Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit eines Moleküls zu bewerten, Chemotaxis und andere Migrationsreaktionen in explantierten Neuralleistenzellen des Stammes auszulösen. Dies wird erreicht, indem zunächst Neuralrohre auf Stammebene mit einer Länge von etwa acht bis 15 Somiten isoliert und jedes der Neuralrohre über Nacht auf separaten, mit Fibronektin beschichteten Deckgläsern kultiviert wird, um die Auswanderung der Neuralleiste zu ermöglichen. Als nächstes wird eine optimale Neuralleistenkultur ausgewählt.

Das Neuralrohr wird aus der Kultur entfernt und das Deckglas, das die Kultur enthält, wird auf eine modifizierte Zickmundkammer montiert, so dass der geradeste Rand der Kultur parallel zum Vektor des molekularen Gradienten verläuft, der auf die Kultur angewendet werden soll. Der dritte Schritt besteht darin, einen molekularen Gradienten über die Kultur zu erzeugen und dann die Wanderung der peripheren Neuralleistenzellen entlang des zuvor ausgewählten geraden Randes der Kultur zu filmen. Der letzte Schritt besteht darin, die Migration der peripheren Neuralleistenzellen, die entlang des ausgewählten Randes der Kultur positioniert sind, mit der Image J-Software zu verfolgen und zu analysieren.

Letztendlich kann durch die Analyse der erhaltenen Zelltrajektoriendaten bestimmt werden, ob das ausgewählte Molekül die Zellrichtung oder andere Migrationseigenschaften wie die Geschwindigkeit verändern kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie dem Boyden-Kammer-Assay besteht darin, dass sie zu sehr geringen Kosten arbeitet. Mit dieser Methode kann die Migration von bereits polarisierten Zellen an der Peripherie von primären Explankulturen mittels Zeitraffer-Imaging analysiert werden.

Kükeneier 56 Stunden lang bei 38 Grad Celsius inkubiert haben, nehmen Sie die Eier aus dem Brutkasten, besprühen Sie sie leicht mit 70 % Ethanol und lassen Sie die Eier trocknen, während die Eier trocknen. Füllen Sie eine sterile Petrischale aus Kunststoff mit Chick Ringer-Lösung und sterilisieren Sie eine Glasschale mit UV. Füllen Sie eine fünf Zentimeter große Petrischale aus Glas mit Displays.

Brechen Sie nun die Eier in die UV-sterilisierte Glasschale auf. Extrahieren Sie jeden Embryo aus seinem Eigelb, indem Sie zuerst mit einer gebogenen Schere um die Blutinseln des Embryos herum schneiden. Nehmen Sie dann mit einer stumpfen Pinzette den Embryo an seiner zusätzlichen Embryonalmembran auf und legen Sie den Embryo in die vorbereitete Petrischale mit den Ringern.

Wählen Sie als Nächstes etwa neun Embryonen aus, die sich zwischen Hamburger und Hamilton befinden. In den Stadien 15 bis 17 wird mit einer Wolframnadel das embryonale Gewebe vor der Milbe 10 abgeschnitten und das gesamte embryonale Gewebe entfernt, beginnend mit etwa der fünfthäufigsten neu gebildeten Milbe. Schneiden Sie dann die zusätzlichen embryonalen Membranen bis zu einem Abstand von etwa zwei Millimetern vom Embryo ab.

Legen Sie die isolierten Embryostämme in die Röhren und inkubieren Sie sie eine Stunde und 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, während die Embryostämme inkubiert werden. Bereiten Sie sechs Deckgläser für die Kultivierung vor. Zuerst werden sie in 70%igem Ethanol gespült und trocknen gelassen.

Zeichnen Sie dann mit einem Labormarker einen Kreis in der Mitte jedes Deckglases mit einem Durchmesser von etwa einem Zentimeter, um später die Fibrin-Verbindungsschicht auf der gleichen Seite jedes Deckblatts zu identifizieren. Schreiben Sie ein asymmetrisches Wort oder Symbol außerhalb des gezeichneten Kreises, um die Identifizierung der Ober- und Unterseite des Deckglases zu erleichtern. Legen Sie nun jeden Deckglas mit der beschrifteten Seite nach unten in eine separate 40 x 10 Millimeter große sterile Schale und lassen Sie die Schale 10 Minuten lang offen unter einer keimtötenden UV-Lampe stehen.

