Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit eines Moleküls zu bewerten, Chemotaxis und andere wanderungsbedingte Reaktionen in ausgelösten Rumpf-Neuralleistzellen hervorzurufen. Dies wird erreicht, indem zunächst Rumpf-Neuralrohre im Bereich von etwa acht bis 15 Somiten Länge isoliert und jedes der Neuralrohre über Nacht auf getrennten, mit Fibronectin beschichteten Deckgläsern kultiviert wird, um die Auswanderung der Neuralleiste zu ermöglichen. Anschließend wird eine optimale Neuralleistkultur ausgewählt.

Der Neuralrohr wird aus der Kultur entfernt, und die Deckglasplatte mit der Kultur wird in einer modifizierten Zigmund-Kammer so montiert, dass die geradeste Begrenzung der Kultur parallel zum Vektor des über die Kultur hinweg anzuwendenden molekularen Gradienten verläuft. Der dritte Schritt besteht darin, einen molekularen Gradienten über die Kultur zu erzeugen und anschließend die Migration der peripheren Neuralleistenzellen entlang der zuvor ausgewählten geraden Begrenzung der Kultur aufzuzeichnen. Der letzte Schritt ist die Verfolgung und Analyse der Migration der entlang der ausgewählten Begrenzung der Kultur positionierten peripheren Neuralleistenzellen mithilfe der Image-J-Software.

Schließlich kann anhand der Analyse der gewonnenen Daten zur Zelltrajektorie bestimmt werden, ob das ausgewählte Molekül die Zellrichtung oder andere Migrationsmerkmale wie die Geschwindigkeit beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Boyden-Kammer-Assay liegt in den sehr geringen Kosten. Diese Methode kann verwendet werden, um die Migration bereits polarisierter Zellen am Rand primärer Explantkulturen mittels Zeitrafferaufnahmen zu analysieren.

Nach einer Inkubation der Hühnereier für 56 Stunden bei 38 Grad Celsius die Eier aus dem Inkubator nehmen, leicht mit 70 %igem Ethanol besprühen und anschließend trocknen lassen, während die Eier trocknen. Eine sterile Kunststoff-Petri-Schale mit Hühner-Ringer-Lösung füllen und ein Glasbrett mit UV-Licht sterilisieren. Eine fünf Zentimeter große Glas-Petri-Schale mit dis displays füllen.

Öffnen Sie nun die Eier in die UV-sterilisierte Glaswanne. Entfernen Sie jedes Embryo aus dem Eigelb, indem Sie zuerst mit einer gebogenen Schere um die Blutinseln des Embryos herumschneiden. Heben Sie dann mit stumpfen Pinzetten den Embryo an seiner extraembryonalen Membran auf und legen Sie ihn in die vorbereitete Petrischale, die Ringer-Lösung enthält.

Wählen Sie anschließend etwa neun Embryonen aus, die sich zwischen dem Hamburger- und dem Hamilton-Entwicklungsstadium befinden. Schneiden Sie mit einer Wolframnadel bei den Stadien 15 bis 17 alle embryonalen Gewebe anterior zu Somit 10 ab und entfernen Sie alle chordalen embryonalen Gewebe ausgehend vom etwa fünftletzten neu gebildeten Somit. Anschließend werden die extraembryonalen Membranen bis auf etwa zwei Millimeter in der Nähe des Embryos abgetrennt.

Legen Sie die isolierten Embryonalrümpfe in Dis-Bäder und inkubieren Sie sie für eine Stunde und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, während die Embryonalrümpfe inkubiert werden. Bereiten Sie sechs Deckgläser zum Kultivieren vor, indem Sie sie zuerst mit 70 %igem Ethanol spülen und sie trocknen lassen.

Verwenden Sie dann einen Labor-Marker, um in die Mitte jedes Deckgläschens einen etwa einen Zentimeter durchmessenden Kreis zu zeichnen, um später die Fibrin-Verbindungsschicht auf derselben Seite jedes Deckgläschens identifizieren zu können. Schreiben Sie ein asymmetrisches Wort oder Symbol außerhalb des gezeichneten Kreises, um die Identifizierung von Ober- und Unterseite des Deckgläschens zu erleichtern. Legen Sie nun jedes Deckgläschen einzeln in eine sterile Petrischale (40 × 10 mm) mit der beschrifteten Seite nach unten und lassen Sie die Schale 10 Minuten lang geöffnet unter einer keimabtötenden UV-Lampe stehen.

