Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in Drosophila Larven

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die thermische Nozizeption in Drosophila-Larven zu testen. Dies wird durch die Ernte von Drosophila-Larven erreicht, um sie anschließend schädlichen thermischen Reizen auszusetzen. In einem optionalen zweiten Schritt können die Larven mit UV-Strahlung bestrahlt werden, was zu Gewebeschäden und thermischer nozizeptiver Sensibilisierung führt. Die nächste Larve kann lokal mit einer Wärmesonde oder global mit einer Heizplatte untersucht werden, um nozizeptive Reaktionen zu provozieren, die quantitativ gemessen werden können.

Die Wärmesonde zeigt, dass die Larven eine Obergrenze für die nozizeptive Reaktion auf Hitze haben, und eine überraschende Beziehung zwischen der Eingangstemperatur und der Amplitude der provozierten Reaktion. Der Heizplatten-Assay zeigt, dass Larven eine stereotype Abfolge von nozizeptiven Verhaltensweisen aufweisen, die von der Temperatur des umgebenden Wassers und der Aktivität der nozizeptiven sensorischen Neuronen abhängen. Die hier beschriebenen Methoden können helfen, Schlüsselfragen im Bereich der thermischen Nozizeption zu beantworten, z. B. reagieren Tiere unterschiedlich auf schädliche thermische Reize, die entweder lokal oder global präsentiert werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu mit dem Wärmesonden-Assay vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Beherrschung des Assays Übung erfordert, um Schwankungen des Drucks, der Position und des Leitwinkels der angewendeten Sonde zu minimieren. Die visuelle Demonstration des Heizplatten-Assays ist von entscheidender Bedeutung. Denn Verhaltensweisen, die mit steigender Temperatur hervorgerufen werden, müssen gesehen werden, um am besten gewürdigt zu werden. Um genügend Nachkommenlarven eines definierten Genotyps von Interesse zu erhalten, züchten Sie den gewünschten Bestand direkt oder kreuzen Sie sie in Flaschen mit Fliegenfutter mit 20 bis 30 jungfräulichen Weibchen und 15 bis 20 Männchen fünf Tage nach der Eiablage und reinigen Sie die Larven des frühen dritten Stadiums, indem Sie das matschige Fliegenfutter ausschöpfen und mit sanft fließendem Wasser durch ein Netz von 630 Mikrometern Porengröße abseihen. Ein kleines, feuchtes Kissen mit Lebensmitteln, um Hunger und Austrocknung zu verhindern.

Nachdem Sie eine Zulassungskammer gebaut haben, verwenden Sie eine Pinzette oder einen Pinsel, um 10 Larven des frühen dritten Stadiums vorsichtig an der Innenseite des Deckels entlang zu platzieren und zu schließen. Die Autorisierungskammer wurde in einem Abzug in ein Kupplungsglas gelegt, in dem sich ein 10-Milliliter-Becherglas befand, in dem sich ein Wattebausch befand, der mit 1,5 Millilitern Dathylether getränkt war. Schrauben Sie den Deckel des Coplan-Glases auf, um die Larven zwei bis 2,5 Minuten lang Ätherdämpfen auszusetzen.

Entfernen Sie nach der e-Autorisierung die e-Autorisierungskammer aus dem Coplan-Behälter und lassen Sie sie einige Sekunden in der Haube verbringen, damit sich alle verbleibenden Ätherdämpfe ableiten können. Spülen Sie die Larven mit einer Wasserspritzflasche vorsichtig aus der Zulassungskammer in eine kleine Petrischale. Tupfen Sie die betäubten Larven trocken und befestigen Sie sie dann vorsichtig mit der Rückenseite nach oben auf einem Streifen doppelseitigem Klebeband, das Sie an einem drei mal 1 Zoll großen Glasobjektträger befestigen.

Legen Sie den Objektträger auf die Unterseite einer UV-Bestrahlungskammer und setzen Sie die Larven sechs Sekunden lang UV-Licht mit einer Intensität von 20 Millijoule pro Quadratzentimeter aus. Tauchen Sie den Objektträger nach der Bestrahlung in Wasser, um die Larven vorsichtig vom doppelseitigen Klebeband zu entfernen. Platzieren Sie die bestrahlten Larven mit einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig in einem 15 mal 45 Millimeter großen Feld.

