Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Ziel dieses Verfahrens ist es, das Verhalten der kranialen Meen-Glockenspielkultur zu überwachen. Unter definierten Kulturbedingungen. Der erste Schritt besteht darin, die Gebärmutterhörner einer zeitlich begrenzten trächtigen Maus zu entnehmen.

8,5 Tage nach Coum. Nach der Isolierung werden die Embryonen aus dem Laubbaum entnommen und der Dottersack für die Genotypisierung entnommen. Als nächstes werden die kranialen Mechy-Pflanzen und Mikrodiseziert und auf mit extrazellulärer Matrix beschichtete Gewebekulturplatten übertragen.

X-Explantate dürfen sich anheften und werden bis zu 48 Stunden lang in Gegenwart oder Abwesenheit definierter pharmakologischer Wirkstoffe kultiviert. Letztendlich werden Bilder von Explan gemacht, um Unterschiede in der Zellmigration zu zeigen. Diese Methode ist nützlich, um Schlüsselfragen zu beantworten, wie z.B. welche Signalwege und extrazellulären Matrixproteine beteiligt sind, und um das Verhalten der Cran using kind während der Neurofaltenerhöhung zu kontrollieren.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Mikrodissektion schwer zu erlernen sind und Geduld und Übung erfordern, um sie zu beherrschen. Um zu beginnen, wenn Immunhistochemie durchgeführt wird, bereiten Sie Deckgläser vor, andernfalls überspringen Sie diesen Schritt und beschichten Sie Gewebekulturplatten direkt mit ECM-sterilisierten 12 Millimeter kreisförmigen Glasdeckgläsern, indem Sie sie in Ethanol tauchen. Lassen Sie sie an der Luft trocknen. Legen Sie als Nächstes einen sterilisierten Deckeinschub in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.

Arbeiten in einer Laina-Haube mit einem Milliliter extrazellulärer Matrix oder ECM, um die Deckgläser oder den Boden einer Gewebekulturplatte zu beschichten. Inkubieren Sie die Platte nach der Inkubation drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, saugen Sie die ECM-Lösung ab und waschen Sie sie dreimal in PBS. Zu diesem Zeitpunkt können beschichtete Platten sofort verwendet oder eingewickelt und bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Ade bei der Visualisierung des durchscheinenden Embryos. Es werden Syl Schutzbleche mit widerstandsfähigem schwarzem Hintergrund vorbereitet. Befolgen Sie das Protokoll des Herstellers.

Bereiten Sie die Präparierwerkzeuge vor, indem Sie einen winzigen Stift in einen Stifthalter einführen. Verwenden Sie einen Schleifblock, um die Pinzette zu schärfen, wenn alles vorbereitet ist. Entnehmen Sie die Gebärmutter einer zeitgesteuerten trächtigen Maus, die 8,5 Tage nach dem Zitat ist.

Legen Sie die isolierte Gebärmutter in eine Schüssel mit sterilem PBS und waschen Sie sie. Sobald Sie sich unter einem Präpariermikroskop befinden, trennen Sie die einzelnen Laubabfälle mit einer Schere mit Pinzette. Entfernen Sie das Bindegewebe der Gebärmutter mit einer reißenden Bewegung, wobei Sie darauf achten sollten, keinen Druck zu erzeugen und den Embryo aus dem Dezidua zu lösen.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gebärmuttergewebe auf der der Plazenta gegenüberliegenden Seite vorsichtig zu zerreißen. Um den im Dottersack eingeschlossenen Embryo freizulegen, kneifen Sie den Embryo und den Dottersack mit der Pinzette aus der Plazenta und entfernen Sie das Gebärmuttergewebe aus der Schale. Als nächstes entfernst du mit einer Pinzette vorsichtig den Dottersack vom Embryo

Legen Sie den Dottersack zur Genotypisierung mit einer Pipette in ein Eppendorf-Röhrchen, und stufen Sie den Embryo nach der Isolierung durch Zählen der Somiten ein. Im Idealfall befindet sich der Embryo zwischen sechs und zehn, ebenso wie die Stadien. Zu diesem Zeitpunkt beginnen sich die neuralen Falten gerade erst zu erheben und eine größere Morphogenese des kranialen Mesenchyms hat noch nicht stattgefunden.

Sobald das Stadium bestimmt wurde, wird der Embryo auf eine schwarze Zellschutzplatte übertragen, die DMEM ohne Phenolrot enthält. Zuerst unter einem Präpariermikroskop mit der höchstmöglichen Vergrößerung auf den Kopf des Embryos mit einer Präpariernadel in jeder Hand fokussieren, den Kopf vor dem rmba meres präparieren. Schneiden Sie dann entlang der Mittellinie bis zum Bi.

Präpariere den Kopf in zwei gleiche Hälften mit einer Seziernadel in jeder Hand. Präparieren Sie die äußeren Fransen entlang des Randes des Embryokopfes und der Mittellinie. Entfernen Sie die erforderlichen A's, um eine Verwechslung des gewünschten Plans mit unerwünschtem Gewebe zu vermeiden.

Explan enthält die migrierende kraniale Neuralleiste, das parale Mesoderm und das Oberflächenektoderm, um lose anhaftende Zellen zu entfernen. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf und ab. Und bei Pepin nehmen Sie den Explan vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf.

In ca. 10 Mikroliter DMEM in der Mitte einer beschichteten Gewebekultur platzieren, gut bei 20 Mikrolitern warmem DMEM ergänzt mit 15%FBS, kann die Kulturschale nun in einen Gewebekultur-Inkubator überführt werden. Nach etwa ein bis zwei Stunden wird der Explan angebracht und es können weitere 250 Mikroliter Medium hinzugefügt werden. Nach ca. 24 Stunden ist der Explan fest mit dem Deckglas verbunden.

Zu diesem Zeitpunkt können pharmakologische Wirkstoffe nach weiteren 24 Stunden in das Medium gegeben werden, die Zellen wandern aus dem Medium aus. Bilder werden in der Regel aufgenommen, um den Abstand und die Anzahl der Zellen zu dokumentieren, die von diesen Zellen wandern. Zu diesem Zeitpunkt zeigen die Seitdem Anzeichen einer verminderten Lebensfähigkeit, wobei längere Inkubationen beobachtet werden.

Hier sind Beispiele für Zellen, die von kranialen Me- und Chix-Pflanzen wandern. Nach 48 Stunden in verschiedenen Substraten sind sowohl die Form als auch die Größe der Zellen, die aus dem Explan migrieren, abhängig. Die Substratmigration wurde auf Fibronektin, Laminin, Max-Gel, ECM und Hyaluronsäure unterstützt.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung verwendet werden, um die Signalwege weiter zu untersuchen, die das Verhalten des kranialen Me Inkin während der Neurofaltenelevation regulieren.