Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Säugetierzellen mit einem Barcode zu fluoreszieren, um gemultiplexte biologische Hochdurchsatz-Assays zu verbessern, die auf unterschiedlichen Fluoreszenzauslesungen beruhen. Dazu werden retrovirale Partikel verwendet, um fluoreszierende Proteine in Säugetierzellen stabil zu exprimieren und so per Barcoding zu versehen. Als nächstes wird eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durchgeführt, um klonale barcodierte Populationen zu erhalten.

Die klonalen Populationen werden dann amplifiziert, kombiniert und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um zu bestätigen, dass sie voneinander unterschieden und daher gleichzeitig verwendet werden können. Schließlich werden die barcodierten Zelllinien mit einem tagged Assay transduziert. Die Proteine und die biologische Aktivität werden mit Hilfe von Fluoreszenzkanälen überwacht, die sich von den Barcode-Kanälen unterscheiden.

Die Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit der fluoreszierenden Stabbeschichtung von Säugetierzellen für Multiplexanwendungen in einer Hochdurchsatzumgebung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, die eine sorgfältige Kalibrierung von Antikörpern oder Farbstoffen erfordern, besteht darin, dass einmal genetisch codierte Zelllinien etabliert sind, diese keine weitere Manipulation erfordern und da das Protein von Interesse über lange Zeiträume exprimiert wird, werden sie weiter für biologische Anpassungen verwendet. Die Kopplung fluoreszierender genetisch codierter Zelllinien mit Oberflächenassays ermöglicht es uns, biologische Funktionen oder Wirkungen unabhängig voneinander in einem Hydro-Durchsatzformat zu untersuchen.

In unserem Beispiel verwenden wir eine fluoreszierende genetische Balkenbeschichtung, um die Spaltung verschiedener viraler Substrate beim Multiplexing zu überwachen. Der Assay kann weiter genutzt werden, um die an der Spaltung beteiligten Maschinen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung mit hohem Durchsatz. Am Tag vor der Transfektion säte eine 10 Zentimeter große Platte mit 2,5 mal 10 bis zur sechsten Phoenix GP Zellen in DMEM mit 10%FBS.

Diese Verpackungszelllinie exprimiert stabil Gag- und Polproteine für die retrovirale Partikelbildung in Trance. Verwenden Sie am Tag der Transfektion ein Hellfeldmikroskop, um die Zellen zu untersuchen. Die Zellen müssen gesund sein und in einer Monoschicht an der Platte haften, um für die Transfektion verwendet zu werden.

Bereiten Sie als Nächstes die DNA-Transfektionsmischung auf 125 Mikroliter Serum frei vor. DMEM. Fügen Sie drei Mikrogramm vesikulären Stomatitisvirus-Hüllglykoproteinvektor, P-C-I-V-S-V-G, und drei Mikrogramm Transfervektor hinzu, der das fluoreszierende Proteingen von Interesse trägt, fügen Sie 15 Mikroliter Polyetheramin-Transfektionsreagenz hinzu und mischen Sie, um Viruspartikel zu erhalten, die verschiedene fluoreszierende Proteinmarker tragen. Führen Sie jede Transfektion unabhängig voneinander mit dem Marker Ihrer Wahl durch.

Inkubieren Sie jede Mischung nach der Inkubation 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, indem Sie die Mischung in die Zellen geben. Anschließend werden die Platten tropfenweise bei 37 Grad Celsius inkubiert. Optional können Sie das Medium nach 24 Stunden durch sieben Milliliter frisches Medium ersetzen.

Dies kann zwar die Zellgesundheit verbessern, aber auch die Viruslast im Überstand verringern. 48 Stunden nach der Transfektion verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand, der die Viruspartikel enthält, in eine 10-Milliliter-Spritze zu übertragen. Ausgestattet mit einem 0,20-Mikromol-Polytetrafluorethylenfilter, um den Kolben zu drücken, um das Filtrat in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu dosieren.

Stellen Sie ein Aliquot von zwei Millilitern für den sofortigen Gebrauch beiseite. Legen Sie die restlichen viralen Snat und Aliquots auf Eis und überführen Sie sie auf minus 80 Grad Celsius, bis sie 24 Stunden vor der Transduktion in jeder Vertiefung eines Sechs-Well-Platten-Seeds 2,0 bis 3,0 mal 10 bis zur fünften adhärenten Zelle verwendet werden, hier werden am nächsten Tag 2, 9, 3 T-Zellen verwendet. Um die adhärenten Zellen zu transduzieren, entfernen Sie das vorhandene Medium von der Platte.

Fügen Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Polyhirn zu den zwei Millilitern des zuvor gesammelten viralen Sinus hinzu und geben Sie die Mischung vorsichtig in die Zellen. Die Teller mit Parfum verschließen. Lege dann die Teller in einen hängenden Eimer.

