Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in Drosophila Larven

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die thermische Nozizeption bei Drosophila-Larven zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Drosophila-Larven geerntet und anschließend als optionaler zweiter Schritt nozizeptiven thermischen Reizen ausgesetzt werden. Die Larven können mit UV-Licht bestrahlt werden, was zu Gewebeschäden und einer sensibilisierten thermischen Nozizeption führt. Anschließend können die Larven entweder lokal mit einer Hitzesonde oder global mittels einer Heizplatte stimuliert werden, um nozizeptive Reaktionen hervorzurufen, die quantitativ gemessen werden können.

Die Hitzesonde zeigt, dass Larven eine Obergrenze für die nozizeptive Reaktion auf Hitze aufweisen und eine überraschende Beziehung zwischen der Eingangstemperatur und der Amplitude der ausgelösten Reaktion besteht. Der Hitzeplatte-Test zeigt, dass Larven eine stereotypisierte Abfolge nozizeptiver Verhaltensweisen zeigen, die von der Temperatur des umgebenden Wassers und der Aktivität der nozizeptiven Sinnesneuronen abhängt. Die hier beschriebenen Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der thermischen Nozizeption zu beantworten, beispielsweise, ob Tiere unterschiedlich auf schädliche thermische Reize reagieren, die entweder lokal oder global präsentiert werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu im Hitzesonden-Assay sind, Schwierigkeiten, da die Beherrschung des Assays Übung erfordert, um die Variationen in Druck, Lage und Anwinkelung der verwendeten Sonde zu minimieren. Eine visuelle Demonstration des Heizplatten-Assays ist entscheidend, da die durch steigende Temperaturen hervorgerufenen Verhaltensweisen gesehen werden müssen, um sie richtig einschätzen zu können. Um eine ausreichende Anzahl Nachkommen-Larven eines definierten Genotyps von Interesse zu erhalten, züchten Sie den gewünschten Stamm direkt oder richten Sie Kreuzungen in Flaschen mit Fliegenfutter ein, wobei Sie 20 bis 30 jungfräuliche Weibchen und 15 bis 20 Männchen verwenden. Fünf Tage nach der Eiablage ernten und reinigen Sie frühstadiige Larven des dritten Instars, indem Sie das weiche Fliegenfutter herausschöpfen und mit fließendem Wasser durch ein Sieb mit einer Porengröße von 630 Mikron abspülen. Überführen Sie die frühstadiigen Larven des dritten Instars auf ein kleines, feuchtes Futterpolster, um Verhungern und Austrocknung zu verhindern.

Nach dem Zusammenbau einer Betäubungskammer platzieren Sie mit einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig 10 Larven im frühen dritten Larvenstadium entlang der Innenseite des Deckels und schließen diesen. Arbeiten Sie in einem Abzug und stellen Sie die Betäubungskammer in ein Verbindungsglas, das einen 10-Milliliter-Becher enthält, in dem sich ein Wattebausch befindet, der mit 1,5 Millilitern Diethylether getränkt ist. Schrauben Sie den Deckel des Verbindungsglases fest, um die Larven zwei bis 2,5 Minuten lang den Dampfen des Äthers auszusetzen.

Nach der Eingabe der Genehmigung entfernen Sie die Genehmigungskammer aus dem Coplan-Gefäß und lassen Sie sie einige Sekunden im Abzug, damit restliche Etherdämpfe abziehen können. Spülen Sie die Larven vorsichtig mit einer Wasserwaschflasche aus der Genehmigungskammer in eine kleine Petrischale. Trocknen Sie die betäubten Larven ab und befestigen Sie sie dann vorsichtig mit der dorsalen Seite nach oben auf einem Streifen doppelseitig klebendem Tesafilm, der auf einer 7,6 cm mal 2,5 cm großen Glasobjektträger befestigt ist.

Legen Sie den Objektträger auf die untere Fläche einer UV-Bestrahlungskammer und bestrahlen Sie die Larven sechs Sekunden lang mit UV-Licht bei einer Intensität von 20 Millijoule pro Quadratzentimeter. Tauchen Sie nach der Bestrahlung den Objektträger in Wasser, um die Larven vorsichtig von dem doppelseitigen Klebeband abzulösen. Verwenden Sie eine Pinzette oder einen Pinsel, um die bestrahlten Larven vorsichtig in eine 15 mal 45 Millimeter große Petrischale zu überführen.

