Formulierung von Diblock Polymernanopartikel durch Nanopräzipitation Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, polymere Nanopartikel mithilfe einer Nanopräzipitationsmethode herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine EDC-NHS-Reaktion durchgeführt wird, um das APGLA-PEG-Copolymer zu erzeugen. Anschließend wird das PLGA-PEG-Copolymer verwendet, um Nanopartikel zu generieren, die das gewünschte Wirkstoff- oder Frachtmolekül durch Nanopräzipitation einschließen.

An diesem Punkt kann eine grundlegende biophysikalische Charakterisierung, einschließlich Größe, Oberflächenladung und Wirkstoffladeeffizienz, mittels dynamischer Lichtstreuung, Transmissionselektronenmikroskopie oder HPLC durchgeführt werden. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie von Tumoren, da die Nanopartikel schlecht lösliche Antikrebsmittel gezielt abgeben können, die möglicherweise wirksamer sind als aktuelle Behandlungen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Krebsbehandlung ermöglichen kann.

Es kann auch zur Untersuchung anderer Systeme wie des zellulären Transports verwendet werden. Die Nanopartikel können mit einem gezielten Liganden konjugiert und in vivo oder in vitro mithilfe eines Bildgebungsagents zur Demonstration der Technik sichtbar gemacht werden. Heute werden zwei Techniker aus unserem Labor, Rohit Sukumar und Natalie Cummings, die Synthese des PLGA-PEG-Copolymers beginnen, indem sie PLGA, Carboxylat, in Acetonitril bei einer Konzentration von fünf Millimolar unter leichtem Rühren auflösen.

Danach so viel NHS und EDC hinzufügen, dass Konzentrationen von 25 Millimolar erreicht werden, was ein fünfmal stöchiometrisches Überschussverhältnis im Vergleich zu PLGA darstellt, und die Lösung etwa eine Stunde lang vorsichtig rühren, um die Umwandlung der PLGA-Carboxylatgruppen in PGA-NHS zu ermöglichen. Nach einer Stunde das PGA-NHS-Reaktionsprodukt durch Zugabe der Waschlösung Methanol, etwa das 10-fache Volumen an Methanol im Überschuss zur Lösung, ausfallen lassen, anschließend die Lösung bei 2000 × g zentrifugieren, um den Niederschlag zu erhalten. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen, um Spuren von EDC und NHS zu beseitigen. Dieser Waschvorgang mit Methanol wird mindestens dreimal wiederholt.

Nach Beendigung der Wäsche das P-L-G-A-N-H-S unter Vakuum 30 Minuten lang trocknen, um Rückstände der Waschlösung zu entfernen. Danach das P-L-G-A-N-H-S-Pellet erneut in Acetonitril unter Verwendung derselben Konzentration auflösen, die ursprünglich zum Auflösen des PLGA verwendet wurde.

Nach dem Auflösen heterofunktionelles PEG zur PLGA-Lösung hinzufügen. Eine Konzentration von fünf Millimolar hinzufügen.

Inkubieren Sie die Mischung 24 Stunden unter ständigem Rühren. Fällen Sie das Reaktionsprodukt des PLGA-PEG-Blockcopolymers durch Zugabe von überschüssigem Methanol. Führen Sie den Wasch- und Zentrifugationsprozess zusätzlich dreimal durch, um jegliches überschüssige, nicht umgesetzte PEG zu entfernen.

Als letzten Schritt der Synthese wird das PLGA-PEG-Blockcopolymer unter Vakuum getrocknet. Die Nanopartikelfällung beginnt mit dem Auflösen des PLGA-PEG-Blockcopolymers und des zu verkapselnden Wirkstoffs im A-P-L-G-A-Lösungsmittel. Die Wahl des Lösungsmittels ist entscheidend, da sie die Eigenschaften des Nanopartikels beeinflusst. Anschließend wird die Polymer-Wirkstoff-Mischung tropfenweise zu drei bis zehn Volumina gerührtem Wasser gegeben, um eine endgültige Polymerkonzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Tropfenweise.

Die Zugabe der organischen Lösung zur wässrigen Phase ist entscheidend für die Bildung von Nanopartikeln der richtigen Größe. Fahren Sie zwei Stunden lang mit dem Rühren unter vermindertem Druck fort, um die Bildung der Nanopartikel durch Selbstorganisation zu ermöglichen und Spuren des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Nach zwei Stunden Rühren.

Konzentrieren Sie die Nanopartikel durch Zentrifugation bei 2.700 ×g für 10 Minuten unter Verwendung eines Amicon-Filters. Anschließend waschen Sie die Nanopartikel mit PBS, um nicht eingeschlossene Wirkstoffe zu entfernen, und zentrifugieren erneut. Schließlich resuspendieren Sie die Nanopartikel in PBS zu diesem Zeitpunkt.

Die grundlegende biophysikalische Charakterisierung, einschließlich Größe, Oberflächenladung und Wirkstoffladeeffizienz, kann durchgeführt werden, um die Eigenschaften der Nanopartikel besser zu verstehen. Die Nanopartikel können gemäß dem schriftlichen Protokoll gelagert werden, um die PLGA-PEG-Nanopartikel zu charakterisieren; zur Bestätigung von Größe, Verteilung und Struktur der Nanopartikel wurde die Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt. Die Partikelgröße liegt im Allgemeinen im Nanometerbereich.

Große Partikelgrößen mit ungleichmäßigen Größenverteilungen könnten entweder auf einen Fehler in der Konjugationsreaktion hinweisen oder darauf, dass die Nanopräzipitationsmethode optimiert werden muss. Gezeigt ist hier eine kinetische Studie zur Wirkstofffreisetzung, bei der die Ladeeffizienz und Freisetzung von Paclitaxel mittels standardmäßiger HPLC quantifiziert wurde. Bekannte feste Mengen der Nanopartikel wurden in festgelegten Zeitintervallen dialysiert.

Der Inhalt der Dialyseeinheit wurde gesammelt und mit einem gleichen Volumen eines organischen Lösungsmittels versetzt, um die Nanopartikel aufzulösen. Anschließend wurde eine HPLC-Analyse dieser Proben durchgeführt. Um den Paclitaxel-Gehalt zu quantifizieren, kann diese Nano-Fällungstechnik nach einmaliger Einarbeitung innerhalb von drei Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Beachten Sie bei der Durchführung dieser Technik, die organische Phase stets langsam zur wässrigen Phase hinzuzufügen, um die Bildung großer Partikel nach der Entwicklung zu verhindern. Diese Technik ebnete Krebsforschern im Bereich der Nanomedizin den Weg, die Verwendung schlecht löslicher Arzneistoffe zu untersuchen, die nach diesem Verfahren einst als zu toxisch für Krebspatienten galten. Andere Methoden, wie In-vivo-Effizienzstudien oder Bildgebungsstudien, können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, ob schlecht lösliche Arzneistoffe wirksam sind, wenn systemische Toxizität kein Problem mehr darstellt, oder ob Targeting-Liganden Nanopartikel gezielt an ihren Bestimmungsort leiten.