Zentrifugieren Zentrifugieren Sie 120 Minuten lang bei 32 Grad Celsius bei 1500 mal G. Nach dem Schleudern inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Zellmedium nach 24 Stunden mindestens 72 Stunden.

Nach der Transduktion. Bereiten Sie sich auf die Analyse der transduzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie vor, um die prozentuale Transduktionsrate zu quantifizieren. Stellen Sie zunächst sicher, dass die Gates mit einer vergleichbaren, nicht transduzierten Zelllinie als Negativkontrolle richtig in den richtigen Kanälen eingestellt sind.

Stellen Sie die Parameterkanalspannung so ein, dass die negative Grundgesamtheit auf jeder interessierenden Fluoreszenzachse unter dem Wert von 10 bis zur Terz liegt. Legen Sie als Nächstes die Gates für die positive Fluoreszenz als Ereignisse fest, die außerhalb der negativen Kontrolle erscheinen. Bestimmen Sie dann mit den transduzierten Zellen den positiven Prozentsatz für den spezifischen Fluoreszenzkanal.

Sortieren Sie die Zellen in konische 15-Milliliter-Röhrchen, die einen Milliliter 100 % FBS enthalten. Drehen Sie dann die sortierten Populationen in einem hängenden Eimer herunter. Rotorzentrifuge bei 524 mal G bei 32 Grad Celsius für fünf Minuten.

Nach dem Schleudern resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Medium und säen Sie dann zweimal 10 auf die sechs Zellen in zwei Millilitern DMEM auf einer sechs Zentimeter großen Platte aus. Bei dieser Konzentration liegt der Zusammenfluss unter 60 % und ermöglicht Wachstum und Teilung für mindestens zwei Tage. Legen Sie die Zellen für mehrere Tage bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator, um Zeit für die Amplifikation zu haben.

Klonale Populationen können entweder aus den ursprünglich transduzierten oder den sortierten Zellen erzeugt werden. Die Sortierung enger Populationen auf der Grundlage der gewählten Fluoreszenz und nicht auf der Grundlage einzelner Klone in diesem Stadium gewährleistet eine Backup-Population für die zukünftige Selektion. Stellen Sie bei Bedarf die Gates für die Sortierung nach interessierenden Populationen ein. Stellen Sie sicher, dass die Gates mindestens eine logarithmische Skala voneinander entfernt sind. Um unterscheidbare Populationen mit einer automatisierten Zellablagerungseinheit zu erhalten: Sortieren Sie einzelne Zellen in 96-Well-Platten. Beachten Sie, dass durchschnittlich eine Zelle pro Well vorhanden ist.

Einige Vertiefungen haben möglicherweise keine Zellen und andere können mehr als eine Folgende Zellen haben. Sortieren, inkubieren Sie die Zellen mindestens zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius, um die einzelnen Klone zu amplifizieren. Untersuchen Sie die Zellen regelmäßig unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass wachsende Populationen aus einzelnen Zellen und nicht aus mehr als einer entstehen.

Achten Sie auch darauf, dass die Zellen nach Ablauf von zwei Wochen nicht überwuchert sind. Screenen Sie die putativen klonalen Populationen mittels Durchflusszytometrie und vergleichen Sie sie mit einer negativen Kontrollpopulation. Echte klonale Populationen sollten sehr enge Fluoreszenzmuster aufweisen.

Wählen Sie die am stärksten voneinander getrennten Populationen auf der Grundlage der durchschnittlichen Intensität und Dichte der Population aus. Amplifizieren Sie sie nach Bedarf oder lagern Sie die Bestände in Gefriermedium mit 10 % DMSO bei minus 80 Grad Celsius für kurze Zeit oder flüssigem Stickstoff für längere Zeit. Als nächstes soll getestet werden, ob klonale Populationen erfolgreich in einem Multiplex-Hochdurchsatz-Screening-System eingesetzt werden können.

Wählen Sie einen Satz von Klonen mit unterscheidbaren Absorptions-, Emissionsspektren und/oder unterschiedlichen Intensitäten und kombinieren Sie sie in einem einzigen Röhrchen-Seed. 50.000 der kombinierten Zellen in 200 Mikrolitern supplementiertem DMEM in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte in separaten Röhrchen. Bereiten Sie Negativ- und Einfarbregler für die Verwendung bei der Einstellung von Parametern und Kompensationswerten am Durchflusszytometer vor.

