Name: Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in Drosophila Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Lernen Sie lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in Drosophila-Larven. Diese Techniken ermöglichen die Quantifizierung von Schmerzreaktionen und Verhaltensantworten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Christian Landry für Hitze-Sonde Design, Daniel Babcock für die Entwicklung der Larven-Wärme-Sonde Assay, Sean Sweeney für die Annahme, die Hitze Platten-Assay, der Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegenfischer Aktien und Galko Labor Mitglieder für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH R01 NS069828 zu MJG und einem NIH-MARC-U-STAR Training Grant (T34GM079088 an der University of Houston-Downtown Scholars Akademie) für den Zugang von Minderheiten, die wissenschaftliche Laufbahn (AVG) unterstützt.

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Assays können die hier beschriebenen verwendet werden, um qualitativ und quantitativ beurteilen Larven verschiedener Genotypen für das Ansprechen auf schädliche thermische Reize werden. Ein wesentliches Merkmal der Wärmesonde Test ist, dass der Reiz nur an einem einzigen Ort gegeben ist. Dies führt vermutlich zu Brennen nur einen kleinen Teil der Klasse IV-Neuronen diejenigen des Segments der Sonde in Kontakt gebracht und vielleicht die in unmittelbar benachbarten Segmenten 11. Aufgrund der lokalen Stimulation, ahmt die Hitze-Sonde Assay das gemeinsame sinnliche Erfahrung zum Nachweis eines schädlichen Reiz, die einer bestimmten Körperregion-wie eine Hand in Kontakt bringen einer heißen Herdplatte lokalisiert ist. Ein Nachteil der Wärmesonde Test ist, dass es einige Benutzer-zu-Benutzer-Variabilität, die wahrscheinlich drei Faktoren zurückzuführen ist: i) der Druck, mit dem der Benutzer gilt die Sonde in die Larve, ii) die genaue Position der Sonde auf der Larven zu den darunter liegenden nozizeptiven Neuronen, und iii) die genaue ANGle, bei der die Sonde die Oberfläche berührt der Larve. Wir zuvor berichteten über eine quantitative Strategie zur Kategorisierung Larven in nicht-Respondern, langsam Responder und schnelle Ansprechen auf ihren Wegziehlatenz auf eine bestimmte Temperatur 1 umfassen. Wir berichten hier über Larven Reaktionsfähigkeit auf noch höhere Temperaturen. Interessanterweise finden wir, dass es eine Decke, um Larven thermische nozizeptive Antworten und dass diese Obergrenze liegt zwischen 52 und 54 ° C. Dies deutet darauf hin, dass Larven besitzen keine transient receptor potential (TRP) befähigten Kanals Gating bei Temperaturen höher als 52 ° C Alternativ könnte es nahe, dass die Nervenzellen oder Muskeln verwendet zu initiieren oder durchführen die motorische Reaktion beschädigt werden, bevor sie überhaupt in aversiven Rückzug funktionieren kann. Wir berichten auch über eine andere Analyse der Amplitude des Entzugserfolges-entweder die Anzahl der Rollen als Indikator für die &quot;Robustheit&quot; der Antwort. Naiv, einwürde erwarten, dass diese Parameter würden mit zunehmender Temperatur oder Zeit der Stimulation zu erhöhen. Überraschenderweise finden wir, dass dies nicht der Fall ist. Larven für eine längere Zeit bei einer Temperatur am unteren Ende des schädlichen Bereich (42 ° C) stimuliert für mehr Walzen und mehr Zeit für die Walzen als Larven bei höheren Temperaturen (48-52 ° C) sondiert. Dies deutet darauf hin, dass innerhalb des schädlichen Temperaturfenster es in erster Linie ist die Dauer der Exposition, die die Amplitude der Reaktion bestimmt. Da Larven zu hoch schädlichen Temperaturen ausgesetzt sind (48-52 ° C) im Durchschnitt sehr schnell reagieren, sie haben nicht so viele Rollen als Larven ausgesetzt zu einer weniger schädlichen Temperatur für eine längere Zeitspanne aufweisen. Die Analyse der Reaktion Amplitude berichtet hier fügt eine weitere quantitative Dimension, entlang der verschiedenen Genotypen oder Umwelt-Manipulationen verglichen werden können. Ein Hauptmerkmal der Hitze Platten-Assay ist, dass es eine globale Exposition gegenüber dem schädlichen beinhaltetWärme. Als solches ist es eher dem Tier sitzt in einem Heiz-Kessel als Berühren einer heißen Herdplatte. Es ist zwar nicht klar, wann die Larven einen global schädlichen Reiz in freier Wildbahn erleben kann, im Labor die Verhaltensreaktionen auf diese globale Exposition sind komplexer als diejenigen auf lokaler Stimulation beobachtet. Eine Stärke des Wärme-Platten-Assay, auch von anderen 3 notiert haben, ist, dass es wenig User-to-User-Variabilität hat seit Berühren der Larve ist nicht Bestandteil des Protokolls. Der einzige wesentliche Abweichung scheint bei der Definition, wenn jedes Verhalten beginnt, und dies kann