Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel Aplysia

Intrazelluläres Kalzium wurde als wichtiger Bestandteil mehrerer Mechanismen der synaptischen Plastizität angesehen. Diese Ideen können getestet werden, indem gleichzeitig Veränderungen des Kalziums und Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit überwacht werden. Hier zeigen wir, wie dies durch die Kombination von Kalzium-Bildgebung mit intrazellulärer Aufzeichnung erreicht wird.

Unsere Experimente werden mit einem Ganglion der Weichtier Aplysia Cahora durchgeführt. Dieses Präparat hat eine Reihe von Vorteilen, wie z. B. große identifizierte Neuronen, die niedrigen Temperaturen, die für Apia natürlich sind, langsame Signale und erleichtern die Bildgebung, aber die allgemeinen Techniken, die wir demonstrieren, lassen sich leicht auf andere Systeme übertragen. Hallo, ich bin Colin Evans im Labor von Elizabeth Cropper am Fishburg Department of Neuroscience und am Freedman Brain Institute an der Mount Sinai School of Medicine in New York City.

Heute werden wir die gleichzeitige Bildgebung von Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der synaptischen Wirksamkeit im bukkalen Ganglion der Molluske Aplysia cahora demonstrieren. Um intrazelluläres Kalzium zu detektieren, werden wir ein präsynaptisches Neuron mit dem Zell-IMP-permeierten Kalziumindikatorfarbstoff Calciumorange injizieren. Das Präparat wird dann unter das Mikroskop gebracht und prä- und postsynaptische Neuronen werden mit scharfen Elektroden aufgespießt.

Wiederholte präsynaptische Stimulation führt zu einer verstärkten postsynaptischen Reaktion, die sich in einer Erhöhung des postsynaptischen Potentials oder der PSP-Amplitude bemerkbar macht. Die Messung des Fluoreszenzsignals des Calcium-Indikatorfarbstoffs wird es uns ermöglichen, gleichzeitige Veränderungen des präsynaptischen intrazellulären Calciums zu erkennen. Um mit der Betäubung eines erwachsenen Tieres mit einem Gewicht von etwa 150 Gramm zu beginnen, indem 75 mil isotonische Magnesiumchloridlösung injiziert werden, das anästhesierte Tier an eine mit Wachs bedeckte Schale gedrückt wird, dann mit einer groben Pinzette und Schere ein Schnitt in den Fuß des Tieres gemacht und die bukkale Masse freigelegt wird.

Das Ganglion bukkale liegt auf der ventralen Seite der bukkalen Masse und besteht aus zwei miteinander verbundenen Hemiganglien. Es enthält mehrere hundert Neuronen, die zusammen mit Neuronen in anderen Ganglien zur Entstehung und Steuerung des Fressverhaltens des Tieres beitragen. Befreien Sie das Ganglion vorsichtig, indem Sie alle eingeknickten Nerven mit einer feinen Schere durchtrennen und vom Tier entfernen.

Stecke dann das befreite Ganglion an den Boden einer mit Silguard überzogenen Schale, die mit künstlichem Meerwasser gefüllt ist. Das Ganglion ist mit einer Hülle aus Bindegewebe umwickelt, die entfernt werden muss, um die einzelnen Neuronen freizulegen. Verwenden Sie eine Prüfzange, eine Irisschere und äußerste Sorgfalt, um diese Hülle abzuschneiden.

Um eine Schädigung der Neuronen zu vermeiden, stabilisieren Sie das Ganglion de schilde mit etwa 15 Minuten langen Stiften, da jede Bewegung während der Bildgebung problematisch ist. Um scharfe Elektroden für die intrazelluläre Aufzeichnung und Farbstoffinjektion vorzubereiten, ziehen Sie den Kapillarschlauch mit einem Mikroelektrodenabzieher. Wir verwenden dünnwandiges Filament-Boa-Silikatglas mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter.

Die Aufzeichnungselektroden sollten einen Widerstand von etwa 10 Mega haben, wenn sie mit drei molaren Kaliumacetat gefüllt sind, und so stellen wir den Abzieher entsprechend ein, um die D-Elektroden zu füllen. Tauchen Sie die Rückseite der gezogenen Elektrode in eine 10 Millimolare Lösung der Kapillarwirkung des Calciumorangefarbenfarbstoffs entlang des Glasfilaments im Inneren der Elektrode, um Farbstoff in die Spitze zu ziehen, und füllen Sie die Elektrode dann mit 200 Millimolar Kaliumchlorid auf, um einen guten elektrischen Kontakt zu gewährleisten. Wir verwenden ein speziell angefertigtes Bela, um die Elektrodeneigenschaften zu verbessern und den Widerstand der Aufnahmeelektrode auf etwa fünf Mega zu senken.

Die Elektrode wird in einem Winkel von 45 Grad in einen Strom einer Aluminiumoxidsuspension gehalten. Durch das Einmischen von Natriumchlorid in die Suspension und den Anschluss eines ome-Messgeräts kann der Elektrodenwiderstand überwacht werden. Während des Abschrägungsprozesses überführen wir die Schale, die die getäuschten Schnallenganglien enthält, in ein elektrophysiologisches Rig und lokalisieren die interessierenden Neuronen, indem wir sie mit Elektroden aufspießen und ihre Identität überprüfen.