Ein Dram-Glaskulturfläschchen mit einem Milliliter Fliegenfutter, das acht bis 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius oder der gewünschten Kulturtemperatur regeneriert wird, bevor es wieder aufgenommen wird. Bei thermischen Nozizeptionsassays wird zunächst die Temperatur der thermischen Sonde auf den gewünschten Sollwert voreingestellt. Setzen Sie eine einzelne Larve mit einem Pinsel oder einer Pinzette vorsichtig auf eine flache Plattform, wobei Sie darauf achten, dass die Larven von einem dünnen Wasserfilm bedeckt sind.

Um die Druckschwankungen zu minimieren und die richtige Position und den richtigen Winkel der Wärmesonde zu gewährleisten, macht die Übung perfekt. Drücken Sie die Sondenspitze vorsichtig gegen die Larven bei Segment A vier, wobei Sie mit der Spitze in einem Winkel von etwa 45 Grad zwischen der Sonde und der Oberfläche der Larven leichten Druck ausüben. Der Druck sollte eine leichte Vertiefung auf der Oberfläche der Larven verursachen und reicht in der Regel aus, um die Fortbewegung zu verhindern.

Die Stimulation der Larven wird fortgesetzt, bis eine Entzugsreaktion auftritt oder bis der 22. Cutoff erreicht ist. Reagierende Larven zeigen typischerweise zunächst ein vorläufiges Verhalten des Anhebens von Kopf und Schwanz, gefolgt von dem Rückzugsverhalten eines Rollens von mindestens 360 Grad. Sobald das Abhebungsverhalten eingeleitet wurde, lösen Sie den Kontakt mit der Sonde und notieren Sie die Latenz oder die Zeit, die für die Abhebung benötigt wird.

Wenn innerhalb von 20 Sekunden kein Entzugsverhalten beobachtet wird, handelt es sich bei der Larve um einen Non-Responder. Positionieren Sie die faseroptischen Lichtleiter so, dass eine ausreichend kontrastreiche Beleuchtung vorhanden ist. Um die Larven zu betrachten, legen Sie den Heizblock mit der flachen Oberfläche nach oben in die Heizplatte und setzen Sie dann die Heizplatte auf den Mikroskopfuß.

Schalten Sie die Heizplatte auf die hohe Stufe ein und warten Sie ca. 15 Minuten, bis sich die Temperatur bei 95 Grad Celsius stabilisiert hat. Messen Sie 80 Mikroliter destilliertes Wasser ab und geben Sie den Wassertropfen mit einer Mikropipette in die Mitte einer 60 x 15 Millimeter großen Petrischale aus Styropor. Setzen Sie mit einer Pinzette vorsichtig eine saubere Larve aus dem mittleren Drittel des Stadiums in die Mitte des Wassertropfens ein und führen Sie so wenig zusätzliches Wasser wie möglich ein.

Stellen Sie die Petrischale vorsichtig auf den festen Heizblock auf der Heizplatte. Stellen Sie die Position der Schale schnell so ein, dass die gesamte Larve und der Wassertropfen sichtbar sind. Starten Sie den Timer.

Im Moment wird die Petrischale auf den festen Heizblock der Heizplatte gestellt und zeichnet den Zeitpunkt des Beginns jedes Verhaltens auf. Fünf. Stereotype Bewegungsverhalten werden beobachtet, wenn die in Wasser getauchte Larve auf die Heizplatte übertragen wird. Das normale Verhalten in Abwesenheit von Wärme beinhaltet die Fortbewegung des Sonnenschirms, begleitet von suchenden Kopfbewegungen.

Als nächstes kann es zu einem Kopfschlagverhalten kommen, bei dem die Larve ihren Kopf schnell in einer Vorwärts- oder Seitwärtsbewegung bewegt. Diese Bewegung ähnelt ihrer normalen Fortbewegung im Wasser, erfolgt aber ruckartiger und ausdauernder rollend. Das Verhalten tritt auf, wenn die Larve mindestens 360 Grad seitlich rollt.

Dies kann unterschiedlich oft vorkommen und beinhaltet manchmal unvollständige Rollen. Um das Verhalten zu bewerten, zählen Sie nur volle 360-Grad-Rollen. Dieses Verhalten ist der Szene mit der lokalen Anwendung der Wärmesonde während des Peitschenverhaltens am ähnlichsten.