bei wiederholter Betrachtung / Vertrautheit minimiert werden kann. Ein interessanter Unterschied zwischen den Tests ist die Temperaturen, bei denen die aversive Verhaltensweisen beginnen. Dies sind deutlich niedriger in der Hitze Platten-Assay als mit der Hitze-Sonde. Das vorläufige Verhalten von Larven mit der Hitze-Sonde (Kopf und Schwanz raise) kontaktiert ausgestellt kann eine des Kopfes Thrash bei ~ 27 ° C in der Hitze Plattform beobachtet korrelieren seinE-Assay. Es ist möglich, dass diese Antwort &quot;Unbehagen&quot; über &quot;Schmerz&quot; widerspiegelt. Wir haben keine der Auspeitschung, Beschlagnahme korrelieren, und auch bei hohen Lähmungen beobachtet werden (bis zu 48 ° C) Temperaturen in den Hitze-Sonde Assay und es kann sein, dass eine kritische Masse an sensorischen Neuronen feuern aus mehr als einer Region des Körpers ist erforderlich, um auf diese Verhaltensweisen zu bringen. Unterhalb des unteren Endes des nozizeptiven Schwelle mit der Hitze-Sonde zeigt, dass globale Stimulation kann es sich um Addition von neuronalen Reaktionen, die nicht ausreichen, um das Verhalten mit den lokalen auslösen beobachtet - Interessanterweise werden die Beschlagnahme und die Lähmung Verhaltensweisen bei Temperaturen (37 ° C ~ 34) beobachtet Anwendung der Wärme-Sonde. Dass diese Temperaturen werden tatsächlich als schädlich für die Larven wahrgenommen wird durch die Beobachtung, dass Larven, die die Lähmung Verhalten beginnen und anschließend dürfen auf Fly Lebensmittel nicht wieder in den meisten Fällen nicht (5C) überleben unterstützt. Weitere unterstützende das Argument, dass die Wärme plgegessen Assay wird Auslesen nocizeptiven Reaktionen ist die Tatsache, dass die Blockierung der synaptischen Übertragung in bekannter nozizeptiven sensorischen Neuronen verlangsamt die Reaktion meisten der beobachteten Verhalten (Abbildung 6). Die Beobachtung, dass es keine Erhöhung der Latenz für die höhere Temperatur-Verhalten legt nahe, dass Auspeitschen anderen sensorischen Neuronen, die nicht exprimieren, MD-Gal4 für dieses Verhalten kann erforderlich sein. In der Summe umfassen beide Assays Belichten eines einzelnen Larve zu einer schädlichen thermischen Reiz des definierten Temperatur - die heiße Spitze eines kleinen Metall-Sonde in der lokalen Assay und das Eintauchen in einen Tropfen Wasser erwärmt sich schnell in der globalen Assay. Verhaltensreaktionen von Drosophila-Larven von unterschiedlichen genetischen Hintergrund und / oder ausgesetzt wechselnden Umgebungsbedingungen (zum Beispiel plus oder minus Gewebeschädigung), können studiert und quantifiziert werden unter Verwendung dieser Assays. Letztlich werden die Ergebnisse aus diesen Tests helfen uns besser zu verstehen, genetische Netzwerke Controlling nociception bei Drosophila und anderen verwandten Arten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Thermische Sonde </td><td> Pro-Dev Technik </td><td> Auf Anfrage Custom-gebaut </td><td> Kontaktinformationen finden Sie auf Anfrage bereitgestellt werden </td></tr><tr><td> Trockenbad Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> 1 feste Heizblock und 1 Heizblock mit 16mm Bohrungen </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Farbkamera </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Eine äquivalente Kamera zu tun. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> Teilenummer für MZ6 Zoom Körper (Optikträger) ist 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Einheit </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Dual-Schwanenhals 23-Zoll-Lichtleitkabel </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Thermal Control Unit </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Einzelheiten können auf Anfrage geliefert werden </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000-Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Eine äquivalente Mikroskoptun wird. </td></tr><tr><td> Zange </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> 1mm Maschenweite </td><td> Genesee Scientific </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pinsel </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Vernetzer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Färbetrog </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> 10ml Becherglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 x 10 mm Petrischale aus Polystyrol </td><td> Falke </td><td> 351008 </td><td> Wir haben noch nicht getestet Alternative Gerichte. </td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Thermoelement </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Stück Vinyl </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Scientific DenvilleInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