Tragen Sie dann 60 Mikroliter Fibronectin auf die nicht markierte Oberfläche des Deckgläschens innerhalb des einen Zentimeter durchmessenden Kreises auf, wobei sichergestellt werden muss, dass der gesamte Bereich des Kreises bedeckt ist. Stellen Sie die Schalen 30 Minuten lang in den Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubationszeit wird das Fibronectin vorsichtig von jedem Deckgläschen abgesaugt.

Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter Kulturmedium auf den FI-nin-beschichteten Bereich. Die Deckgläser abdecken und die Deckgläser erneut inkubieren, bis die Neuralrohre isoliert wurden. Während die Deckgläser inkubieren, füllen Sie eine fünf Zentimeter große Glas-Petri-Schale mit L-15-Medium.

Überführen Sie nun alle inkubierten Embryorümpfe in die vorbereitete Petrischale. Benutzen Sie feine Pinzetten und eine scharfe Zange sowie eine Nadel, um den Neuralrohr durch vorsichtiges Aufschneiden entlang der Grenze zwischen Neuralrohr und Somiten mit der Nadel zu isolieren. Entfernen Sie die Deckgläser aus dem Inkubator.

Wählen Sie sechs der längsten und geradesten Neuralrohre aus und übertragen Sie mithilfe einer mit Kulturmedium angefeuchteten Mikropipettenspitze jeweils ein Neuralrohr auf sechs Deckgläser. Stellen Sie sicher, dass sich jedes Neuralrohr innerhalb des fibronectinbeschichteten Bereichs des jeweiligen Deckglases befindet, und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie anschließend mindestens zwei Milliliter Kulturmedium ohne Serum in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhr.

Lassen Sie den Verschluss leicht gelöst, während das Gefäß über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert wird, damit sich der pH-Wert des Mediums anpassen kann. Wählen Sie nach der Übernacht-Kultur die drei besten Neuralleistenzellkulturen aus, die jeweils mindestens eine lange, gerade Kante aufweisen. Wählen Sie eine davon für die Beladung der ersten Kammer aus und stellen Sie die anderen zur späteren Verwendung wieder in den Inkubator zurück.

Danach mit Hilfe unseres Wattestäbchens eine dünne, gleichmäßige Schicht Vaseline auf die Bereiche um die Reservoire und die Brücke einer modifizierten Sigmund-Kammer herum auftragen. Anschließend mit einer Wolframnadel vorsichtig den Neuralrohr von dem Deckglas entfernen, das die ausgewählte Neuralleistenzellkultur enthält, wobei die umgebenden Neuralleistenzellen an der Fibronectin-Beschichtung verbleiben. Die Petrischale mit einem Laborstift markieren, um die Orientierung der geradesten Kante der Neuralleistenzellkultur zu dokumentieren.

Als Nächstes geben Sie einige Tropfen des vorinkubierten Mediums auf die Brücke der modifizierten Zigmund-Kammer. Heben Sie dann die Deckglaskappe mit feinen Pinzetten auf. Tupfen Sie den Rand der Deckglaskappe an einem Kim-Tuch ab, um den größten Teil des alten Kulturmediums zu entfernen, und setzen Sie die Deckglaskappe unmittelbar auf die modifizierte Zigmund-Kammer, sodass die gerade Grenze der zu filmenden Neuralleistenzellen mittig über der Länge der Brücke und annähernd senkrecht zur Grenze des Brückenreservoirs ausgerichtet ist.

Unter Verwendung eines inversen Mikroskops bewegen Sie die gerade Grenze der Neuralleistenzellen auf die Seite der Brücke, die dem Reservoir am nächsten liegt. Dadurch wird der vermutete Chemotakt enthalten sein und die gerade Grenze der Neuralleistenzellen besser senkrecht zur Grenze des Brückenreservoirs ausgerichtet. Drücken Sie nun vorsichtig, aber fest, die Deckglasabdeckung in das auf der Zigmund-Kammer vorhandene Vaseline, und stellen Sie sicher, dass sie vollständig dicht auf der Kammer sitzt.

Danach zusätzliches Vaseline entlang der Kante der Deckglasplatte auftragen, um sicherzustellen, dass die Abdichtung luftdicht ist. Den Winkel der Neuralleistenzellgrenze erneut anpassen, um eventuelle Bewegungen während des Deckelprozesses zu korrigieren. Als Nächstes etwa 300 Mikroliter vorgeheiztes Medium in eine Ein-Milliliter-Spritze aufziehen.

