Name: Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine für Multiplex-Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Lernen Sie genetisches Barcoding mit fluoreszierenden Proteinen für Multiplex-Anwendungen in Säugetierzellen. Diese Methode nutzt Retroviren zur stabilen Expression und ermöglicht Hochdurchsatzanalysen.

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Wir möchten Dr. Garry Nolan danken der Stanford University für die Bereitstellung der Phoenix GP Verpackungszelllinie für die Herstellung von retroviralen Partikeln. Wir danken Herrn Dr. Roger Tsien an der University of California in San Diego für die Bereitstellung von td Tomaten. Wir möchten auch die San Diego State University Durchflusszytometrie Core Facility für ihre Dienste und Hilfe danken.

1. Herstellung von Säugerzellen, virale Produktion und Transduction für Genetische Barcoding <ol><li> Tafel 2.5 x 10 6 adhärenten Zellen in einer 10 cm-Platte (oder ungefähr 50-60% Konfluenz) einen Tag vor der Transfektion in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS). Für den produktiven Einsatz retroviralen Verpackungszelllinie der Wahl wie Phoenix-GP (eine Art Geschenk von Gary Nolan, der Stanford University). HINWEIS: Die Verpackungszelllinie stabil exprimiert Gag- und Pol-Proteine, die für retrovirale Teilchenbildung in trans. Vergewissern Sie Zellen gesund sind und an der Platte in einer Monoschicht anhaftet, vor der Transfektion. </li><li> 24 Stunden später, bereiten Sie die DNA-Transfektion Mischung. <ol><li> Bis 125 &amp; mgr; l serumfreiem DMEM hinzuzufügen 3 ug Vesicular Stomatitis Virus-Hüllglykoprotein Vektor (pCI-VSVg) und 3 ug des Transfervektor, der die Fluoreszenz-Protein-Gen von Interesse. Mischen Sie und fügen Sie 15 ul Polyethylimin (2 mg / ml). </li><li> Inkubieren Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten und in den Zellen tropfenweise. HINWEIS: Polyethylimin wird die homogene DNA-Gemisch als Transfektionsreagenz zur Bildung von Polyplexen zugegeben. Um virale Partikel zu erhalten, die unterschiedliche fluoreszierende Protein-Marker, führen Sie jede Transfektion unabhängig mit dem Marker der Wahl. Denken Sie daran, dass die retroviralen Transfervektors liegt bei etwa 7 kb Länge und kann nicht, wenn oberhalb von 10 kb verpackt werden. </li></ol></li><li> Inkubiere Platten bei 37 ° C. Um Virusproduktion statt Platten bei 30 ° C oder 32 ° C, statt zu erhöhen. HINWEIS: 24 h nach der Transfektion Medien können mit 7 ml frisches Medium ersetzt, und obwohl dies die Zellgesundheit zu verbessern, kann die Viruslast in den Überstand zu verringern. </li><li> 48 Stunden nach der Transfektion sammeln die Überstand-haltigen Viruspartikeln und Filter mit 0,45 uM Polytetrafluorethylenfilter. Verwenden Sie frisch gesammelten Virusüberstand für die Weiterleitung. OthDERNFALLS halten Stand in Aliquots bei -80 ° C und vermeiden Frost-Tau. Beachten Sie, dass Virustiter wird wahrscheinlich bis zu 50% bei jedem Gefrier-Tau-Zyklus zu verringern. </li><li> Plattenzelllinie der Wahl, 24 Stunden vor der Transduktion wenn adhärenten oder unmittelbar vor der Transduktion wenn nicht adhärenten. Seed 2,0 x 10 5 bis 3,0 x 10 5 anhaftenden Zellen (hier Huh 7.5.1 und HEK 293T) oder 5,0 x 10 5 bis 1 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen (hier SupT1) pro Napf in einer 6-Well-Platte. HINWEIS: Achten Sie darauf, für die Kalibrierung die Anzahl der Zellen vor der Weiterleitung an ausgesät werden, insbesondere also für adhärente Zellen, also Zellen erreichen eine Konfluenz von etwa 60% zum Zeitpunkt der Weiterleitung. </li><li> Plus 5 ug / ml Polybrene (hexadimethrene Bromid) an ausgesäten Zellen und fügen zuvor gesammelten viralen Überstand auf etwa 20-40% Befall (hier 2 ml) zu erhalten. HINWEIS: Die MOI oder der Prozentsatz der Infektion ist meist willkürlich, da Sortierung ermöglicht, jede subpopulat verstärkenIonen von Zellen. Offensichtlich kann eine höhere Rate der Infektion erleichtert und beschleunigt den Prozess der Amplifikation. </li><li> Transduzieren Zellen durch Zentrifugieren in einer hängenden Schaufelrotor bei 1.500 × g für 120 min bei 32 ° C. Resuspendieren nicht adhärente Zellen mit frischem Medium vor der Inkubation. Für adhärente Zellen, ersetzen Sie sie durch frische Medien 24 Stunden nach der Transduktion. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platten vor der Zentrifugation mit Parafilm versiegeln, damit kein Ende. Genetisch Barcode-Zellvielfalt zu erhöhen, transduzieren Zellen mit Viruspartikeln, die unterschiedliche Fluoreszenzproteine ​​(aus Schritt 1.4 erhalten). Bei der Auswahl von Fluoreszenzmarkern, sicherzustellen, dass sie mit der Instrumentierung kompatibel sind und diese unterscheiden sich fluoreszierende Parameter. </li></ol> 2. Auswahl und Verstärkung von genetisch mit Strichcode Cells <ol><li> Analysieren transduzierten Säugerzellen mittels Durchflusszytometrie mindestens 72 Stunden nach der Transduktion die Zinses Transduktion quantifizieren. Verwenden Sie einen vergleichbaren nicht-transduzierten Zelllinie als negative Kontrolle. HINWEIS: Sortierung wird verwendet, um einzelne Barcode-Zellpopulationen, einen hohen Prozentsatz der Anfangsübertragung zu reinigen, werden zwar nicht erforderlich, sollte den Prozess der Verstärkung. </li><li> Nutzen Sie die Zell-Sorter der Wahl, um die Zellen, die das Protein von Interesse zum Ausdruck zu erhalten. <ol><li> Zu diesem Zweck sorgen die Tore richtig in die richtigen Kanäle eingestellt. <ol><li> Verwenden Sie dazu die gleiche naive Zelllinie als negative Kontrolle und den Parameter / Kanal-Spannung, so dass die negativen Bevölkerung ist unter den Wert von 10 3 auf jeder Fluoreszenzachse. Bestimmen Sie Gating für positive Fluoreszenz als Ereignisse, die über der von der Negativkontrolle für jede Leuchtstoffkanal angezeigt. </li></ol></li><li> Seien Sie sich bewusst, dass jedes Instrument kann variieren und die richtige Spannung für die Bestimmung Gating entsprechend angepasst werden, so dass positive und negative Kontrollen unerlässlich in jeder experimental Setup. <ol><li> Für Fluoreszenzdetektion in diesem Versuchsaufbau mit dem FITC-Kanal (530/30 Bandpassfilter mit einer 502 Langpassfilter vorgegangen) für eGFP, den PE-Kanal (585/42 Bandpassfilter mit einer 556 Langpassfilter vorgegangen) für td Tomato und die APC-Kanal (660/20 Bandpassfilter) für E2 Hochrot. HINWEIS: Die 488-nm-Laser regt eGFP und td Tomate, während E2 Hochrote wird von der 633 nm Laser angeregt. </li></ol></li></ol></li><li> Sortieren in 15 ml konischen Röhrchen mit 1 ml 100% FCS. HINWEIS: Der Prozess des Sortierens fluoreszierenden Zellpopulationen ist nicht zwingend als eine direkt mit der Art von individuellen Klonen (siehe unten) zu gelangen. Sortieren engen Populationen basierend auf ausgewählten Fluoreszenz sorgt für eine Backup-Bevölkerung für die zukünftige Auswahl von Einzelklonen. Beachten Sie, dass einzelne Zellen sind manchmal schwierig zu wachsen, während eine große Population von Zellen kann leicht eingefroren werden und dann aufgetaut und in einer späteren Phase verstärkt. </li><li> Spin unten sortierten Populationen in einem hängenden Becherrotor Zentrifuge bei 524 g bei 32 ° C für 5 min Zellen zu pelletieren. Re-suspendieren in 1 ml frischem Medium und Wiederplatte Zellen, so dass Zellkonfluenz unter 60% liegt, um das Wachstum und Teilung für mindestens zwei Tage beträgt. <ol><li> Beispielsweise Platte anhaftenden Zellen bei etwa 3 x 10 5 Zellen in 2 ml Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen und 2 x 10 6 Zellen in 2 ml Medium in einer 6 cm Platte. Verwenden DMEM für adhärente Zellen und RPMI für nicht-adhärente Zellen (oder einem festgelegten Medium falls erforderlich). Platzieren plattierten Zellen in einem Brutschrank bei 37 ° C über mehrere Tage, um die Amplifikation zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 3. Beschaffen Klonpopulationen gentechnisch mit Strichcode-Zellen bei unterschiedlichen Intensitäten <ol><li> Erhalten klonalen Populationen von Zellen, die ursprünglich transduziert (Schritt 1.7) oder aus der sortierten Population (Schritt 2.3). Hinweis: das wird gleich oder ähnlich Niveau der Fluoreszenz-Protein-Expression unter all der Zelle zu gewährleistens innerhalb der Population (a dichten Population mit einem kleinen CV der mittleren Fluoreszenzintensität von bis zu 40%). <ol><li> Zu diesem Zweck sortiert einzelnen Zellen in 96-Well-Platten mit einer automatischen Zellablagerungseinheit (ACDU). Stellen Tore für die Sortierung nach Populationen von Interesse. Stellen Sie sicher, Tore sind mindestens eine log-Skala abheben, um unterscheidbare Populationen bei der Auswahl von Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten zu erhalten. Bei dem hier dargestellten Vorgehensweise die gleiche Durchflusszytometrie experimentellen up wie die in Schritt 2.2 beschrieben, eingestellt. </li></ol></li><li> Amplifizieren einzelnen Klone in einem Brutschrank bei 37 ° C für mindestens 2 Wochen. Durch den Prozess der Amplifikation analysiert die Zellen unter dem Mikroskop, um zu gewährleisten, dass die wachsende Bevölkerung ergeben sich aus Einzelzellen und nicht aus mehr als einer. HINWEIS: Denken Sie daran, dass der Sorter wird eine Zelle pro Vertiefung im Durchschnitt platzieren, und während einige Brunnen darf keine Zelle überhaupt, andere können