lokale und globale methoden zur beurteilung der thermischen nozizeption in<em&gt; drosophila</em&gt; larven

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In diesem Artikel zeigen wir, Assays, um thermische Nozizeption in Drosophila-Larven zu studieren. Ein Test umfasst die räumlich begrenzten (lokalen) Stimulation von Nozizeptoren thermische 1,2, während die zweite besteht aus einem Großhandel (globale) Aktivierung der meisten oder alle diese Neuronen 3. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken Visualisierung und Quantifizierung der Verhaltens-Funktionen von Drosophila nozizeptiven sensorischen Neuronen. Die Drosophila-Larve ist ein etabliertes Modellsystem, um die thermische Nozizeption, eine sensorische Reaktion auf potenziell schädlichen Temperaturen, die evolutionär über Artgrenzen 1,2 konserviert ist zu studieren. Die Vorteile von Drosophila für solche Studien sind die relative Einfachheit des Nervensystems und der Raffinesse der genetischen Techniken, die verwendet werden, um die molekulare Basis der zugrunde liegenden Biologie 4-6 in Drosophila sezieren kann, wie in allen Metazoen, die Response auf schädliche thermische Reize im Allgemeinen eine &quot;nozifensiven&quot; aversive Rückzug dem präsentierten Stimulus 7. Solche Impulse werden durch freie Nervenenden oder Nozizeptoren erkannt und die Amplitude des Organismus-Reaktion hängt von der Anzahl von Nozizeptoren Empfangen des schädlichen Reiz 8. Bei Drosophila sind es die Klasse IV dendritischen Verzweigungen sensorischen Neuronen, die schädliche thermische und mechanische Reize 9 erkennt zusätzlich zu ihrer Rolle als kürzlich entdeckten Photorezeptoren 10. Diese Neuronen, die sehr gut sind bei der Entwicklungsstufe studierte, über die Barriere epidermale Blatt verzweigen und Kontakte mit fast allen Epidermiszellen 11,12. Die einzelnes Axon jeder Klasse IV Neuron Projekte in den Bauchmark des zentralen Nervensystems 11, wo sie zu Neuronen zweiter Ordnung herstellen kann, dass Projekt an das Gehirn. Unter Ausgangsbedingungen, nozizeptiven sensorischen neurons wird erst ausgelöst, wenn ein relativ hoher Schwellenwert erreicht ist. Die beschriebenen Tests hier nehmen die Ermittler zu den Ausgangswerten Verhaltensreaktionen oder vermutlich die Sensibilisierung, die folgenden Gewebeschädigung erfolgt. Quantifizieren Jeder Test provoziert unterschiedliche, aber miteinander Bewegungsapparates Verhaltensreaktionen auf schädliche thermische Reize und ermöglicht die Forscher zu visualisieren und quantifizieren verschiedene Aspekte der thermischen Nozizeption in Drosophila-Larven. Die Tests können zu Larven der gewünschten Genotypen oder Larven unter verschiedenen Umweltbedingungen, die Nozizeption beeinflussen könnten erhoben angewendet werden. Da die thermische Nozizeption über Arten konserviert wird, werden die Erkenntnisse aus der genetischen Dissektion bei Drosophila gewonnenen wahrscheinlich informieren unser Verständnis der thermischen Nozizeption bei anderen Arten, einschließlich Wirbeltieren.

In diesem Artikel zeigen wir, Assays, um thermische Nozizeption in studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven. Ein Test umfasst die räumlich begrenzten (lokalen) Stimulation der thermischen Nozizeptoren<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Während die zweite besteht aus einem Großhandel (globale) Aktivierung der meisten oder alle diese Neuronen<sup&gt; 3</sup&gt;. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken Visualisierung und Quantifizierung der Verhaltens-Funktionen<em&gt; Drosophila</em&gt; Nozizeptiven sensorischen Neuronen.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In diesem Artikel demonstrieren wir Assays zur Untersuchung der thermischen Nozizeption in Drosophila-Larven. Ein Assay umfasst die räumlich begrenzte (lokale) Stimulation von ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die thermische Nozizeption bei Drosophila-Larven zu untersuchen. Dazu werden Drosophila-Larven gewonnen und anschließend optional schädlichen thermischen Reizen ausgesetzt. Die Larven können mit UV-Licht bestrahlt werden, was zu Gewebeschäden und einer sensibilisierten thermischen Nozizeption führt. Anschließend können die Larven entweder lokal mit einer Hitzespitze oder global mittels einer Heizplatte stimuliert werden, um nozizeptive Reaktionen hervorzurufen, die quantitativ gemessen werden können. Die Hitzeprobe zeigt, dass Larven eine obere Grenze für die nozizeptive Reaktion auf Hitze aufweisen und eine überraschende Beziehung zwischen der Eingangstemperatur und der Amplitude der ausgelösten Reaktion besteht. Der Hitzeteller-Assay zeigt, dass Larven eine stereotypisierte Abfolge nozizeptiver Verhaltensweisen zeigen, die von der Temperatur des umgebenden Wassers und der Aktivität der nozizeptiven Sinnesneuronen abhängt. Die hier beschriebenen Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der thermischen Nozizeption zu beantworten, beispielsweise, ob Tiere unterschiedlich auf schädliche thermische Reize reagieren, je nachdem, ob diese lokal oder global präsentiert werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu im Hitzesonden-Assay sind, Schwierigkeiten, da die Beherrschung des Assays Übung erfordert, um die Variation in Druck, Position und Anwinkelung der verwendeten Sonde zu minimieren. Die visuelle Demonstration des Hitzetisch-Assays ist entscheidend, da die durch steigende Temperaturen hervorgerufenen Verhaltensweisen gesehen werden müssen, um richtig eingeschätzt zu werden. Um eine ausreichende Anzahl an Nachkommen-Larven eines definierten Genotyps von Interesse zu erhalten, züchten Sie den gewünschten Stamm direkt oder setzen Sie Kreuzungen in Flaschen mit Fliegenfutter an, wobei Sie 20 bis 30 jungfräuliche Weibchen und 15 bis 20 Männchen verwenden. Fünf Tage nach der Eiablage ernten und reinigen Sie frühzeitige Larven im dritten Instar, indem Sie das weiche Fliegenfutter ausschöpfen und mit fließendem Wasser durch ein Sieb mit einer Porengröße von 630 Mikron abspülen. Überführen Sie die frühzeitigen Larven im dritten Instar auf ein kleines, feuchtes Futterkissen, um Verhungern und Austrocknung zu verhindern.Nachdem eine Betäubungskammer hergestellt wurde, mit einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig 10 Larven im frühen dritten Larvenstadium entlang der Innenseite des Deckels platzieren und schließen. In einem Abzug arbeitend, die Betäubungskammer in ein Verbindungsglas stellen, das einen 10-Milliliter-Becher enthält, in dem ein Wattebausch mit 1,5 Millilitern Diethylether getränkt ist. Den Deckel des Verbindungsglases zuschrauben, um die Larven zwei bis 2,5 Minuten lang den Dampfen von Diethylether auszusetzen.Nach der Betäubung entfernen Sie die Betäubungskammer aus dem Coplan-Gefäß und lassen sie einige Sekunden im Abzug, damit eventuelle Restdämpfe von Äther abklingen können. Spülen Sie die Larven vorsichtig mit einer Wasser-Sprühflasche aus der Betäubungskammer in eine kleine Petrischale. Trocknen Sie die betäubten Larven leicht ab und befestigen Sie sie dann vorsichtig dorsal nach oben auf einen Streifen doppelseitigen Klebeband, der auf einer drei Zoll mal ein Zoll großen Glasobjektträger befestigt ist.Platzieren Sie den Objektträger auf der unteren Fläche einer UV-Bestrahlungskammer und bestrahlen Sie die Larven sechs Sekunden lang mit UV-Licht bei einer Intensität von 20 Millijoule pro Quadratzentimeter. Nach der Bestrahlung tauchen Sie den Objektträger in Wasser, um die Larven vorsichtig von dem doppelseitigen Klebeband abzulösen. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel die bestrahlten Larven vorsichtig in eine 15 mal 45 Millimeter große Petrischale überführen.Einemrams-Glaskulturkolben mit einem Milliliter Fliegenfutter, um acht bis 24 Stunden bei 25 Grad Celsius oder der gewünschten Kulturttemperatur zur Wiederherstellung vor der erneuten Beherbergung. Für thermische Nocizeptions-Assays zuerst die Temperatur der thermischen Sonde auf den gewünschten Sollwert einstellen. Mit einem Pinsel oder einer Pinzette eine einzelne Larve vorsichtig auf eine flache Plattform übertragen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Larve von einem dünnen Wasserfilm bedeckt ist.Um die Variation des Drucks zu minimieren und gleichzeitig die korrekte Position sowie den richtigen Winkel der Hitzesonde sicherzustellen, ist Übung der Schlüssel zum Erfolg. Drücken Sie die Sonde vorsichtig gegen die Larve im Segment A4 und üben Sie dabei leichtem Druck mit der Spitze in einem Winkel von etwa 45 Grad zwischen Sonde und Oberfläche der Larve aus. Der Druck sollte eine leichte Delle an der Oberfläche der Larve verursachen und in der Regel ausreichen, um die Fortbewegung zu verhindern.Setzen Sie die Stimulation der Larven fort, bis eine Rückzugsreaktion auftritt, oder bis der 22. Ausschaltzeitpunkt erreicht ist. Reagierende Larven zeigen typischerweise zunächst ein vorbereitendes Verhalten, bei dem sie Kopf und Schwanz anheben, gefolgt von dem Rückzugsverhalten, bei dem sie sich mindestens 360 Grad rollen. Sobald das Rückzugsverhalten eingeleitet wurde, lösen Sie den Kontakt zum Probierstab und notieren Sie die Latenzzeit oder die zum Rückzug benötigte Zeit.Wenn innerhalb von 20 Sekunden kein Wegzugsverhalten beobachtet wird, gilt die Larve als Nicht-Responder. Positionieren Sie die Lichtleiter der Glasfaser, um eine ausreichende Beleuchtung mit hohem Kontrast sicherzustellen. Um die Larven zu betrachten, setzen Sie den Heizblock mit der flachen Seite nach oben auf die Heizplatte und stellen Sie anschließend die Heizplatte auf das Mikroskoptisch-Grundgestell.Schalten Sie die Heizplatte auf die hohe Stufe ein und warten Sie etwa 15 Minuten, bis sich die Temperatur bei 95 Grad Celsius stabilisiert hat. Messen Sie 80 Mikroliter destilliertes Wasser ab und geben Sie den Wassertropfen mit einer Mikropipette in die Mitte einer 60 mal 15 Millimeter großen Petrischale aus Polystyrol. Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette vorsichtig eine saubere Larve des mittleren Dritts der dritten Instar in die Mitte des Wassertropfens, wobei möglichst wenig zusätzliches Wasser hinzugefügt werden sollte.Stellen Sie die Petrischale vorsichtig auf den festen Heizblock des Heizgeräts. Passen Sie die Position der Schale schnell so an, dass die gesamten Larven und der Wassertropfen im Sichtfeld liegen. Starten Sie die Stoppuhr. Zurzeit wird die Petrischale auf den festen Heizblock der Heizplatte gestellt und der Zeitpunkt des Auftretens jedes Verhaltens wird aufgezeichnet. Fünf. Stereotype Fortbewegungsverhaltensweisen werden beobachtet, nachdem die in Wasser befindliche Larve auf die Heizplatte übertragen wurde. Normales Verhalten in Abwesenheit von Wärme umfasst die Parasol-Fortbewegung, begleitet von suchenden Kopfbewegungen.Das Verhalten des Kopfschlagens kann danach auftreten, wenn die Larve ihren Kopf schnell in Vorwärts- oder Seitenrichtung bewegt. Diese Bewegung ähnelt ihrer normalen Fortbewegung im Wasser, erfolgt jedoch ruckartiger und geht mit einer anhaltenden seitlichen Rolle einher. Das Verhalten tritt auf, wenn die Larve sich seitlich um mindestens volle 360 Grad dreht.Dies kann eine variable Anzahl von Malen auftreten und manchmal unvollständige Rollen beinhalten. Für die Bewertung des Verhaltens zählen Sie nur volle 360-Grad-Rollen. Dieses Verhalten ähnelt am meisten der Szene mit lokaler Anwendung der Hitzesonde während des Peitschverhaltens.Die Larve zeigt schnelle Kontraktions- und Entspannungsbewegungen entlang der anteroposterioren Achse, wodurch der Kopf kurzzeitig der Nähe des Schwanzes kommt. Peitschenbewegungen werden oft in schneller Abfolge beobachtet, manchmal gleichzeitig mit Rollbewegungen. Schließlich zeigt die Larve Anfälle, denen häufig eine Lähmung folgt. Während des Anfalls streckt sich die Larve entlang der anteroposterioren Achse und zeigt eine hochfrequente Ganzkörperbewegung.Ein Zitterverhalten ohne Biegeparalyse tritt auf, wenn die Larven ihre Bewegung einstellen. Bei einigen Larven ist dies dauerhaft, während andere anschließend eine pulsierende Bewegung mit geringer Frequenz zeigen. In dieser Darstellung des Prozentsatzes der Reagierenden in jeder Kategorie zeigt sich eine Obergrenze der larvalen thermischen Nociceptionsreaktion. Im Hitzesonden-Test reagieren 100 % der Larven schnell, und zwar bis zu einer Sondentemperatur von 52 Grad Celsius.Jedoch reagieren bei 54 Grad Celsius und höher 90 % oder mehr der Larven selbst nach 20 Sekunden Kontakt nicht. Obwohl diese Larven nach dem 22. Ausschaltvorgang weiterhin Bewegungen ausführen, können die Anzahl der Überschläge oder die Dauer des Aversionszuckverhaltens ebenfalls gemessen und dargestellt werden. Überraschenderweise scheint es eine umgekehrte Beziehung zwischen der Eingangstemperatur des Probes und der Robustheit der Reaktion zu geben, da niedrigere Temperaturen eine höhere Anzahl an Überschlägen hervorzurufen scheinen.Fünf stereotypische Fortbewegungsverhalten werden beobachtet, wenn die in Wasser eingetauchte Larve auf die Heizplatte übertragen wird. Die durchschnittlichen Latenzzeiten, zu denen diese Verhaltensweisen auftreten, sind hier dargestellt, ebenso wie die durchschnittlichen Wassertropfentemperaturen, die für jede Latenz unter den hier vorgestellten optimalen Testbedingungen gemessen wurden. Der Prozentsatz der Larven, die jeweils eindeutige Verhaltensweisen zeigten, lag zwischen 77 und 100 %. Obwohl gelegentlich die Roll- und Peitschverhalten ausbleiben, überlappen oder in umgekehrter Reihenfolge auftreten, ist hier der Prozentsatz der Larven angegeben, die nach Beginn des Lähmungsverhaltens im Heizplattenversuch überlebt haben. Die Larven wurden bis zur Lähmung erhitzt und anschließend in Standardkulturbedingungen zur Erholung überführt.Die mit Placebo behandelten Larven erhielten eine vergleichbare Behandlung, ausgenommen der Hitzeeinwirkung, und die Bildung von PPE in lebensfähigen Erwachsenen wurde am siebten bis dreizehnten Tag quantitativ erfasst. Hier treibt MD G vier die Expression von UAS-regulierten Transgenen in allen vier Klassen multi-dendritischer peripherer Sinnesneuronen an. UAS oder one delta C exprimiert eine modifizierte Version des offenen Gleichrichter-Kaliumkanals von Drosophila, der für die synaptische Übertragung erforderlich ist, und UAS orrc one delta NC exprimiert eine weiter modifizierte Version desselben Kanals, die die synaptische Übertragung nicht beeinträchtigt.Beachten Sie, dass nur Larven, die sowohl den MD-GAL4-Treiber als auch das UAS-ORC1-ΔC-Transgen tragen, bei vier der fünf beobachteten Verhaltensweisen verlängerte Latenzzeiten aufweisen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lokale und globale Reaktionen von GEs-Abfalllarven auf nozizeptive thermische Reize messen kann. Diese Verfahren können mit anderen Methoden wie der genetischen Analyse kombiniert werden, um Gene zu identifizieren, die für die thermische Nozizeption erforderlich sind. Bei der Durchführung des Wärmeprobe-Tests ist es wichtig, die Variationen bezüglich Druck, Position und Kontaktwinkel der Sonde möglichst gering zu halten.

