zentimeter große Glas-Petri-Schale mit L-15-Medium.Überführen Sie nun alle inkubierten Embryorümpfe in die vorbereitete Petrischale. Benutzen Sie feine Pinzetten und eine scharfe Zange sowie eine Nadel, um den Neuralrohr durch vorsichtiges Aufschneiden entlang der Grenze zwischen Neuralrohr und Somiten mit der Nadel zu isolieren. Entfernen Sie die Deckgläser aus dem Inkubator.Wählen Sie sechs der längsten und geradesten Neuralrohre aus und übertragen Sie mithilfe einer mit Kulturmedium angefeuchteten Mikropipettenspitze jeweils ein Neuralrohr auf sechs Deckgläser. Stellen Sie sicher, dass sich jedes Neuralrohr innerhalb des fibronectinbeschichteten Bereichs des jeweiligen Deckglases befindet, und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie anschließend mindestens zwei Milliliter Kulturmedium ohne Serum in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhr.Lassen Sie den Verschluss leicht gelöst, während das Gefäß über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert wird, damit sich der pH-Wert des Mediums anpassen kann. Wählen Sie nach der Übernacht-Kultur die drei besten Neuralleistenzellkulturen aus, die jeweils mindestens eine lange, gerade Kante aufweisen. Wählen Sie eine davon für die Beladung der ersten Kammer aus und stellen Sie die anderen zur späteren Verwendung wieder in den Inkubator zurück.Danach mit Hilfe unseres Wattestäbchens eine dünne, gleichmäßige Schicht Vaseline auf die Bereiche um die Reservoire und die Brücke einer modifizierten Sigmund-Kammer herum auftragen. Anschließend mit einer Wolframnadel vorsichtig den Neuralrohr von dem Deckglas entfernen, das die ausgewählte Neuralleistenzellkultur enthält, wobei die umgebenden Neuralleistenzellen an der Fibronectin-Beschichtung verbleiben. Die Petrischale mit einem Laborstift markieren, um die Orientierung der geradesten Kante der Neuralleistenzellkultur zu dokumentieren.Als Nächstes geben Sie einige Tropfen des vorinkubierten Mediums auf die Brücke der modifizierten Zigmund-Kammer. Heben Sie dann die Deckglaskappe mit feinen Pinzetten auf. Tupfen Sie den Rand der Deckglaskappe an einem Kim-Tuch ab, um den größten Teil des alten Kulturmediums zu entfernen, und setzen Sie die Deckglaskappe unmittelbar auf die modifizierte Zigmund-Kammer, sodass die gerade Grenze der zu filmenden Neuralleistenzellen mittig über der Länge der Brücke und annähernd senkrecht zur Grenze des Brückenreservoirs ausgerichtet ist.Unter Verwendung eines inversen Mikroskops bewegen Sie die gerade Grenze der Neuralleistenzellen auf die Seite der Brücke, die dem Reservoir am nächsten liegt. Dadurch wird der vermutete Chemotakt enthalten sein und die gerade Grenze der Neuralleistenzellen besser senkrecht zur Grenze des Brückenreservoirs ausgerichtet. Drücken Sie nun vorsichtig, aber fest, die Deckglasabdeckung in das auf der Zigmund-Kammer vorhandene Vaseline, und stellen Sie sicher, dass sie vollständig dicht auf der Kammer sitzt.Danach zusätzliches Vaseline entlang der Kante der Deckglasplatte auftragen, um sicherzustellen, dass die Abdichtung luftdicht ist. Den Winkel der Neuralleistenzellgrenze erneut anpassen, um eventuelle Bewegungen während des Deckelprozesses zu korrigieren. Als Nächstes etwa 300 Mikroliter vorgeheiztes Medium in eine Ein-Milliliter-Spritze aufziehen.Mit einer 25-Gauge-1,5-Zoll-Nadel. Injizieren Sie das Medium in das Reservoir, das keinen Chemo-Takt enthalten wird, bis es vollständig gefüllt ist. Achten Sie dabei darauf, keine Blasen im Reservoir zu erzeugen.Danach das Reservoir auf beiden Seiten mit einer ausreichenden Menge Vaseline verschließen, bevor das nächste Reservoir beladen wird. Nun eine zweite Spritze mit 300 µL vorgewärmtem Medium, das den gewünschten Chemotaktor enthält, befüllen. Anschließend das Medium auf dieselbe Weise in das gegenüberliegende Reservoir injizieren.Erneut das Reservoir sorgfältig mit Vaseline abdichten. Nach dem Inkubieren der beladenen Sigmund-Kammer bei 37 Grad Celsius für eine Stunde vor der Aufnahme. Dann während der Inkubation bei etwa 37 Grad Celsius die geradeste Grenze der Neuralleistenzellkultur für drei Stunden in 92-Sekunden-Intervallen für Kontrollen aufnehmen, wobei Zigmund-Kammern mit jeweils den beiden anderen besten Neuralleistenzellkulturen wie gerade gezeigt beladen werden.Verwenden Sie geeignete Kontrollbehandlungen, um die Reservoirs zu füllen und die Brücke zu spülen. Nutzen Sie das manuelle Tracken-Plugin von ImageJ, um die Migration peripherer neuraler Crest-Zellen entlang der geraden Grenze der Kultur zu verfolgen. Analysieren Sie verschiedene Parameter der gewonnenen Migrationsbahnen mithilfe des Chemotaxis- und Migrations-Tool-Plugins.Verlängerte Kulturen trunkaler Neuralleistenzellen wurden durch eine Übernachtkultivierung von Neuralrohren hergestellt, wobei anschließend Kulturen von Neuralleistenzellen mit mindestens einer langen, geraden Begrenzung für Experimente ausgewählt wurden. Die längste gerade Begrenzung einer ausgewählten Kultur wurde dann senkrecht zur Begrenzung des Brückenreservoirs ausgerichtet und damit parallel zum Vektor des zukünftig applizierten Gradienten. Das Reservoir, das nicht den vermuteten Chemoattractant enthielt – hier mit einem Minuszeichen gekennzeichnet –, wurde zuerst befüllt und versiegelt.Danach wurde das andere Reservoir mit dem vermuteten Chemoattractans, dargestellt durch ein Pluszeichen, beladen, und periphere Neuralleistenzellen entlang der zuvor ausgewählten Grenzlinie wurden anschließend mittels des manuellen Tracking-Plugins für ImageJ aufgezeichnet und verfolgt. Zahlreiche migratorische Eigenschaften als Reaktion auf den applizierten Gradienten können anhand der gewonnenen Tracking-Daten bewertet werden, wie anhand dieses Diagramms veranschaulicht. Beispielsweise kann ein Chemotaxis-Index ermittelt werden, indem die Verschiebung einer Zelle entlang der x-Achse durch die gesamte zurückgelegte Distanz dividiert wird. Die attraktive Reaktion aller verfolgten Zellen wird durch das hier gezeigte Zelltrajektorien-Diagramm veranschaulicht.Jede rote Spur stellt die Bahn eines Zells dar, die in Richtung des Reservoirs migrierte, das mit einem vermuteten Chemoattractans beladen war. In dieser Abbildung gibt es deutlich mehr rote Spuren im Vergleich zu schwarzen. In einem weiteren Test wurde die Fähigkeit einer modifizierten Sigmund-Kammer überprüft, einen molekularen Gradienten aufrechtzuerhalten.Ein Alexa Fluor 488-IgM-Konjugat wurde dem linken Reservoir zugesetzt, und die Fluoreszenzintensität über die Brücke hinweg wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Der Gradient blieb mindestens 26 Stunden lang bestehen. Nachdem Sie das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fähigkeit eines Moleküls untersucht, Chemotaxis und andere wanderungsbedingte Verhaltensweisen in ausgelagerten trunkalen Neuralleistenzellkulturen mithilfe eines modifizierten Zigmond-Kammer-Assays zu induzieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Zeitraffer-Aufnahme von 3D-Gewebekultur ermöglicht das Studium Zugverhalten von einzelnen Zellen, die aus ganglionären Eminenz in Reaktion auf fraktionierte Proteinextrakt aus Großhirnrinde.