Tragen Sie dann 60 Mikroliter Fibronektin in die unmarkierte Oberfläche des Deckglases innerhalb des einen Zentimeter großen Kreises auf und achten Sie darauf, dass der gesamte Bereich des Kreises beschichtet ist. Stellen Sie die Gerichte für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Nach der Inkubationszeit wird das Finin vorsichtig von jedem Deckglas abgesaugt.

Geben Sie anschließend 250 Mikroliter Nährmedium in den mit FI Nin beschichteten Bereich. Das Deckglas und dann die Deckgläser erneut inkubieren, bis die Neuralrohre isoliert wurden. Während die Deckgläser inkubiert werden, füllen Sie eine fünf Zentimeter große Petrischale aus Glas mit L 15 Medium.

Übertragen Sie nun alle inkubierten Embryostämme in die vorbereitete Petrischale. Verwenden Sie eine feine Pinzette und eine scharfe Zunge und Nadel, um das Neuralrohr zu präparieren, indem Sie mit der Nadel vorsichtig entlang des Randes des Neuralrohrs und der Somiten schneiden. Entfernen Sie die Deckgläser aus dem Inkubator.

Wählen Sie sechs der längsten und geradesten Neuralrohre aus und übertragen Sie dann mit einer mit Kulturmedium grundierten Mikropipettenspitze ein Neuralrohr auf jedes der sechs Deckgläser. Stellen Sie mit einer Mikropipette sicher, dass sich jedes Neuralrohr innerhalb des mit Fibronektin beschichteten Bereichs des jeweiligen Deckglases befindet, und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie anschließend mindestens zwei Milliliter Nährmedium ohne Serum in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Lassen Sie das Kalb leicht abgeschraubt, während Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren, damit sich der pH-Wert des Mediums anpassen kann. Wählen Sie nach der Übernachtkultur die drei besten Neuralleisten-Zellkulturen aus, die mindestens eine lange gerade Kante aus den drei Kulturen aufweisen. Wählen Sie eine für die Beladung der ersten Kammer und stellen Sie die anderen zur späteren Verwendung in den Inkubator zurück.

Tragen Sie dann mit unserem Wattestäbchen eine dünne, gleichmäßige Schicht Vaseline auf die Bereiche um die Reservoirs und die Brücke einer modifizierten Sigmund-Kammer auf. Entfernen Sie anschließend mit einer Wolframnadel vorsichtig das Neuralrohr von dem Deckglas, das die ausgewählte Neuralleisten-Zellkultur enthält, und lassen Sie die umgebenden Neuralleistenzellen an der Fibronektinhülle befestigt. Markieren Sie die Schale mit einem Labormarker, um sich die Ausrichtung des geradesten Randes der Neuralleisten-Zellkultur zu merken.

Geben Sie anschließend einige Tropfen des vorinkubierten Mediums auf den Steg der modifizierten Zigmund-Kammer. Nehmen Sie dann das Deckglas mit einer feinen Pinzette auf. Tupfen Sie die Kante des Deckblatts gegen ein Kim-Tuch, um den größten Teil des alten Nährmediums zu entfernen, und legen Sie das Deckglas sofort so auf die modifizierte Zickmund-Kammer, dass der gerade Zellrand der Neuralleiste, der gefilmt werden soll, über die Länge der Brücke zentriert und ungefähr senkrecht zum Rand des Brückenreservoirs verläuft.

Verschieben Sie mit einem inversen Mikroskop den geraden Zellrand der Neuralleiste auf die Seite der Brücke, die dem Reservoir am nächsten liegt. Dadurch wird der vermutete Chemotakt eingedämmt und die gerade Zellgrenze des Neurokamms senkrecht zur Grenze des Brückenreservoirs feiner ausgerichtet. Drücken Sie nun vorsichtig, aber sicher auf den Deckel, schlüpfen Sie in die Vaseline in der Zickmundkammer und stellen Sie sicher, dass sie vollständig auf der Kammer versiegelt ist.

Geben Sie dann zusätzliche Vaseline entlang der Kante des Deckglases, um sicherzustellen, dass es luftdicht ist. Passen Sie den Winkel des Zellenrahmens der Neuralleiste erneut an, um Bewegungen während des Deckenprozesses zu korrigieren. Als nächstes füllen Sie etwa 300 Mikroliter vorinkubiertes Medium in eine Ein-Milliliter-Spritze.