mehr als eine haben. <ol><li> Um dies zu gewährleisten, ein povölkerung ergibt sich aus einer Zelle nur, extrem sanft mit der Platte und nicht stören die Brunnen durch Pipettieren. Beachten Sie die Platte gut gut, unter dem Mikroskop. HINWEIS: Während der einzelnen Zellen kann manchmal schwierig sein, zu erkennen, sobald sie anfangen Division sie leicht erkennbar sein. </li><li> Beachten Sie, dass oft Zellen Klumpen &quot;an den Rändern. Entsorgen Sie diese Brunnen, in denen mehrere klonalen Populationen beobachtet werden kann und so alle, die einen engen Bevölkerung haben. HINWEIS: Es ist ratsam, die zu größeren Platten zur Verstärkung übertragen. </li></ol></li><li> Bildschirm des vermeintlichen klonalen Populationen von mittels Durchflusszytometrie analysiert sie. Vergleichen Sie sie mit einer negativen Kontrolle unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometrie Versuchsaufbau. <ol><li> Analysieren Sie nur einen Prozentsatz der Probe und den Rest als Backup. Wählen Sie die am deutlichsten getrennte Populationen nach durchschnittlichen Intensität und Engegefühl in der Bevölkerung. Verstärken sie nach Bedarf oder Gefrier Aktien inGefriermedien mit 20% Glycerin bei -80 ° C für kurze Zeit oder flüssigem Stickstoff für längere. HINWEIS: Denken Sie daran, dass eine &quot;wahre&quot; klonalen Population sollte einen sehr engen Fluoreszenzmuster haben. </li></ol></li></ol> 4. Stellen Sie sicher Multiplexing-Funktionen für High Throughput Screening (HTS) <ol><li> Zu kombinieren, wie viele verschiedene klonale Populationen wie benötigt, das in einem gemultiplexten Format weiter genutzt werden kann. Wählen Klone mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren und / oder unterschiedlicher Intensitäten. Wenn eine 96-Well-Platten-Format verwendet wird, welches geeignet für HTS, Samen 50.000 Zellen in 200 ul pro Vertiefung. HINWEIS: Beachten Sie, dass die Anzahl der Zellen ist nur eine Schätzung und kann auf Zelltyp noch ändern und ob es adhärenten ist oder nicht. </li><li> Analysieren der Probe unter Verwendung von Durchflußzytometrie, um sicherzustellen, daß jeder der unabhängigen fest fluoreszierenden Zelllinien können voneinander unterschieden werden. Vor der Analyse vorzubereiten negativenund einfarbige Controller zu Parametern und Korrekturwerte eingestellt. HINWEIS: Parameter einstellen, um die Mischpopulationen deutlich unterscheiden werden, damit sie weiter in einem Multiplexformat genutzt werden. </li></ol> 5. Passen Genetisch Barcode-Zelllinien auf die biologische Anwendung der Wahl <ol><li> Transduzieren fest genetisch barcodiert Zellinien mit Viruspartikeln, die die Analysenelemente der Wahl enthalten, wie sie hier in Stolp et al. 2013 59 beschrieben. Denken Sie daran, dass der Test der Wahl sollte eine zusätzliche und unterscheidbare Fluoreszenzkanal zu besetzen und so ist es bis zur entsprechenden Barcode-Zelllinie übertragen werden sollen. HINWEIS: Jeder Barcode-Zelllinie können einen anderen Test zu tragen. </li><li> Sortieren genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen, die für die, die Testelemente enthalten. HINWEIS: Assay Elemente können an eine Markierung oder fluoreszierende Protein gekoppelt (als Fusion oder durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle) konstruiert werden, foder einfache Erkennung durch Western-Blot, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie. Der in diesem Protokoll verwendete System beruht auf HA-Epitop Oberflächenexpression alleine oder mit zusätzlichen FLAG-Epitop Ausdruck. <ol><li> Färben die klonalen Populationen, die den Test mit HA und APC-Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern. Dann analysieren die klonalen Populationen mit anti-FLAG und FITC-konjugierten Antikörperfärbung. </li><li> Auf die Spur wieder den Test, Analyse oder &quot;decodieren&quot; die Bevölkerung in den entsprechenden Kanal, wo die verschiedenen gentechnisch Barcode versehen Zelllinien unterschieden werden können. Hier dekodieren die Art des Substrats durch Analysieren von in dem PE-Kanal für td Tomato Detektion. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier zwei etablierte Verfahren kombiniert wurden; Gentechnik durch retrovirale Technologie und Detektion von fluoreszierenden Proteinen unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Fluorescent Protein basierenden genetischen Barcodes für die Herstellung von einzigartigen Zellinien stellt eine robuste und einfache Weise für Verbundanwendungen. Erzeugung gentechnisch barcodierte Zellen durch Retrovirus-Technologie ist zunächst ein langwieriger Prozess, sondern erlaubt es, zu erhalten, einmal etabliert, eine zuverlässige und...

Technologien wie Fluoreszenz-Spektroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie, alle auf Fluoreszenz, eine Eigenschaft, die weithin in biochemischen, biomedizinischen und chemischen Anwendungen genutzt. Fluoreszenz, ob intrinsische oder durch eine entsprechende Kennzeichnung, wurde für die Analyse von Protein-Expressionsmuster und Profile des Zellschicksals, Protein-Interaktionen und biologischen Funktionen 1-9 ausgeschöpft und durch Fluoreszenz / Förster-Resonanzenergietransfer zur Detektion von Biomolekül-Wechselwirkungen und Konformationsänderungen 10-13. Seit der Isolierung des Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) 14, die Entdeckung weiterer natürlich vorkommende fluoreszierende Proteine ​​aus anderen Cnidaria, insbesondere Korallen, weitgehend die Anzahl der vorhandenen fluoreszierenden Proteinen mit unterscheidbaren Anregungs / Emissionsspektren erhöht. Dies, zusammen mit der Einführung von Mutationen in den Genen 15-19 HAVe die Möglichkeiten weiter ausgebaut, wodurch eine wahre Palette von fluoreszierenden Proteinen den Wissenschaftlern, die Mikroskopie nutzen, Durchflusszytometrie und andere Fluoreszenz-basierten Technologien für ihre Forschung. Parallel zwar unabhängig, die Entwicklung von Retrovirus-Technologie drastisch die stabile Expression des ektopischen genetische Information in Säugerzellen 20-23 erleichtert. Es ist daher nicht überraschend, dass diese Technik verwendet worden, um Gene von fluoreszierenden Proteinen in einer breiten Anzahl von Zelltypen und Geweben 24-28 oder zur Herstellung von transgenen Tieren 29-31 übertragen. Nach der Art der Retroviren wird die genetische Information der ektopischen fluoreszierenden Proteins in das Genom der Zelle 32 eingeführt, und die Zelle wird fluoreszierenden `für ever&#39;. Diese Eigenschaft wurde Tracking der Zellschicksal erlaubt, oder einer einzelnen Zelle innerhalb einer Population von Zellen. Die jetzt fluoreszierende Zelle so acqui hatrot sein eigenes Biosignatur und definiert als Barcode versehen werden. Seine einzigartige Biosignatur identifiziert sie von anderen Zellen, und wichtiger ist, unterscheidet sie von Zellen, die genetisch manipuliert, um verschiedene fluoreszierende Proteine ​​mit unterscheidbaren Absorptions- / Emissionsspektren zum Ausdruck bringen. Biologische Anwendungen wie die Verfolgung von Pluripotenz Reprogrammierungsfaktoren Richtung 33, die Analyse subnuclear Faktoren für die Aufklärung der nukleoläres Lokalisierungs 34, der Aufbau der fluoreszierenden Reporter-Plasmide für die Transkriptionsstudien 35 oder dem genetischen Markierung von Neuronen für die Untersuchung der neuronalen Netzwerkarchitektur 36 sind nur vier Beispiele der vielen, unterschiedlichen Fluoreszenzprotein-Gene für die gleiche Versuchsanordnung ausgenutzt haben. Durchflusszytometrie wurde allgemein zur Analyse der biologischen Prozesse in der Ebene einer einzelnen Zelle, wie beispielsweise die Genexpression, Zellzyklus, Apoptose verwendet und Signalisierung durch Phosphorylation 37-43 .Die stabile Expression von fluoreszierenden Protein Gene in Säugerzellen wurde weiter verbessert den Nutzen der Durchflusszytometrie zur Zellanalyse 38,44 und Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen 45. Erweiterte Möglichkeiten haben Fluss erlaubt Zytometrie auf eine weit verwendete Methode für die Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-46 geworden. Trotz der nun erweiterten Anzahl von Fluorometer und Robotik-Technologien, die paar Plattenleser Systeme, Bildgebung und fließen Cytometry, scheint es einen Mangel in der experimentellen Design, das zu nutzen und passen diese erweiterten technologischen Möglichkeiten können. Schnell, zuverlässig, einfach und robust zellbasierten Methoden drastisch für Multiplex-Anwendungen, die weiter zu verbessern Hochdurchsatz-Kapazität benötigt. Dies gilt insbesondere auf dem Gebiet der Wirkstoffentdeckung, wo technische Tests auf Zellbasis in einem gemultiplexten Format kann die Kraft des Hochdurchsatz-Screening-39,47-50 erweitern </sup&gt;. Multiplexing, denn sie ermöglicht die gleichzeitige Analyse in einer Probe, weiterhin verbessert Hochdurchsatzfähigkeiten 51-54. Fluorescent genetischen Barcodes ermöglicht nicht nur elegant Multiplexing, sondern auch, einmal entwickelt, umgeht die Notwendigkeit der zeitaufwendig Protokollen, senkt die Kosten einher mit Antikörpern, Perlen und Flecken 39,52,55 und können die Anzahl der Bildschirme für Hoch zu reduzieren Durchsatz-Anwendungen. Vor kurzem haben wir beschrieben, wie retrovirale Technologie Multiplexing durch fluoreszierende genetischen Barcodes für biologische Anwendungen, durch eine zuvor entwickelte, um HIV-1-Protease-Aktivität 56,57 mit verschiedenen klinisch gängigen Varianten 58 überwachen Test zum Ausdruck zu verbessern. Die Methodik wird in einem aussagekräftigeren Weise erklärt sich auf die Auswahl und verstärken genetisch fluoreszierende Barcode-Zellen und, wie man Platten von klonalen Populationen Ausdruck unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen und / oder unterschiedliche Fluoreszenz intensit produzierener Jahren. Panels von Zellpopulationen zu unterscheiden, basierend auf ihren Fluoreszenzeigenschaften zu verbessern multiplexierten Funktionen, die weiter in Kombination mit zellbasierten Assays, die verschiedene biologische Fragen anzugehen nutzt werden können. Das Protokoll beschreibt auch, wie man eine Gruppe von Barcode-Zellen, die einen der zuvor im Labor entwickelt die zellbasierte Assays zu konstruieren, wie beispielsweise 59. Dieses Protokoll wird damit nicht beabsichtigt, den etablierten retroviralen / lentiviralen Technik des Gentransfers, den Wert von fluoreszierenden Proteinen oder die Anwendungen der Durchflusszytometrie 60,48 zeigen, sondern die Verbesserung der Leistung der Kombination der drei für die Multiplex-Anwendungen zeigen.

<table><tbody><tr><td>10 ml Spritzen</td><td>BD</td><td>309604</td><td>zur Filterung des Virus</td></tr><tr><td>0,45 &Mikro; Tetrafluorethylenfilter</td><td>Pall Corporation</td><td>4219</td><td>zur Filterung des Virus</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Corning</td><td>45000-304</td><td>Zellwachstumsmedium für HEK 293T-Zellen</td></tr><tr><td>PEI (Polyethylenimin)</td><td>Polywissenschaften</td><td>23966-2</td><td>2 mg/ml Konzentration verwendet</td></tr><tr><td>Hängeeimerzentrifuge (gekühlt)</td><td>Eppendorf</td><td>5805 000.017</td><td>verwendet für Spin-Infektion</td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>zum Waschen von Zellen</td></tr><tr><td>Polybren (Hexadimethreenbromid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>Wird verwendet, um die Effizienz von Virusinfektionen zu erhöhen. Wird an einem 5 & micro; g/ml-Konzentration.</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences-Gerät</td><td></td><td>zur Sortierung von Zellpopulationen</td></tr><tr><td>FACSCanto</td><td>BD Biosciences-Gerät</td><td></td><td>zur Zellanalyse</td></tr><tr><td>Phoenix-GP</td><td>Geschenk der Gary Nolan-Zelllinie</td><td></td><td>zur Herstellung retroviraler Partikel</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Mediatech</td><td>MT35015CV</td><td>für das Zellwachstum und die Sortierung</td></tr> von <tr><td>SupT1-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>Humane T-Lymphoblasten</td></tr><tr><td>HEK 293T-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Menschliche embryonale Nierenzellen, die auch das große SV40-T-Antigen</td></tr><tr><td>enthalten RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>Zellwachstumsmedien für SupT1-Zellen</td></tr></tbody></table>

genetische barcoding mit fluoreszierende proteine ​​für multiplex-anwendungen

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluoreszierende Proteine, Fluoreszenzfarbstoffe und Fluorophore im Allgemeinen haben das Gebiet der molekularen Zellbiologie revolutioniert. Insbesondere die Entdeckung fluoreszierender Proteine und ihrer Gene hat die Entwicklung von Proteinfusionen für die Lokalisierung, die Analyse der transkriptionellen Aktivierung und Translation von Proteinen von Interesse oder die allgemeine Verfolgung einzelner Zellen und Zellpopulationen ermöglicht. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteingenen in Kombination mit retroviraler Technologie hat die Expression dieser Proteine in Säugetierzellen auf stabile und zuverlässige Weise ermöglicht. Hier wird gezeigt, wie man diese Gene nutzen kann, um Zellen innerhalb einer Zellpopulation ihre eigene Biosignatur zu verleihen. Da die Biosignatur mit retroviraler Technologie erreicht wird, werden die Zellen "unbegrenzt" mit einem Barcode versehen. Als solche können sie einzeln innerhalb einer Mischung von Barcode-Zellen verfolgt und in komplexeren biologischen Anwendungen eingesetzt werden. Die Verfolgung unterschiedlicher Populationen in einer Mischung von Zellen ist ideal für Multiplex-Anwendungen, wie z. B. die Entdeckung von Medikamenten gegen eine Vielzahl von Zielen oder das Aktivierungsprofil verschiedener Promotoren. Das Protokoll beschreibt, wie man Barcode-Säugetierzellen elegant mit unterschiedlichen genetischen Fluoreszenzmarkern entwickelt und amplifiziert und wie man mehrere Marker gleichzeitig oder einen Marker mit unterschiedlichen Intensitäten verwendet. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie die Zellen in Kombination mit zellbasierten Assays weiter genutzt werden können, um die Aussagekraft der Analyse durch Multiplexing zu erhöhen.

Multiplexing Fluoreszenz genetisch barcodiert Zellen zum Zwecke der biologischen Anwendungen kann nur erreicht werden, wenn individuelle klonale Populationen wurden erzeugt. Multiplexing ist am effektivsten, wenn mit Barcode Populationen deutlich unterschiedlichen fluoreszierenden Eigenschaften mit minimalen spektralen Überlappung. Die in Figur 1 mit klonalen Populationen von Säugerzellen SupT1 gezeigte Beispiel zeigt, dass Zellen, die mit Strichcode versehene mCherry und Cyano fluoreszierendes Protein ...

Seit der Entdeckung des grün fluoreszierenden Protein-Gens haben fluoreszierende Proteine die molekulare Zellbiologie beeinflusst. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression unterschiedlicher fluoreszierender Proteine durch Gentechnik für das Barcoding einzelner Zellen genutzt wird. Das Verfahren ermöglicht die Verfolgung unterschiedlicher Populationen in einer Zellmischung, was ideal für Multiplex-Anwendungen ist.

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Säugetierzellen mittels fluoreszenter Markierung zu kennzeichnen, um multiplexierte, hochdurchsatzfähige biologische Assays zu verbessern, die auf unterschiedlichen fluoreszenten Nachweisen basieren. Zu diesem Zweck werden retrovirale Partikel verwendet, um fluoreszierende Proteine stabil in Säugetierzellen zu exprimieren und sie so zu markieren. Anschließend wird eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durchgeführt, um klonale, markierte Zellpopulationen zu erhalten.Die klonalen Populationen werden anschließend amplifiziert, kombiniert und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um zu bestätigen, dass sie voneinander unterschieden werden können und somit gleichzeitig verwendet werden können. Abschließend werden die mit Barcodes markierten Zelllinien mit einem markierten Assay transduziert. Proteine und biologische Aktivität werden mithilfe fluoreszenter Kanäle überwacht, die sich von den Barcode-Kanälen unterscheiden.Die Ergebnisse zeigen die Nützlichkeit der fluoreszierenden Markierung von Säugerzellen für multiplexe Anwendungen in einer Umgebung mit hohem Durchsatz. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, die eine sorgfältige Kalibrierung von Antikörpern oder Farbstoffen erfordern, liegt darin, dass genetisch codierte Zelllinien nach ihrer Etablierung keiner weiteren Manipulation bedürfen und da das Protein von Interesse über längere Zeiträume exprimiert wird, sie zudem für biologische Anpassungen weiterverwendet werden können. Die Kombination fluoreszierend markierter, genetisch codierter Zelllinien mit Oberflächenassays ermöglicht es uns, biologische Funktionen oder Effekte unabhängig voneinander in einem Format mit hohem Durchsatz zu untersuchen.Im vorliegenden Beispiel verwenden wir eine fluoreszierende genetische Barcode-Beschichtung, um die Spaltung verschiedener viraler Substrate in Multiplexanalysen zu überwachen. Der Assay kann weiterhin genutzt werden, um die an der Spaltung beteiligten Mechanismen zu untersuchen und für die Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffen. Am Tag vor der Transfektion werden eine 10 cm-Platte mit 2,5 × 10⁶ Phoenix-GP-Zellen in DMEM mit 10 % FBS besiedelt.Diese Verpackungszelllinie exprimiert stabil die Gag- und Pol-Proteine für die Bildung retroviraler Partikel in trance. Untersuchen Sie am Tag der Transfektion die Zellen mit einem Hellfeldmikroskop. Die Zellen müssen gesund sein und als Monolayer an der Platte haften, um für die Transfektion verwendet werden zu können.Bereiten Sie als Nächstes das DNA-Transfektionsgemisch auf 125 µL serumfreiem DMEM vor. Geben Sie drei Mikrogramm des Vektors für das Vesikuläre Stomatitis-Virus-Hüllglykoprotein, P-C-I-V-S-V-G, und drei Mikrogramm des Transfervektors, der das gewünschte Gen für das fluoreszierende Protein trägt, hinzu. Fügen Sie 15 µL des Polyetheramin-Transfektionsreagenz hinzu und mischen Sie gründlich, um virale Partikel zu erhalten, die unterschiedliche fluoreszierende Proteinmarker tragen. Führen Sie jede Transfektion unabhängig mit dem jeweils gewählten Marker durch.Die einzelnen Gemische 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren; nach der Inkubation das Gemisch tropfenweise zu den Zellen geben und transfecten. Anschließend die Platten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Optional nach 24 Stunden das Medium durch sieben Milliliter frisches Medium ersetzen.Obwohl dies die Zellgesundheit verbessern kann, könnte die Viruslast im Überstand verringert werden. 48 Stunden nach der Transfektion verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand, der die Viruspartikel enthält, in eine 10-Milliliter-Spritze zu überführen. Befestigen Sie einen 0,20-Mikrometer-Polytetrafluorethylen-Filter und drücken Sie den Kolben, um das Filtrat in 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen abzugeben.Stellen Sie eine Aliquotprobe von zwei Millilitern für den sofortigen Gebrauch beiseite. Legen Sie das verbleibende virale Snat und die Aliquots auf Eis und überführen Sie sie in minus 80 Grad Celsius, bis sie 24 Stunden vor der Transduktion in jedes Loch einer Sechs-Loch-Platte verwendet werden. Besäen Sie 2,0 bis 3,0 mal 10 hoch fünf adhärente Zellen; hier werden 293T-Zellen verwendet. Am nächsten Tag. Um die adhärenten Zellen zu transduzieren, entfernen Sie das vorhandene Medium von der Platte.Geben Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Poly-Brain zu den zwei Millilitern des zuvor gesammelten viralen Sins hinzu und pipettieren Sie das Gemisch vorsichtig auf die Zellen. Verschließen Sie die Platten mit Parfum. Stellen Sie die Platten anschließend in einen Hängeeimer.Zentrifugieren Sie die Probe bei 1500 × g für 120 Minuten bei 32 °C. Nach dem Zentrifugieren inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Nach 24 Stunden wechseln Sie das Zellmedium; wiederholen Sie den Wechsel mindestens alle 72 Stunden.Nach der Transduktion. Bereiten Sie die Analyse der transduzierten Zellen mittels Durchflusszytometrie vor, um die Transduktionsrate in Prozent zu quantifizieren. Stellen Sie zunächst mithilfe einer vergleichbaren nicht-transduzierten Zelllinie als negativen Kontrolle sicher, dass die Tore in den richtigen Kanälen korrekt eingestellt sind.Stellen Sie den Parameterkanal für die Spannung so ein, dass die negative Population unterhalb des Werts von 10 hoch 3 auf jeder gewünschten fluoreszierenden Achse liegt. Legen Sie anschließend die Tore für positive Fluoreszenz als Ereignisse fest, die jenseits der negativen Kontrolle liegen. Bestimmen Sie dann anhand der transduzierten Zellen den Prozentsatz der positiven Zellen für den spezifischen fluoreszierenden Kanal.Sortieren Sie die Zellen in 15-Milliliter-Konizflaschen, die ein Milliliter 100 % FBS enthalten. Anschließend zentrifugieren Sie die sortierten Populationen in einer Schwenkkorbzentrifuge bei 524 × g und 32 °C für fünf Minuten.Nach dem Zentrifugieren die Zellen in einem Milliliter frischem Medium resuspendieren und jeweils zwei mal zehn hoch sechs Zellen in zwei Milliliter DMEM auf eine sechs Zentimeter Petrischale aussäen. Bei dieser Konzentration liegt die Konfluenz unter 60 % und ermöglicht ein Wachstum und Teilen über mindestens zwei Tage. Die Zellen für mehrere Tage in einem Inkubator bei 37 °C stellen, um Zeit für die Amplifikation zu schaffen.Klonale Populationen können entweder aus den ursprünglich transduzierten oder aus den sortierten Zellen erzeugt werden. Die Sortierung enger Populationen anhand der gewählten Fluoreszenz anstelle einzelner Klone zu diesem Zeitpunkt stellt eine Sicherungspopulation für zukünftige Selektionen sicher. Falls erforderlich, setzen Sie die Sortiertore entsprechend den Populationen von Interesse; stellen Sie sicher, dass die Tore um mindestens eine logarithmische Skala voneinander entfernt liegen, um unterscheidbare Populationen zu erhalten. Verwenden Sie eine automatisierte Zellabscheidungseinheit, um einzelne Zellen in 96-Loch-Platten zu sortieren, wobei zu beachten ist, dass durchschnittlich eine Zelle pro Loch erwartet wird.Einige Vertiefungen enthalten möglicherweise keine Zellen, während andere mehr als eine aufweisen. Nach der Sortierung inkubieren Sie die Zellen für mindestens zwei Wochen bei 37 Grad Celsius, um die einzelnen Klone zu amplifizieren. Untersuchen Sie die Zellen regelmäßig unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass wachsende Populationen von einzelnen Zellen ausgehen und nicht von mehreren.Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen nach zwei Wochen nicht überkonfluent werden. Untersuchen Sie die mutmaßlichen klonalen Populationen mittels Durchflusszytometrie und vergleichen Sie sie mit einer negativen Kontrollpopulation. Echte klonale Populationen sollten sehr enge Fluoreszenzmuster aufweisen.Wählen Sie die am deutlichsten getrennten Populationen basierend auf der durchschnittlichen Intensität und der Enge der Population aus. Verstärken Sie sie nach Bedarf oder lagern Sie Bestände im Gefriermittel mit 10 % DMSO bei minus 80 Grad Celsius für kurze Zeiträume oder in flüssigem Stickstoff für längere Zeiträume. Als Nächstes testen Sie, ob klonale Populationen erfolgreich in einem multiplexen Hochdurchsatz-Screening-System verwendet werden können.Wählen Sie einen Satz von Klone mit unterscheidbaren Absorptions-, Emissions-Spektren und/oder unterschiedlichen Intensitäten aus und kombinieren Sie diese in einem einzigen Saatgutrohr. Geben Sie 50.000 der kombinierten Zellen in 200 µL zugesetztem DMEM in jedes einzelne Loch einer 96-Loch-Platte in separaten