Zugverhalten von Zellen in ganglionären Eminenz Kulturen Generated

Ein Ansatz zur Analyse von Migration und schließlich das Schicksal der aviären Neuralleistenzellen in Wachtel-Küken chimären Embryos beschrieben wird. Diese Methode ist eine einfache und unkomplizierte Technik zum Aufspüren Neuralleistenzellen während der Migration und Differenzierung, die sonst schwer zu unmanipulierten innerhalb eines Hühnerembryo zu unterscheiden sind.

Die Analyse der Neuralleiste Migration und Differenzierung von Cross-Spezies Transplantation

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der...

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live-   Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Durch die Kombination von Zelltransplantation, Zytoskelettmarkierung und Funktionsverlust/-gewinn beschreibt dieses Protokoll, wie die migrierende Zebrafisch-prospektive prächordale Platte verwendet werden kann, um die Funktion eines Kandidatengens bei der in vivo-Zellmigration zu analysieren.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Dieses Protokoll beschreibt die Zerlegung und Kultur von kranialen neuralen Kammzellen aus Mausmodellen, in erster Linie für die Untersuchung der Zellmigration. Wir beschreiben die verwendeten Live-Bildgebungstechniken und die Analyse von Geschwindigkeits- und Zellformänderungen.

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dieses vielseitige Protokoll beschreibt die Isolierung von primären Neuralleistenzellen (NCCs) durch die Exzision von kranialen Neuralfalten aus Hühnerembryonen. Nach der Beschichtung und Inkubation entstehen wandernde NCCs aus neuronalen Faltenexplantaten, was eine Beurteilung der Zellmorphologie und -migration in einer vereinfachten 2D-Umgebung ermöglicht.

Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.

In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen

Erfahren Sie, wie Sie die Migration von Trunk Neural Crest Zellen mit einem modifizierten Zigmond Chamber Assay analysieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Unterscheidung von Chemotaxis und anderen Migrationsmustern.

Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

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