Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache Möglichkeit zu bieten, die Auswirkungen von chemotaktischen und chemopulsiven Wirkstoffen auf die Zellmigration zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen der Zellinteraktion zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen verschiedener Wachstumsfaktoren auf die Wundheilung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie leicht an verschiedene Anwendungen anpassbar und für Forscher aller Qualifikationsstufen einfach zu bedienen ist.

Aniqa Chowdhury, eine Studentin, und Tyler Harvey, ein Doktorand aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Erstellen Sie zunächst eine CAD-Datei mit der gewünschten Form des Mikrokanals. Passen Sie die Breite und Länge des Kanals an, um den gewünschten Gradienten zu erreichen.

Hier werden 2,254 Zentimeter große Quadrate durch einen 0,127 Zentimeter breiten Kanal verbunden. Besorgen Sie sich als Nächstes ein Stück Acryl in der gewünschten Dicke, um die richtige Tiefe des Mikrokanals zu erzeugen. Eine Acrylplattenbreite von etwa einem Sechzehntel Zoll ist ideal, da dickere Platten schwer zu schneiden sind und sehr dünne Platten während des Prozesses brechen oder sich verziehen können.

Importieren Sie die CAD-Datei in ein Laserschneidgerät und platzieren Sie das Acrylstück auf der Schnittfläche. Schneiden Sie dann die Kammer gemäß dem Protokoll des Herstellers aus. Legen Sie den frisch geschnittenen hantelförmigen Acrylausschnitt in eine kleine Petrischale und decken Sie ihn ab, bis er benötigt wird.

In eine Waage zehn Teile einer Elastomerbasis mit einem Teil des Härters geben und mit einer Mikropipette fünf Minuten lang umrühren. Übertragen Sie die Mischung in eine Vakuumkammer und ziehen Sie ein Vakuum für 30 Minuten, um alle eingeschlossenen Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie das Vakuum aus und entfernen Sie das Wägeschiffchen.

Gießen Sie das entgaste PDMS auf einen hantelförmigen Acrylausschnitt in einer kleinen Petrischale. Stellen Sie sicher, dass das PDMS die Einlage vollständig abdeckt. Lassen Sie das PDMS mindestens 18 Stunden bei Raumtemperatur aushärten, schneiden Sie dann das PDMS vorsichtig mit einem Skalpell um das Acrylstück herum und entfernen Sie den Einsatz.

Stellen Sie die Mikrokanalkammer in einem Standard-Zellkulturschrank mit der Vorderseite nach oben in eine Petrischale und bedecken Sie sie vollständig mit 70 % Ethanol. Schließen Sie dann die Motorhaube und schalten Sie das UV-Licht ein. Setzen Sie die Kammer ein bis zwei Stunden lang UV-Licht aus.

Öffnen Sie nach der Belichtung die Laminarströmungshaube und warten Sie 15 Minuten, bis die Strömungshaube die Strömung wieder hergestellt hat. Entfernen Sie anschließend das 70%ige Ethanol und waschen Sie die Kammern zweimal mit sterilem PBS. Verwenden Sie einen Milliliter PBS für jede Wäsche.

Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das PBS und lassen Sie die Kammern über Nacht bei abgenommenen Deckeln trocknen. Ernten Sie den zu testenden Zelltyp und geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension zu 400 Mikrolitern des 0,4%igen Trypanblaus und mischen Sie vorsichtig. Tragen Sie 100 Mikroliter dieser Lösung auf das Hämozytometer auf, indem Sie beide Kammern vorsichtig unter dem Glasabdeckglas füllen.

Verwenden Sie ein Mikroskop mit einem 10-fach-Objektiv, um auf das Gitter auf dem Hämozytometer zu fokussieren. Verwenden Sie dann einen Handzählzähler, um die lebenden, nicht erhaltenen Zellen innerhalb aller vier Sätze von 16 Quadraten auf dem Hämozytometer zu zählen. Teilen Sie die Gesamtzellzahl durch vier und multiplizieren Sie diese Zahl mit 50.000, um die Anzahl der Zellen pro Milliliter Zellsuspension zu erhalten.

Geben Sie auf der Grundlage dieser Berechnung 2500 Zellen und 100 Mikroliter Medium in eine Vertiefung in jeder Kammer. Lassen Sie die Zellen 60 Minuten in der Kammer ruhen und fügen Sie dann zusätzliches Medium hinzu. Geben Sie zunächst Agarose in Wasser und erhitzen Sie die Lösung eine Minute lang in der Mikrowelle oder bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat und die Lösung klar ist.

Lassen Sie die Lösung 15 bis 30 Sekunden abkühlen, bevor Sie sie in eine Petrischale gießen. Um Blasen zu entfernen, stellen Sie die Petrischale in eine Vakuumkammer und lassen Sie die Agarose 30 Minuten lang unter Vakuum erstarren. Sobald es erstarrt ist, schneide einen zwei Millimeter mal zwei Millimeter mal zwei Millimeter großen Würfel Agarose mit einem Skalpell aus der Petrischale.

Tauchen Sie den Würfel vollständig in eine Lösung, die die gewünschte Konzentration des Chemo-Taktik-Faktors enthält, und weichen Sie den Agaroseblock über Nacht bei Raumtemperatur ein. Platzieren Sie als Nächstes den Agaroseblock mit dem Chemotaktikfaktor am anderen Ende der Mikrokanalkammer. Verwenden Sie einen Marker, z. B. Polystyrol-Mikrokügelchen oder einen mikroskopischen Defekt in der Kammer.

Um die relative Startposition der Zellen zu identifizieren. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um 12 Stunden lang stündlich Zeitrafferbilder der sich bewegenden Zellfront aufzunehmen. Die hier gezeigte Bildserie dokumentiert die Bewegung einer Zellfront über den Kanal als Reaktion auf einen Gradienten von fötalem Rinderserum, das am gegenüberliegenden Ende des Kanals platziert wurde.

Die Migrationsdistanz wurde anhand des Abstands der Wachstumsfront von einem mikroskopischen Defekt im Gerät gemessen. Aus diesen Messungen ergab sich, dass die durchschnittliche Geschwindigkeit der Zellfront 13,4 Mikrometer pro Stunde beträgt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in vier Stunden abgeschlossen werden, mit einer zusätzlichen Wartezeit von 18 Stunden, bis PDMS ausgehärtet ist, und weiteren 12 Stunden für die Zeitrafferbildgebung.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher unterschiedlicher Qualifikationsstufen, einschließlich Studenten mit wenig Laborerfahrung, um die Wundheilung und Zellmigration in vitro einfach zu erforschen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Acryleinsatz vorsichtig aus der PDMS-Form zu entfernen, um eine erfolgreiche Produktion einer Mikrokanalkammer zu gewährleisten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine einfache Mikrokanalkammer herstellt, um die Zellmigration als Reaktion auf verschiedene chemische Signale zu untersuchen.

Nach diesem Verfahren können andere Hinweise untersucht werden, wie z. B. mehrere lösliche chemische Gradienten, Substrate, Flüssigkeitsscheren und elektrische Felder, um ihre Wirkung auf die Zellmigration zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Laserschneidern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. eine angemessene Schulung und die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung.