Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Kapillarelektrophorese-Immunoassay unter Verwendung einer kommerziellen Plattform zu demonstrieren. Diese Plattform wird Proteinziele aus einer biologischen Probe unterscheiden und quantifizieren, die aus Zellkulturgeweben und Bioflüssigkeiten gewonnen werden kann. Der Prozess untersucht Proteine anhand ihrer Größe von zwei bis 440 Kilodalton.

Der Vorteil dieses automatisierten Verfahrens gegenüber herkömmlichen Verfahren, wie z. B. einem Western Blot, besteht darin, dass bei kapillarelektrophoretischen Immunoassays keine Gele, Transfergeräte und manuellen Waschungen erforderlich sind. Auch die absolute Menge an benötigtem Protein ist etwa 10-mal geringer, was das Verfahren ideal für seltene Zelltypen oder begrenzte Proben macht. Darüber hinaus werden die Ergebnisse mit automatisierten Systemen in nur drei Stunden erzielt und sind nachweislich quantitativer und reproduzierbarer als herkömmliche Western-Blot-Verfahren.

Bereiten Sie die Proben und Reagenzien aus dem Kit vor, einschließlich Probenpuffer, Dithiothreitol, fluoreszierender Mastermix und biotinylierter Leiter gemäß der Produktbeilage des Herstellers. Bereiten Sie die Proteinproben mit Ihrer bevorzugten Methode vor. Hier haben wir Ganzzellextrakt aus BEAS-2B-Zellkulturen isoliert.

Verdünnen Sie die Proteinproben mit Probenpuffer. Mischen Sie einen Teil Five-X fluoreszierenden Mastermix mit vier Teilen verdünnter Probe, um die gewünschte endgültige Proteinkonzentration zu erreichen. Es wird eine Beispielrechnung für die Herstellung von 70 Mikrolitern mit 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter Endproteinkonzentration gezeigt, ausgehend von einer Proteinstammkonzentration von 1,2 Mikrogramm pro Mikroliter.

Der Mastermix beträgt 1/5 des Gesamtvolumens, in diesem Fall 14 Mikroliter. Um das Volumen der benötigten Proteinbrühe zu berechnen, multiplizieren Sie die gewünschte Endkonzentration mit dem Gesamtvolumen und dividieren Sie sie durch die Proteinstammkonzentration. Subtrahieren Sie das Master-Mix- und das Stammvolumen vom Gesamtvolumen, um das Volumen des Sample-Puffers zu berechnen.

Denaturieren Sie die vorbereiteten Proben und die Leiter, indem Sie sie fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen. Beachten Sie, dass einige Proteine möglicherweise schonendere Denaturierungsbedingungen erfordern. Zum Beispiel 70 Grad für 10 Minuten, um eine Proteinaggregation zu verhindern und die Migration zu verbessern.

Ziehen Sie diese Option in Betracht, wenn es bei den höheren Molekulargewichten zu starken Verschmierungen kommt. Bereiten Sie die gewünschten Antikörperverdünnungen in dem mitgelieferten Verdünnungsmittel vor. Beachten Sie, dass Antikörper im Allgemeinen in höheren Konzentrationen für kapillarbasierte Immunoassays verwendet werden als für herkömmliches Western Blotting.

Bereiten Sie bei jedem Gebrauch eine Eins-zu-Eins-Mischung aus Luminol und Peroxid frisch zu. Pipettieren Sie die Proben und Reagenzien mit den in der Vorlage angegebenen Volumina in die Assay-Platte. Die Farbcodierung steht für das korrekte Laden von Reagenzien und Proben auf die Assay-Platte.

Pipettieren Sie die biotinylierte Leiter in die Vertiefung A1, die vorbereiteten Proben in die Vertiefungen A2 bis A25. Der bereitgestellte Antikörper dimiliert die Vertiefungen B1 bis B25 und die Vertiefung C1. Primärer Antikörper gegen die Vertiefungen C2 bis C25. Streptavidin HRP bis gut D1. Sekundärer Antikörper gegen die Vertiefungen D2 bis D25.

Und Luminol-Peroxid-Mischung in die Vertiefungen E1 bis E25. Fügen Sie den ersten drei Reihen der größeren Vertiefungen in der Mitte der Platte Waschpuffer hinzu. Schalten Sie das Kapillarimmunoassay-Gerät ein und öffnen Sie die zugehörige Software.

Legen Sie die Kapillarpatrone und die Assay-Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers in das Gerät ein und starten Sie den Lauf. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, überprüfen Sie, ob die Fluoreszenzstandards korrekt identifiziert und gegebenenfalls korrigiert sind. Vergewissern Sie sich außerdem, dass die biotinylierte Leiter die richtigen Größenspitzen für das verwendete Kit aufweist.

Weitere Informationen finden Sie in der Kurzanleitung des Herstellers oder im Produkthandbuch. Die Optimierung der Assay-Bedingungen wie Expositionszeit, Proteinkonzentration und Antikörperverdünnung ist wichtig, um genaue, reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Diese Bedingungen sind spezifisch für jede Antikörperkombination des Modellsystems und sollten daher für jeden neuen Assay empirisch bestimmt werden.