Eine dramgroße Kulturschale mit einem Milliliter Fliegenfutter, um die Probe acht bis 24 Stunden bei 25 Grad Celsius oder der gewünschten Kultivierungstemperatur zu regenerieren, bevor sie erneut beherbergt werden. Für thermische Nociceptions-Assays zunächst die Temperatur der thermischen Sonde auf den gewünschten Sollwert einstellen. Mit einem Pinsel oder einer Pinzette eine einzelne Larve vorsichtig auf eine flache Plattform übertragen und sicherstellen, dass die Larve von einem dünnen Wasserfilm bedeckt ist.

Um die Variation des Drucks zu minimieren und gleichzeitig die korrekte Position sowie den richtigen Winkel der Hitzesonde sicherzustellen, ist Übung entscheidend. Drücken Sie die Sonde vorsichtig gegen die Larve im Segment A4, wobei eine leichte Druckkraft mit der Sondenspitze in einem Winkel von etwa 45 Grad zwischen Sonde und Larvenoberfläche ausgeübt wird. Der Druck sollte eine leichte Delle an der Oberfläche der Larve verursachen und in der Regel ausreichen, um die Fortbewegung zu verhindern.

Setzen Sie die Stimulation der Larven fort, bis eine Rückzugsreaktion gezeigt wird oder bis der 22. Ausschlusswert erreicht ist. Reagierende Larven zeigen typischerweise zunächst ein vorläufiges Verhalten, bei dem sie Kopf und Schwanz anheben, gefolgt vom Rückzugsverhalten, bei dem sie sich mindestens 360 Grad drehen. Sobald das Rückzugsverhalten einsetzt, lösen Sie den Kontakt mit der Sonde und notieren Sie die Latenz oder die zum Rückzug benötigte Zeit.

Wenn innerhalb von 20 Sekunden kein Wegzugsverhalten beobachtet wird, gilt die Larve als Nicht-Responder. Positionieren Sie die faseroptischen Lichtleiter so, dass eine ausreichende Beleuchtung mit hohem Kontrast gewährleistet ist. Um die Larven zu betrachten, setzen Sie den Heizblock mit der flachen Seite nach oben auf die Heizplatte und stellen Sie anschließend die Heizplatte auf das Mikroskop-Grundgestell.

Schalten Sie die Heizplatte auf die höchste Stufe ein und lassen Sie etwa 15 Minuten verstreichen, damit sich die Temperatur bei 95 Grad Celsius stabilisiert. Messen Sie 80 Mikroliter destilliertes Wasser ab und geben Sie den Wassertropfen mit einer Mikropipette in die Mitte einer 60 mal 15 Millimeter großen Petrischale aus Polystyrol. Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette vorsichtig eine saubere Larve des mittleren Drittels des dritten Larvenstadiums in die Mitte des Wassertropfens, wobei so wenig zusätzliches Wasser wie möglich hinzugefügt werden sollte.

Stellen Sie die Petrischale vorsichtig auf den festen Heizblock des Heizgeräts. Passen Sie die Position der Schale schnell so an, dass die gesamten Larven und der Wassertropfen im Sichtfeld sind. Starten Sie die Stoppuhr.

Zurzeit wird die Petrischale auf den festen Heizblock der Heizplatte gestellt und die Zeitpunkte des Auftretens jedes Verhaltens werden aufgezeichnet. Fünf. Stereotype Fortbewegungsverhaltensweisen werden beobachtet, nachdem die in Wasser eingetauchte Larve auf die Heizplatte überführt wurde. Normales Verhalten ohne Wärmeeinwirkung umfasst die Parasol-Fortbewegung, begleitet von suchenden Kopfbewegungen.

Das Kopfschlag-Verhalten kann auftreten, wenn sich die Larve ihren Kopf schnell vorwärts oder seitlich bewegt. Diese Bewegung ähnelt ihrer normalen Fortbewegung im Wasser, erfolgt jedoch ruckartiger und mit anhaltendem Rollen. Das Verhalten tritt auf, wenn die Larve sich seitlich mindestens um volle 360 Grad dreht.

Dies kann eine variable Anzahl von Malen auftreten und beinhaltet manchmal unvollständige Umdrehungen. Zum Zweck der Verhaltensauswertung zählen Sie nur vollständige 360-Grad-Drehungen. Dieses Verhalten ähnelt am meisten der Szene mit lokaler Anwendung der Hitzesonde während des Peitschverhaltens.