Röhrchen. Bereiten Sie negative Kontrollen sowie Einzelfarben-Kontrollen zur Einstellung der Parameter und Kompensationswerte am Durchflusszytometer vor.Stellen Sie die Kompensationswerte ein. Analysieren Sie anschließend die Probe, um sicherzustellen, dass sich jede der unabhängig etablierten fluoreszierenden Zelllinien unterscheiden lässt. Um die barcodierten Zelllinien für eine biologische Anwendung anzupassen, wählen Sie zunächst solche Assay-Elemente aus, die so konstruiert wurden, dass sie entweder als Fusion oder über eine interne Ribosom-Einsetzstelle mit einem Marker oder einem fluoreszierenden Protein verknüpft sind.Ires, das eine einfache Nachweismethode mittels Western Blot, Durchflusszytometrie oder Mikroskopie ermöglicht. Das hier verwendete System besteht aus einem biologischen Test, bei dem ein HIV-Hüllprotein auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird und dabei seine HA- und Flag-Tags freigibt. Das Testprotein wird in einer mit Barcode versehenen Zelle exprimiert, die TD-Tomato exprimiert.Der Spaltvorgang des Proteins kann durch Färbung mit einem FSE-markierten Anti-Flag-Antikörper überwacht werden. Wenn das Protein nicht gespalten wird, ist eine Färbung sichtbar; wird das Protein hingegen gespalten, ist die grüne Fluoreszenzmarkierung nicht mehr nachweisbar. Um den biologischen Assay in den barcodierten Zellen einzurichten, müssen diese mit viralen Partikeln transduziert werden, die die gewünschten Assayeinheiten enthalten.Fügen Sie virales SUP Natin den gewünschten Zellen hinzu und zentrifugieren Sie. Inkubieren Sie anschließend die Zellen mit fluoreszenzmarkierten anti-HA-Antikörpern. Danach sortieren Sie die mit Barcodes markierten Zellen, um jene zu isolieren, die Testelemente enthalten, die positiv für HA sind.Schließlich wurden kombinierte, unterschiedliche, mit Barcode versehene Zelllinien verwendet, von denen jede einen Assay mit einem anderen Substrat enthielt. Inkubieren Sie das Zellgemisch mit Anti-Flag- und ZI-konjugiertem Antikörper und analysieren Sie es mittels Durchflusszytometrie, um festzustellen, ob ein Proteinspaltungsereignis stattgefunden hat. Verfolgen Sie rückwärts, welcher Assay vorliegt, analysieren oder entschlüsseln Sie die Populationen im geeigneten Kanal, in dem die unterschiedlichen, genetisch barcodierten Zelllinien voneinander unterschieden werden können.Der PE-Kanal für TD-Tomate decodiert dann die Art des Substrats, indem im Fite-Kanal analysiert wird, um die positive Population offenzulegen, um den Spaltvorgang von an der Oberfläche exprimierten Proteinen im sekretorischen Weg zu untersuchen. Sub-T1-Zellen wurden fluoreszenzmarkiert, um TD-Tomate zu exprimieren, und in drei Populationen mit unterschiedlichen Intensitäten sortiert. Jede der Populationen wurde anschließend mit einem unterschiedlichen Retrovirus transduziert, um die Expression des wildtypischen HIV-Umhüllungsproteins, des mutierten HIV-Umhüllungsproteins oder des Denguevirus zu induzieren.PRM-Grenzprotein, jeweils flankiert durch Flag- und HA-Tags. Die transduzierten Zellen wurden mit anti-HA- und Anti-Flag-Antikörpern inkubiert. Die anti-HA-Färbung diente zur Bestätigung der Anwesenheit des konstruierten Assayproteins, während die Anti-Flag-Färbung durchgeführt wurde, um festzustellen, ob dieses gespalten wurde.Wenn unbelastete kombinierte Populationen mittels Durchflusszytometrie analysiert wurden, waren klonale Populationen basierend auf dem TD-Tomato-Barcode unterscheidbar, jedoch im fite-Kanal nicht unterscheidbar. Im Gegensatz dazu war, wenn dieselben Populationen mit Flag-fite-Antikörper gefärbt wurden, eine Population positiv für Flag. Basierend auf der Barcode-Markierung kann diese Population leicht als die Population identifiziert werden, die das mutierte HIV-Hüllprotein-Substrat trägt.Nun sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man die Retroventil-Technologie zusammen mit der Durchflusszytometrie nutzt. Um fluoreszenzmarkierte, genetisch barcodierte Zelllinien in einem multiplexfähigen Format für vier biologische Anwendungen zu etablieren, ist die Kombination fluoreszenzmarkierter, genetisch barcodierter Zellen mit zellbasierten Assays in einem multiplexfähigen Format von entscheidender Bedeutung, da sie die Hochdurchsatzfähigkeit erheblich verbessert. Nachdem die Zelllinien generiert wurden, ist es wichtig, sie einzufrieren.Dann tauen Sie sie periodisch auf, analysieren Sie erneut und frieren Sie sie erneut ein. Obwohl die Erzeugung fluoreszierender, genetisch barcodierter Zelllinien zunächst zeitaufwändig sein mag, verbessern sie einmal etabliert die Wiederholbarkeit und Robustheit zukünftiger Anwendungen erheblich.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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