Die Fähigkeit, quantitative Ergebnisse zu erzielen, hängt von der Analyse einer Belichtungszeit ab, bei der das Luminolsubstrat nicht schnell erschöpft wird, da eine Substratverarmung zu einem Signalverlust oder Signalausbrennen führt. Dies kann festgestellt werden, indem die Daten bei unterschiedlichen Chemilumineszenz-Expositionszeiten untersucht werden, wie in Abbildung zwei gezeigt. Die Belichtungszeiten mit dem verwendeten Instrument reichten von fünf bis 480 Sekunden.

Lane-Ansichten zeigten abnehmende Proteinkonzentrationen für BEAS-2B-Extrakte, die mit p53 DO-1-Antikörpern in einer Verdünnung von eins bis 500 untersucht wurden. Chemilumineszenz-Signalkoeffizienten, die in der Gerätesoftware als Peakhöhen gemeldet werden, werden überlagert. Die Intensität der visuellen Bänder wird automatisch vom Gerät angepasst und ist nicht von einem Panel zum anderen vergleichbar.

Der Signalkoeffizient nimmt mit sequentiell längerer Belichtung ab, wenn das Luminol erschöpft ist, wie hier zu sehen. Das Signal beginnt zu verschwinden und der Peak teilt sich bei den beiden längsten Belichtungszeiten. Aus diesem Grund wurde für die Datenanalyse eine kurze Belichtungszeit von 15 Sekunden gewählt.

Gesamtproteineintrag sollte auch für jeden einzelnen Assay und jedes Modellsystem optimiert werden. Für die quantitative Bewertung müssen die Messungen innerhalb des linearen dynamischen Bereichs jedes Assays durchgeführt werden. Dabei sind die Änderungen des Signals, gemessen an der Peakfläche, proportional zu den Änderungen der Proteinmenge in der Probe.

Die Lysat-Titration zeigt die Spuransichten von BEAS-2B-Lysat, wenn es mit einem bis 500 p53 DO-1 oder einem zu 50 alpha-Tubulin-Antikörper untersucht wird. Die lineare Regressionsanalyse bestätigt, dass die Assays über den gesamten getesteten Bereich linear sind. Die Gesamtproteinkonzentrationen in der Mitte des linearen Bereichs wurden gewählt, um eine mögliche Variation des Zielproteins in beide Richtungen zu berücksichtigen.

Als letzte Überlegung zur Optimierung sollte die richtige Verdünnung des Primärantikörpers bewertet werden. Die Verwendung von Antikörpern in Nahtkonzentrationen trägt dazu bei, dass alle gemessenen Signaländerungen nur auf Änderungen der Proteinmenge zurückzuführen sind. Zwei BEAS-2B-Proteinproben, dargestellt durch die blauen und orangefarbenen Punkte, wurden mit seriell verdünnten alpha-Tubulin-Antikörpern untersucht.

Das Chemilumineszenzsignal, gemessen als Peakfläche, wurde gegen die Antikörperverdünnung aufgetragen. Eine Sättigung wurde in der Nähe der Verdünnung von eins bis 50 beobachtet, wo die Kurve ein deutliches Plateau beginnt. Daher wurde eins zu 50 als optimale Verdünnung für diesen Antikörper gewählt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie sich bei der Probenvorbereitung, dem Laden von Proben und der Durchführung von Analysen auf dem kapillarbasierten Immunoassay-Instrument ProteinSimple Wes wohl fühlen. Wenn Sie dieses Verfahren beherrschen, kann der gesamte Lauf in drei Stunden mit 25 Samples durchgeführt werden. Bei der Analyse eines Laufs ist es wichtig, eine Qualitätskontrolle für jede Kapillare und Probe durchzuführen.

Dazu gehört auch die Überprüfung von Fluoreszenzstandards in einer biotinylierten Leiter. Werden Peaks falsch identifiziert, sollte die Analysesoftware hauptsächlich dazu verwendet werden, korrekte Peaks zu identifizieren und falsch identifizierte Peaks zu eliminieren. Wie bei allen molekularbiologischen Techniken im Labor sollten Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, um sich und Ihre Proben zu schützen.

Dazu gehören Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille und geschlossene Schuhe. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Optimierung für jedes neue Messobjekt oder für die Verwendung verschiedener Probenquellen durchgeführt werden sollte. Zu den Validierungs- und Nachverfolgungsschritten gehört die Bewertung der Antikörperspezifität und des Antikörpersignals anhand von gereinigten Proteinen oder Epitopen.

Testen des dynamischen Bereichs des Assays unter Verwendung einer Reihe von Probenverdünnungen und Optimieren der Antikörperverdünnung durch Bewertung der Signalsättigung über einen Antikörperkonzentrationsbereich. Nach der Optimierung sollte dieses Kapillarimmunverfahren im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wie dem Western Blot eine schnellere und quantitativere Methode zur Messung des Zielproteins biologischer Proben bieten.