local-global-methods-assessing-thermal-nociception-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir eine schnelle zuverlässige und einfache Verfahren, um die niedrigste Temperatur, bei der Ratten oder Mäusen zeigen nozifensiven Verhalten...

Schnelle Bestimmung der Wärmeleistung und nozizeptiven Grenzwerts bei diabetischen Ratten

Drosophila-Larven haben dedizierte sensorische Neuronen - Nozizeptoren -, deren Reaktion auf potenziell schädliche thermische Reize aversives – oder sogenanntes "nozifensives" – Verhalten im Tier auslöst. Dieses Video beschreibt eine Methode zur Beurteilung der thermischen Nozizeption durch Aufzeichnung des Larvenverhaltens als Reaktion auf die lokale Anwendung einer Wärmesonde auf die Nagelhaut. Diese Methode wird daher als lokaler Wärmesonden-Assay bezeichnet.

Lokaler Wärmesonden-Assay: Eine Methode zur Beurteilung der Nozizeption hoher Temperaturen bei Drosophila-Larven

Studien der neuronalen Morphogenese unter Verwendung von Drosophila Larven dendritischen arborization (da) Neuronen profitieren von in - situ - Visualisierung von neuronalen und epidermalen Proteine durch Immun. Wir beschreiben ein Verfahren, das durch Entfernen von Muskelgewebe aus der Larvenkörperwand Immunfluoreszenzanalyse von da Neuronen und die umliegenden Hautzellen verbessert.

Entfernung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelgewebe aus Larval Filets für Immunfluoreszenzanalyse von sensorischen Neuronen und epidermalen Zellen

Hier zeigen wir einen neuen Assay kalt Nozizeption in Drosophila - Larven zu studieren. Dieser Test verwendet eine speziell angefertigten Peltier Sonde, die eine Brenn schädliche Kältereiz Anwendung und führt zu einer quantifizierbaren kalt spezifischen Verhaltensweisen. Diese Technik wird weiter zelluläre und molekulare Präparation von kalter Nozizeption ermöglichen.

Neuartige Assay für kalte Nozizeption in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvae

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die bevorzugte Umgebungstemperatur von Drosophila -Larven mit einem kontinuierlichen Temperaturgefälle zu bestimmen.

Ein Temperaturgradient Assay thermische Präferenzen der Drosophila Larven bestimmen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um automatisch bestimmen die lokomotorische Leistung von Drosophila bei schwankenden Temperaturen mit einer programmierbaren temperaturgeführte Arena, die schnell und präzise Temperaturänderungen in Zeit und Raum produziert.

Eine automatisierte Methode zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit von Drosophila als Reaktion auf Temperaturänderungen in Raum und Zeit

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie ein verbesserter Test für mechanische Nociception in Drosophila Larven durchzuführen. Wir verwenden den Test hier, um zu zeigen, dass mechanische Überempfindlichkeit (Allodynie und Hyperalgesie) in Drosophila Larven existiert.

Ein verbesserter Assay und Werkzeuge zur Messung der mechanischen Nociception in Drosophila Larven

Die Beurteilung und Behandlung von Schmerzen bei Kindern ist schwierig, weil Säuglinge kann nicht mündlich berichten über ihre Erfahrungen. In diesem Video beschreiben wir quantitative elektrophysiologischen Methoden und Analysetechniken, die verwendet werden, um die Reaktion auf schädliche Ereignisse aus der Säugling Nervensystems gemessen werden kann.

Elektrophysiologische Messungen und Analyse von Nozizeption in Human Infants

Drosophila melanogaster ist eine genetisch und auf der Verhaltensebene praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet wurde, um die molekularen und zellulären Grundlagen von vielen wichtigen biologischen Prozessen seit über einem Jahrhundert ein zu verstehen. Drosophila wurde auch genutzt, um Einblicke in die genetischen Grundlagen der Fliege Verhalten zu gewinnen.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Eine Methode zur Immunfärbung und visualisieren Chordotonalorganen in Larven und Puppen...

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Lernen Sie lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in Drosophila-Larven. Diese Techniken ermöglichen die Quantifizierung von Schmerzreaktionen und Verhaltensantworten.

Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in

Weitere Videos entdecken