Die Larve zeigt schnelle Kontraktions-Relaxations-Bewegungen entlang der antero-posterioren Achse, wodurch der Kopf kurzzeitig der Rute sehr nahe kommt. Gegeißelte Bewegungen werden oft in schneller Abfolge oder gleichzeitig mit Rollbewegungen beobachtet. Schließlich zeigt die Larve Anfälle, denen häufig eine Lähmung folgt. Während des Anfallsverhaltens streckt sich die Larve entlang der intero-posterioren Achse und zeigt eine hochfrequente Ganzkörperaktivität.

Ein Zitterverhalten ohne Biegeparalyse tritt auf, wenn die Larven ihre Bewegung einstellen. Bei einigen Larven ist dies dauerhaft, während andere anschließend eine pulsierende Bewegung mit geringer Frequenz zeigen. In dieser Darstellung des Prozentsatzes der Reagierenden in jeder Kategorie zeigt sich eine Obergrenze der larvalen thermischen Nocizeptionsreaktion. Im Hitzesonden-Test reagieren 100 % der Larven schnell, und zwar bis zu einer Sondentemperatur von 52 Grad Celsius.

Jedoch reagieren bei 54 Grad Celsius und höher 90 % oder mehr der Larven selbst nach 20 Sekunden Kontakt nicht. Obwohl diese Larven nach dem 22. Ausschaltvorgang weiterhin Bewegungen ausführen, können die Anzahl der Überschläge oder die Dauer des Aversionszuckverhaltens ebenfalls gemessen und dargestellt werden. Überraschenderweise scheint es eine umgekehrte Beziehung zwischen der Temperatur des Stimulationsreizes und der Robustheit der Reaktion zu geben, da niedrigere Temperaturen eine höhere Anzahl an Überschlägen hervorzurufen scheinen.

Fünf stereotypische Fortbewegungsverhalten werden beobachtet, wenn die in Wasser eingetauchte Larve auf die Heizplatte übertragen wird. Die durchschnittlichen Latenzzeiten, zu denen diese Verhaltensweisen auftreten, sind hier dargestellt, ebenso wie die durchschnittlichen Wassertropfentemperaturen, die für jede Latenz unter den hier vorgestellten optimalen Testbedingungen gemessen wurden. Der Prozentsatz der Larven, die jeweils eindeutige Verhaltensweisen zeigten, lag zwischen 77 und 100 %. Obwohl gelegentlich die Roll- und Peitschverhalten ausbleiben, überlappen oder in umgekehrter Reihenfolge auftreten, ist hier der Prozentsatz der Larven angegeben, die nach Beginn des Lähmungsverhaltens im Heizplattenversuch überlebt haben. Die Larven wurden bis zur Lähmung erhitzt und anschließend in Standardkulturbedingungen zur Erholung überführt.

Die unbehandelten Larven erhielten eine vergleichbare Behandlung, ausgenommen der Hitzeeinwirkung, und die Bildung von PPE in lebensfähigen Erwachsenen wurde am siebten bis 13. Tag quantitativ erfasst. Hier treibt MD G vier die Expression von UAS-regulierten Transgenen in allen vier Klassen multi-dendritischer peripherer Sinnesneuronen an. UAS oder one delta C exprimiert eine modifizierte Version des offenen Gleichrichter-Kaliumkanals von Drosophila, der für die synaptische Übertragung erforderlich ist, und UAS orrc one delta NC exprimiert eine weiter modifizierte Version desselben Kanals, die die synaptische Übertragung nicht beeinträchtigt.

Beachten Sie, dass nur Larven, die sowohl den MD-GAL4-Treiber als auch das UAS-ORC1-ΔC-Transgen tragen, bei vier der fünf beobachteten Verhaltensweisen verlängerte Latenzzeiten aufweisen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man lokale und globale Reaktionen von GE-Maden auf nozizeptive thermische Reize messen kann. Diese Verfahren können mit anderen Methoden wie der genetischen Analyse kombiniert werden, um die Gene zu identifizieren, die für die thermische Nozizeption erforderlich sind. Bei der Durchführung des Hitzesonden-Tests ist es wichtig, die Variationen bezüglich Druck, Position und Kontaktwinkel der Sonde zu minimieren.