Legen Sie die Kompensationswerte fest. Analysieren Sie dann die Probe, um sicherzustellen, dass jede der unabhängig etablierten fluoreszierenden Zelllinien unterschieden werden kann. Um die barcodierten Zelllinien für eine biologische Anwendung anzupassen, wählen Sie zunächst Assay-Elemente aus, die so konstruiert wurden, dass sie als Fusion oder über eine interne Ribosomeneintrittsstelle an ein Tag- oder fluoreszierendes Protein gekoppelt sind.

Ires, die einen einfachen Nachweis durch Western-Blotting-Durchflusszytometrie oder eine Mikroskopie ermöglicht. Das hier verwendete System besteht aus einem biologischen Assay, bei dem ein HIV-Hüllprotein auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird und deren HA- und Flaggen-Tags freigelegt werden. Das Assay-Protein wird in einer barcodierten Zelle exprimiert, die TD-Tomate exprimiert.

Die Spaltung des Proteins kann durch Färbung mit einem FSE-markierten Anti-Flag-Antikörper überwacht werden. Wenn das Protein nicht gespalten wird, ist eine Färbung zu sehen, aber wenn das Protein gespalten wird, ist die grüne Fluoreszenzmarkierung nicht mehr sichtbar. Um den biologischen Assay in den barcodierten Zellen zu etablieren, transduzieren Sie sie mit Viruspartikeln, die die Assay-Elemente Ihrer Wahl enthalten.

Fügen Sie virales SUP-Natin zu Zellen Ihrer Wahl hinzu und drehen Sie es durch Zentrifugation. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszenzmarkierten Anti-HA-Antikörpern. Sortieren Sie dann die barcodierten Zellen, um diejenigen zu isolieren, die Assay-Elemente enthalten, die positiv für ha sind.

Schließlich kombinierte unterschiedliche barcodierte Zelllinien. Jeder enthält einen Assay, der ein anderes Substrat trägt. Inkubieren Sie das Zellgemisch mit Anti-Flag- und ZI-konjugierten Antikörpern und analysieren Sie sie durch Durchflusszytometrie, um festzustellen, ob eine Spaltung des Proteins stattgefunden hat, um den Assay zurückzuverfolgen, die Populationen in dem entsprechenden Kanal zu analysieren oder zu dekodieren, in dem die unterschiedlichen genetisch codierten Zelllinien hier unterschieden werden können.

Der PE-Kanal für TD-Tomaten entschlüsselt dann die Beschaffenheit des Substrats, indem er im Fite-Kanal analysiert, um die positive Population zu identifizieren, die auf die Spaltung von oberflächenexprimierten Proteinen im sekretorischen Weg getestet werden soll. Sub T one Zellen für die Fluoreszenz barcodiert, um TD-Tomate zu exprimieren und in drei Populationen mit unterschiedlichen Intensitäten sortiert. Jede der Populationen wurde dann mit einem anderen Retrovirus transduziert, um die Expression des Wildtyp-HIV-Hüllproteins, des mutierten HIV-Hüllproteins oder des Dengue-Virus zu induzieren.

PRM-Grenzprotein, die jeweils von Flag- und HA-Tags flankiert werden. Die transduzierten Zellen wurden mit Anti-HA- und Anti-Flag-Antikörpern inkubiert. Eine Anti-HA-Färbung wurde durchgeführt, um das Vorhandensein des manipulierten Assay-Proteins zu bestätigen, während eine Anti-Flag-Färbung durchgeführt wurde, um festzustellen, ob es gespalten wurde.

Bei der Analyse ungefärbter kombinierter Populationen mittels Durchflusszytometrie waren klonale Populationen anhand des TD-Tomaten-Barcodes unterscheidbar, aber nicht anhand des Fite-Kanals. Im Gegensatz dazu war eine Population, wenn dieselben Populationen mit Flag-Fite-Antikörpern gefärbt wurden, positiv für Flagg. Anhand von Barcodes kann diese Population leicht als die Population identifiziert werden, die das mutierte HIV-Hüllsubstrat trägt.

Jetzt sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Retro-Valve-Technologie zusammen mit der Durchflusszytometrie einsetzen können. Um fluoreszierende genetisch codierte Zelllinien zu etablieren, gibt es vier biologische Anwendungen im Multiplex-Format: Die Möglichkeit, fluoreszierende genetisch codierte Zellen mit zellbasierten Assays im Multiplex-Format zu koppeln, verbessert die Hochdurchsatzfähigkeiten erheblich. Nachdem die Zelllinien generiert wurden, ist es wichtig, sie einzufrieren.

Tauen Sie sie dann regelmäßig auf, analysieren Sie sie erneut und geben Sie sie wieder frei. Während die Erzeugung von fluoreszierenden genetisch codierten Zelllinien zunächst zeitaufwändig sein kann, verbessern sie nach ihrer Etablierung die Wiederholbarkeit und Robustheit zukünftiger Anwendungen erheblich.