Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das Verhalten der kranialen Meen-Chiming-Kultur unter definierten Kulturbedingungen zu überwachen. Der erste Schritt besteht darin, die Uterushörner von einer zeitlich befruchteten Maus zu entnehmen.

8,5 Tage nach der Befruchtung. Nach der Isolierung werden die Embryonen von der Decidua getrennt und der Dottersack zur Genotypisierung entfernt. Anschließend werden die kranialen mesenchymalen Gewebe mikrodisseziert und auf mit extrazellulärer Matrix beschichteten Zellkulturplatten übertragen.

X-Explanten werden anheften gelassen und bis zu 48 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit definierter pharmakologischer Substanzen kultiviert. Abschließend werden Bilder der Explemate aufgenommen, um Unterschiede in der Zellmigration darzustellen. Diese Methode eignet sich zur Beantwortung zentraler Fragen, wie beispielsweise, welche Signalwege und extrazellulären Matrixproteine an dem Verhalten der Zellen während der Neuralfalte-Hebung beteiligt sind und dieses steuern.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Mikrodissektion schwer zu erlernen sind und Geduld sowie Übung erfordern, um sie zu beherrschen. Beginnen Sie zunächst mit der Vorbereitung von Deckgläsern, falls eine Immunhistochemie durchgeführt wird; überspringen Sie andernfalls diesen Schritt und beschichten Sie Zellkulturschalen direkt mit ECM. Tauchen Sie sterilisierte kreisförmige Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 12 Millimetern zur Sterilisation in Ethanol ein. Lassen Sie sie an der Luft trocknen. Anschließend wird ein sterilisiertes Deckglas in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte gegeben.

Arbeiten Sie in einer Abzugshaube und geben Sie einen Milliliter extrazelluläre Matrix oder ECM zur Beschichtung der Deckgläser oder des Bodens einer Zellkulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Nach der Inkubation saugen Sie die ECM-Lösung ab und waschen dreimal mit PBS. Zu diesem Zeitpunkt können die beschichteten Platten sofort verwendet oder verpackt und bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Geeignet zur Visualisierung des durchsichtigen Embryos. Syl-Schutzplatten mit widerstandsfähigen schwarzen Hintergründen werden vorbereitet. Gemäß dem Herstellungsprotokoll.

Bereiten Sie die Dissektionswerkzeuge vor, indem Sie eine Minutiennadel in einen Nadelschaft einsetzen. Schärfen Sie die Pinzette mit einem Schärfblock, sobald alles vorbereitet ist. Sammeln Sie den Uterus von einer zeitlich befruchteten Maus, die 8,5 Tage post coitum ist.

Legen Sie den isolierten Uterus in eine Schale mit steriler PBS und waschen Sie ihn. Unter dem Präparationsmikroskop trennen Sie die einzelnen Deciduas mit einer Schere und einer Pinzette. Entfernen Sie das uterine Bindegewebe mit einer reißenden Bewegung, wobei darauf geachtet werden muss, keinen Druck auszuüben und den Embryo nicht aus der Decidua herauszupressen.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Uterusgewebe auf der dem Mutterkuchen gegenüberliegenden Seite vorsichtig zu zerreißen. Um den im Dottersack eingeschlossenen Embryo freizulegen, greifen Sie mit der Pinzette den Embryo und den Dottersack am Mutterkuchen und entfernen Sie das Uterusgewebe aus der Schale. Entfernen Sie anschließend mithilfe der Pinzette vorsichtig zerreißend den Dottersack vom Embryo.

Legen Sie die Dottersack in ein Eppendorf-Röhrchen für die Genotypisierung mit einer Pipette, sobald der Embryo durch Zählen der Somiten gestuft wurde. Idealweise befindet sich der Embryo zwischen dem sechsten und zehnten Stadium, also in frühen Entwicklungsstadien. Zu diesem Zeitpunkt beginnen sich die Neuralfalten gerade zu heben, und die wesentliche Morphogenese des kranialen Mesenchyms ist noch nicht erfolgt.

Nach der Bestimmung des Entwicklungsstadiums überführen Sie das Embryo auf eine schwarze Zellfilterplatte, die DMEM ohne Phenolrot enthält. Zunächst betrachten Sie unter einem Dissektionsmikroskop mit der höchstmöglichen Vergrößerung den Kopf des Embryos, wobei Sie jeweils eine Dissektionsnadel in jeder Hand halten, und dissezieren den Kopf vor den rmba meres. Danach schneiden Sie entlang der Mittellinie, um eine Bi-Präparation zu erhalten.

Zerteilen Sie den Kopf mit einer Präpariernadel in jeder Hand in zwei gleiche Hälften. Präparieren Sie die äußeren Ränder entlang des Randes des embryonalen Kopfes und der Mittellinie. Entfernen Sie nach Bedarf, um eine Verwechslung des gewünschten Explantats mit unerwünschtem Gewebe zu vermeiden.

Das Explantat enthält wandernde kraniale Neuralleiste, paraxiales Mesoderm und Oberflächenektoderm, um locker angeheftete Zellen zu entfernen. Vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf- und abpipettieren. Und für Pepin das Explantat vorsichtig mit einer Pipettenspitze aufnehmen.

In etwa 10 Mikroliter DMEM in der Mitte einer beschichteten Gewebekultur, geben Sie 20 Mikroliter warmes DMEM mit 15 % FBS ergänzt, in die Vertiefung; die Kulturschale kann nun in einen Gewebekultur-Inkubator überführt werden. Nach ungefähr einer bis zwei Stunden ist das Explantat angeheftet und man kann zusätzlich 250 Mikroliter Medium hinzufügen. Nach ungefähr 24 Stunden wird das Explantat fest auf dem Deckglas befestigt sein.

Zu diesem Zeitpunkt können pharmakologische Substanzen nach einer zusätzlichen Inkubationszeit von 24 Stunden dem Medium hinzugefügt werden; die Zellen wandern aus diesen aus. Üblicherweise werden Bilder aufgenommen, um die zurückgelegte Distanz und die Anzahl der Zellen, die aus diesen auswandern, zu dokumentieren. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Zellen erste Anzeichen einer verminderten Vitalität zu zeigen, wenn längere Inkubationszeiten beobachtet werden.

Hier sind Beispiele für Zellen, die aus kranialen Me- und Chix-Pflanzen wandern. Nach 48 Stunden in verschiedenen Substraten hängen sowohl die Form als auch die Größe der aus dem Explan wandern den Zellen von dem Substrat ab. Die Zellwanderung wurde durch Fibronectin, Laminin, Max-Gel, ECM und Hyaluronsäure unterstützt.

Nach dieser Methode können andere Verfahren wie Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung verwendet werden, um die Signalwege, die das Verhalten der kranialen Meinkin während der Neuralrohrfaltung regulieren, weiter zu untersuchen.