Mit einer 25-Gauge-1,5-Zoll-Nadel. Injizieren Sie das Medium in das Reservoir, das keinen Chemo-Takt enthalten wird, bis es vollständig gefüllt ist. Achten Sie dabei darauf, keine Blasen im Reservoir zu erzeugen.

Danach das Reservoir auf beiden Seiten mit einer ausreichenden Menge Vaseline verschließen, bevor das nächste Reservoir beladen wird. Nun eine zweite Spritze mit 300 µL vorgewärmtem Medium, das den gewünschten Chemotaktor enthält, befüllen. Anschließend das Medium auf dieselbe Weise in das gegenüberliegende Reservoir injizieren.

Erneut das Reservoir sorgfältig mit Vaseline abdichten. Nach dem Inkubieren der beladenen Sigmund-Kammer bei 37 Grad Celsius für eine Stunde vor der Aufnahme. Dann während der Inkubation bei etwa 37 Grad Celsius die geradeste Grenze der Neuralleistenzellkultur für drei Stunden in 92-Sekunden-Intervallen für Kontrollen aufnehmen, wobei Zigmund-Kammern mit jeweils den beiden anderen besten Neuralleistenzellkulturen wie gerade gezeigt beladen werden.

Verwenden Sie geeignete Kontrollbehandlungen, um die Reservoirs zu füllen und die Brücke zu spülen. Nutzen Sie das manuelle Tracken-Plugin von ImageJ, um die Migration peripherer neuraler Crest-Zellen entlang der geraden Grenze der Kultur zu verfolgen. Analysieren Sie verschiedene Parameter der gewonnenen Migrationsbahnen mithilfe des Chemotaxis- und Migrations-Tool-Plugins.

Verlängerte Kulturen trunkaler Neuralleistenzellen wurden durch eine Übernachtkultivierung von Neuralrohren hergestellt, wobei anschließend Kulturen von Neuralleistenzellen mit mindestens einer langen, geraden Begrenzung für Experimente ausgewählt wurden. Die längste gerade Begrenzung einer ausgewählten Kultur wurde dann senkrecht zur Begrenzung des Brückenreservoirs ausgerichtet und damit parallel zum Vektor des zukünftig applizierten Gradienten. Das Reservoir, das nicht den vermuteten Chemoattractant enthielt – hier mit einem Minuszeichen gekennzeichnet –, wurde zuerst befüllt und versiegelt.

Danach wurde das andere Reservoir mit dem vermuteten Chemoattractans, dargestellt durch ein Pluszeichen, beladen, und periphere Neuralleistenzellen entlang der zuvor ausgewählten Grenzlinie wurden anschließend mittels des manuellen Tracking-Plugins für ImageJ aufgezeichnet und verfolgt. Zahlreiche migratorische Eigenschaften als Reaktion auf den applizierten Gradienten können anhand der gewonnenen Tracking-Daten bewertet werden, wie anhand dieses Diagramms veranschaulicht. Beispielsweise kann ein Chemotaxis-Index ermittelt werden, indem die Verschiebung einer Zelle entlang der x-Achse durch die gesamte zurückgelegte Distanz dividiert wird. Die attraktive Reaktion aller verfolgten Zellen wird durch das hier gezeigte Zelltrajektorien-Diagramm veranschaulicht.

Jede rote Spur stellt die Bahn eines Zells dar, die in Richtung des Reservoirs migrierte, das mit einem vermuteten Chemoattractans beladen war. In dieser Abbildung gibt es deutlich mehr rote Spuren im Vergleich zu schwarzen. In einem weiteren Test wurde die Fähigkeit einer modifizierten Sigmund-Kammer überprüft, einen molekularen Gradienten aufrechtzuerhalten.

Ein Alexa Fluor 488-IgM-Konjugat wurde dem linken Reservoir zugesetzt, und die Fluoreszenzintensität über die Brücke hinweg wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Der Gradient blieb mindestens 26 Stunden lang bestehen. Nachdem Sie das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fähigkeit eines Moleküls untersucht, Chemotaxis und andere wanderungsbedingte Verhaltensweisen in ausgelagerten trunkalen Neuralleistenzellkulturen mithilfe eines modifizierten Zigmond-Kammer-Assays zu induzieren.