Mit einer 25 Gauge x 1,5 Zoll großen Nadel. Injiziere das Medium in das Reservoir, das keine Chemotherapie enthält, bis es voll ist. Achten Sie darauf, keine Blasen im Behälter zu erzeugen.

Verschließen Sie dann den Behälter auf beiden Seiten mit einer ausreichenden Menge Vaseline, bevor Sie den nächsten Behälter befüllen. Beladen Sie nun eine zweite Spritze mit 300 Mikrolitern vorinkubiertem Medium, das den gewünschten Chemotakt enthält. Dann injizieren Sie das Medium auf die gleiche Weise in den gegenüberliegenden Behälter.

Verschließen Sie den Behälter erneut vorsichtig mit Vaseline. Nach der Inkubation wird die beladene Sigmund-Kammer eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius vor den Dreharbeiten inkubiert. Während der Inkubation bei einem Bild von etwa 37 Grad Celsius wurde der geradeste Rand der Neuralleisten-Zellkultur drei Stunden lang im 92. Intervall für die Kontrollen geladen, und es wurden Zickmund-Kammern geladen, die jeweils eine der beiden anderen besten Neuralleisten-Zellkulturen enthielten, wie gerade gezeigt.

Verwendung der entsprechenden Kontrollbehandlungen zum Befüllen der Reservoirs und zum Grundieren der Brücke. Verwenden Sie das manuelle trackin-Plugin image J, um die Migration von peripheren Neuralleistenzellen entlang des geraden Randes der Kultur zu verfolgen. Verwenden Sie das Plugin für das Chemotaxis- und Migrationstool, um verschiedene Parameter der erhaltenen Migrationstrajektorien zu analysieren.

Längliche Stamm-Neuralleisten-Zellkulturen wurden durch Kultivierung von Neuralrohren über Nacht präpariert und die resultierenden Neuralleisten-Zellkulturen mit mindestens einem langen geraden Rand wurden für die Experimente ausgewählt. Die längste gerade Grenze einer ausgewählten Kultur wurde dann senkrecht zur Grenze des Brückenreservoirs und damit parallel zum Vektor des künftig angewendeten Gradienten positioniert. Das Reservoir, das den hier mit einem Minuszeichen dargestellten vermuteten Chemolockstoff nicht enthielt, wurde zuerst beladen und verschlossen.

Dann wurde das andere Reservoir mit dem vermuteten Chemo-Lockstoff beladen, der mit einem Pluszeichen dargestellt wurde, und versiegelte periphere Neuralleistenzellen entlang der zuvor ausgewählten Grenze wurden dann abgebildet und mit dem manuellen Tracking-Plugin für Bild J verfolgt. Zahlreiche Migrationsmerkmale als Reaktion auf den angewendeten Gradienten können auf der Grundlage der erhaltenen Tracking-Daten bewertet werden, wie in diesem Diagramm dargestellt. Zum Beispiel kann ein Chemotaxis-Index abgeleitet werden, indem die Verschiebung einer Zelle entlang der x-Achse durch die Gesamtstrecke dividiert wird, die sie gewandert ist. Die attraktive Reaktion aller verfolgten Zellen wird durch das hier gezeigte Diagramm der Zelltrajektorie demonstriert.

Jede rote Spur ist die Flugbahn einer Zelle, die in Richtung des Reservoirs gewandert ist, das mit einem vermuteten Chemolockstoff beladen ist. In dieser Abbildung ist die Anzahl der roten Spuren wesentlich größer als die schwarze. In einem weiteren Test wurde die Fähigkeit einer modifizierten Sigmund-Kammer validiert, einen molekularen Gradienten aufrechtzuerhalten.

Ein Alexa Fluor 4 88 IGM-Konjugat wurde in das linke Reservoir gegeben und die Fluoreszenzintensität über die Brücke zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Der Gradient blieb mindestens 26 Stunden lang bestehen Nach dem Ansehen des Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fähigkeit eines Moleküls analysieren können, Chemotaxis und andere Migrationsverhaltensweisen in explantierten Stamm-Neuralleisten-Zellkulturen mit einem modifizierten Zickmund-Kammer-Assay auszulösen.