Intrazelluläre Rückfaltung Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Chaperon-abhängige intrazelluläre Protein zu messen, das sich nach einem Hitzeschock wieder faltet. Unter Verwendung eines Luciferase-Reporters transfizierten die Zellen zunächst mit Plasmiden, die das Luciferase-Reportergen und das gewünschte Chaperon überzogen. Teilen Sie dann die transfizierten Zellen für Erholungszeitpunkte im Versuchsdesign auf.

Am nächsten Tag wird die Hitze der Zellen geschockt, um die Proteinentfaltung zu induzieren. Ermöglichen Sie der Erholung, die intrazelluläre Proteinfaltung wiederherzustellen, und messen Sie dann die Aktivität des Luciferase-Reporters. Die Ergebnisse messen die zeitabhängige und Chaperon-abhängige Proteinrückfaltung basierend auf dem Luciferase-Assay.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. dem In-vitro-Refaltungsassay, besteht in der Möglichkeit, die Wirkung von Verbindungen oder Proteinen auf die Chaperonaktivität physiologisch abzulesen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie einer Vielzahl von Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen oder Krebs, da Chaperone eine wichtige Rolle bei der Entwicklung dieser Pathologien spielen. Zuerst werden das Nährmedium, PBS und Trypsin in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorgewärmt.

Eine konfluente Kultur von HEK 2 93-Zellen wird mit fünf Millilitern PBS gewaschen. Tragen Sie dann einen Milliliter Trypsin mit einem Gehalt von 0,025 % EDTA auf, drehen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsins zu gewährleisten, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Schütteln Sie die Platte regelmäßig, um die Zellablösung zu überprüfen.

Nun werden die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM-Medium resuspendiert und in ein 50 Milliliter Falcon-Röhrchen überführt. Listen Sie dann Zellen mit einer Beckman-Zählerplatte auf. Die Zellen haben eine Co-Flüssigkeit von etwa 60 bis 70 % und inkubieren sechs bis acht Stunden lang.

Das extreme Gen, neun Reagenzien auf Raumtemperatur und das Aliquot des serumfreien Mediums auf 37 Grad Celsius äquilibrieren. Pipettieren Sie das serumfreie Medium in zwei Einor-Röhrchen. Fügen Sie dann das extreme Gen-Neun-Reagenz hinzu, ohne die Einor-Röhrenwand zu berühren, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

In der Zwischenzeit bereitest du die 2D-NA-Transfektionsmischungen in Tube eins vor, fügst Ran Vanilla Firefly und eine leere Vektorsteuerung in Tube zwei hinzu. Füge das gelaufene Vanille-Glühwürmchen und das molekulare Chaperon hinzu. Geben Sie die DNA in das Transfektionsreagenz, mischen Sie den Vortex und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie diese Mischung weiterhin auf die plattierten Zellen und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Ernten Sie die transfizierten Zellen mit Trypsin-Samenzellen bei 60 bis 70 % Co-Flüssigkeit in sechs Well-Platten und lassen Sie sie über Nacht im Inkubator. Aspirieren Sie das Medium aus den transfizierten Zellen.

Dann einen Milliliter Hitzeschockpuffer hinzufügen und 30 Minuten inkubieren. Um die Denovo-Proteinsynthese zu stoppen, verschließen Sie die Deckel mit Paraform-Streifen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem 45 Grad heißen Wasserbad. Entfernen Sie nun das Paraform und legen Sie die Zellen zurück in den Inkubator, um sie zu bestimmten Zeitpunkten zu erholen.

Ernten Sie die Zellen und waschen Sie sie einmal in PBS Für einen effizienten Zelllyse-Snap frieren Sie das Zellpellet in flüssigem Stickstoff ein und fügen Sie 200 Mikroliter verdünnten passiven Lysepuffer hinzu. Nun aliquot in dreifacher Ausfertigung. 30 Mikroliter des Zelllysats pro Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Um die Transfektionseffizienz zu bewerten, beginnen Sie mit den nicht geschockten Referenzproben. Zur Messung der ran Luciferase-Aktivität bereiten Sie frischen 0,2 millimolar Lucifer in gly Gly Puffer Reaktionspuffer vor, der ein millimolaren A TP und 0,2 mikromolare Ezin-Reaktionspuffer enthält. Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Luminometer ein und starten Sie das Programm.

Wallach 1420 Arbeitsplatz. Führen Sie die Pumpe eins in das Falcon-Röhrchen ein, das 0,2 mikromolare Ezin-Reaktionspuffer enthält. Wählen Sie aus dem Menü die Option Wartung des Spenders und Zeckenpumpe eins.

Wählen Sie die Option Füllung, um das Plattenlayout zu bearbeiten. Wählen Sie die Option Protokoll und Ergebnisse im Menü aus. Wählen Sie das Protokoll aus.

Wählen Sie nun die Vertiefungen aus, die abgelesen werden sollen. Gehen Sie zurück zum Wallach-Manager und klicken Sie auf Start, um die Stichprobenemissionen zu messen. Fahren Sie bei 482 Nanometern mit der Wartung des Dispensers fort und wählen Sie "Entleeren und eins pumpen", um die gesamte Restlösung wieder in das Röhrchen abzugeben.

Schieben Sie nun das Rohr zu einem Falken, der Wasser und Zecke enthält, spülen Sie. Fahren Sie fort, indem Sie Leer auswählen. Legen Sie dann den Schlauch von Pumpe eins in den Reaktionspuffer und den Schlauch von Pumpe zwei in die LUCIFERIAN-Lösung.

Ändern Sie das Plattenlayout. Wählen Sie die Füllung für Pumpe eins und Pumpe zwei. Wählen Sie im Wartungsmenü des Dispensers das Protokoll aus und beginnen Sie mit der Messung der Luciferase-Reaktionswellenlänge von 560 Nanometern.

Wiederholen Sie am Ende der Wiederholung den Vorgang, leer, leer, spülen, leer. Sehen Sie sich die Ergebnisse für Pumpe eins und Pumpe zwei im Wallach 1420 Explorer an. Jedes Experiment ist mit einem Assay verknüpft.

Zahl, Benutzername, Start- und Enddatum, Exportergebnisse als Excel-Datei. Für die Analyse steht die Proteinrückfaltung in direktem Zusammenhang mit der Zeit der Erholung. In diesem Experiment werden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach einem Hitzeschock ausgewertet.

In Abwesenheit und in Gegenwart von molekularem Chaperon. Wie erwartet steigt der Prozentsatz der regefalteten Luciferase mit zunehmender Erholungszeit sowohl bei den Kontrollen als auch bei den Zellen, die mit dem molekularen Chaperon transfiziert wurden. Im Gegensatz dazu zeigt ein ungültiger Datensatz schlechte R-Quadrat-Werte für die Korrelation zwischen Zeit und Rückfaltung an.

Im Anschluss an diese Technik können andere Methoden wie z.B. in vitro TPAs Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Hemmung der enzymatischen Aktivität des Chaperons zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie intrazelluläres Protein gemessen werden kann. Wir folgen nach dem Kupplungsschock.