Die Larve zeigt schnelle Kontraktionsbewegungen, die den Kopf sehr kurz in die Nähe des Schwanzes bringen. Das Auspeitschen wird oft in schneller Folge, zwei oder gleichzeitig mit dem Rollen beobachtet. Schließlich zeigt die Larve ein Anfallsverhalten, oft gefolgt von Lähmungen. Während des Anfallsverhaltens streckt sich die Larve entlang der hinteren Achse der Interop aus und zeigt einen hochfrequenten Ganzkörper.

Schüttelverhalten ohne Biegelähmung tritt auf, wenn die Larven ihre Bewegung einstellen Bei einigen Larven ist dies dauerhaft, während andere dann eine niederfrequente Pulsationsbewegung zeigen. In diesem Diagramm der prozentualen Responder, die zu jeder Kategorie gehören, gibt es eine Obergrenze für die thermische Nozizeptionsreaktion der Larven. Im Wärmesonden-Assay sind 100 % der Larven bis zu einer Sondentemperatur von 52 Grad Celsius schnell ansprechend.

Bei 54 Grad Celsius und mehr reagieren jedoch 90 % oder mehr der Larven auch nach 20 Sekunden Kontakt nicht. Obwohl sich diese Larven nach dem 22. Cutoff weiter bewegen, kann auch die Anzahl der Rollen oder die Zeit, die im Aversionsentzugsverhalten verbracht wurde, gemessen und dargestellt werden. Überraschenderweise scheint es eine umgekehrte Beziehung zwischen der Eingangstemperatur der Sonde und der Robustheit der Reaktion zu geben, da niedrigere Temperaturen eine höhere Anzahl von Rollen zu provozieren scheinen.

Fünf stereotype Bewegungsverhaltensweisen werden beobachtet, wenn die in Wasser getauchte Larve auf die Heizplatte übertragen wird. Die durchschnittlichen Latenzen, bei denen diese Verhaltensweisen beobachtet werden, sind hier dargestellt, ebenso wie die durchschnittlichen Wassertropfentemperaturen, die für jede Latenz unter den hier vorgestellten optimalen Assay-Bedingungen gemessen wurden. Der Prozentsatz der Larven, die jedes unterschiedliche Verhalten zeigten, reichte von 77 bis 100 %, obwohl gelegentlich das Roll- und Peitschenverhalten weggelassen werden, sich überlappen oder in umgekehrter Reihenfolge auftreten. Hier ist der Prozentsatz der Larven dargestellt, die nach Beginn des Lähmungsverhaltens im Heizplatten-Assay überlebt haben. Die Larven wurden bis zur Lähmung erhitzt und dann unter Standardkulturbedingungen gebracht, um sich zu erholen.

Die scheinbehandelten Larven erhielten eine gleichwertige Behandlung, mit Ausnahme der Hitzeeinwirkung, und die Bildung von PSA bei lebensfähigen Erwachsenen war an den Tagen sieben bis 13 quantitativ. Hier steuert MD G vier die Expression von UAS-regulierten Transgenen in allen vier Klassen multidendritischer peripherer sensorischer Neuronen. UAS oder ein Delta C exprimiert eine modifizierte Version des Drosophila-Kaliumkanals mit offenem Gleichrichter, der für die synaptische Übertragung erforderlich ist, und UAS oder ein Delta NC exprimiert eine weitere modifizierte Version desselben Kanals, die die synaptische Übertragung nicht beeinträchtigt.

Es ist zu beachten, dass nur Larven, die sowohl den MD GALF 4-Treiber als auch das UAS ORC ein Delta C-Transgen tragen, bei vier der fünf beobachteten Verhaltensweisen erhöhte Latenzen aufweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl lokale als auch globale Reaktionen von gentechnisch veränderten Innereienlarven auf schädliche thermische Reize messen können. Diese Verfahren können mit anderen Methoden wie der genetischen Analyse kombiniert werden, um die Gene zu identifizieren, die für die thermische Nozizeption erforderlich sind. Beim Versuch des Wärmesonden-Assays ist es wichtig, daran zu denken, die Variation und den Druck, den Ort und den Kontaktwinkel der Sonde zu minimieren.