Um das Neuron für die Kalziumbildgebung vorzubereiten, führen wir zunächst eine mit Farbstoff gefüllte Elektrode in das Zellsoma ein und laden den Farbstoffelektro theoretisch mit 30 Minuten hyperpolarisierenden Stromimpulsen von 15 Nanoampere. Wenn das D-Kalziumorange in die Zelle eintritt, nimmt das SOR eine schwache rosa Farbe an. Dann ziehen wir die Aufzeichnungselektroden vorsichtig zurück und lassen das Präparat mindestens 30 Minuten ruhen, damit der Farbstoff in die feinen Prozesse des Neurons diffundieren kann.

Als nächstes überträgst du die Schale mit der Zubereitung in ein Fluoreszenzmikroskop. Wir verwenden eine 10-fache NA 0,3-Wasserimmersionslinse an einem aufrechten Festtischmikroskop, das durch Bewegen der Linse und nicht des Tisches fokussiert. Dies erleichtert die Montage von Manipulatoren.

Wählen Sie für die Aufzeichnungselektroden einen geeigneten Filterblock aus. Ein SI-Filterblock mit drei stellt die richtigen Anregungs- und Emissionsfilter für Calciumorange bereit, passt die Kameraparameter und die Beleuchtungsintensität mit Neutraldichtefiltern und die Feldblende an. Mehr Licht führt zu weniger Lärm, kann aber das Präparat möglicherweise ausbleichen.

Die coole Snap-CCD-Kamera kann ein Feld von 500 x 300 Pixeln mit einer Bildrate von etwa 30 Bildern pro Sekunde und einem guten Signal-Rausch-Verhältnis aufnehmen. Minimieren Sie die Beleuchtung der Fil-Neuronen, indem Sie die Blende der Lichtquellen nach Möglichkeit geschlossen halten. Wählen Sie in der Imaging-Software Regions of Interest oder R ois aus.

Diese Bereiche definieren, wo die Software Intensitätsmessungen durchführt. Wir bilden im Allgemeinen primäre, sekundäre und tertiäre Äste des präsynaptischen Neurons ab. Platzieren Sie einen zusätzlichen ROI neben dem difi-Neuron, um einen Hintergrundwert zu erhalten, der später von allen anderen Datenpunkten subtrahiert wird.

Intrazelluläre Aufzeichnungselektroden in den prä- und postsynaptischen Neuronen werden verwendet, um die synaptische Übertragung zu induzieren und zu überwachen. Sie können die Synchronisierung zwischen elektrophysiologischer und bildgebender Datenerfassung sicherstellen, indem Sie das Frame-Out-Triggersignal der Kamera verwenden, um die Datenerfassungssoftware zu starten. Eine weitere Möglichkeit, die Synchronisierung zu gewährleisten, besteht darin, eine LED im Kameraanschluss zu montieren.

Diese LED leuchtet zu Beginn der Aufnahmesitzung kurz auf und sorgt so für eine Synchronisationsmarkierung. Während eines typischen Experiments löst man Aktionspotentiale im präsynaptischen Neuron durch Injektion kurzer Stromimpulse aus. In diesem Beispiel zeigen wir einen Ausbruch von Spikes und entsprechende Erhöhungen des Kalziumsignals, um bestimmte Hypothesen zu testen.

Das Calciumsignal kann manipuliert und Auswirkungen auf die synaptische Übertragung bestimmt werden. So können beispielsweise Medikamente wie der Calciumchelator EGTA präsynaptisch injiziert oder über das Perfusionssystem appliziert werden. Die Daten werden analysiert, indem sie aus der Bildgebungssoftware in eine Textdatei und dann in die Software exportiert werden, die zur Erfassung der elektrophysiologischen Daten verwendet wurde, was in unserem Fall Spike Two von Cambridge Electronic Design ist.

Wir verwenden ein speziell geschriebenes Skript, um die ROI-Intensitätswerte und die entsprechenden Änderungen des Membranpotentials darzustellen und die Änderungen des Kalziumsignals zu quantifizieren, indem wir das erhaltene Hintergrundsignal vom Hintergrund-ROI subtrahieren und die relative Änderung mit der gezeigten Gleichung berechnen. F Null ist die Fluoreszenz kurz vor der Stimulation und F ist die Fluoreszenz während der Stimulation. Hier zeigen wir die Ergebnisse eines Experiments, in dem wir Veränderungen der Kalziumfluoreszenz im identifizierten Neuron B 21 abgebildet haben.

Die Region, die wir abgebildet haben, ist in A angedeutet, in B eins induzierten wir einen Ausbruch von Spikes in B 21, der postsynaptische Potentiale in B acht und eine Veränderung des Kalziumsignals induzierte. B zwei zeigt die Wirkung der Injektion des Calciumchelators. EGTA-Spikes in B 21 induzieren keinen großflächigen Anstieg der Kalziumfluoreszenz mehr und die postsynaptische Potentialamplitude ist verringert.

Zusammenfassend haben wir Techniken demonstriert, mit denen gleichzeitig die intrazelluläre Kalziumkonzentration überwacht und die Wirksamkeit der synaptischen Übertragung bewertet werden kann. Diese Techniken erfordern im Vergleich zu den meisten funktionellen Bildgebungsverfahren nur eine bescheidene Ausrüstung und sind einfach und schnell zu erlernen.