Name: Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel Aplysia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Lernen Sie die simultane Überwachung von intrazellulärem Calcium und synaptischer Wirksamkeit in Aplysia-Ganglien. Diese Methode kombiniert Calcium-Imaging mit intrazellulärer Ableitung für Neurowissenschaftler.

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A PHS Grant (MH51393) unterstützt diese Arbeit. Einige der Aplysia wir werden von den nationalen Ressource für Aplysia der University of Miami unter Grant RR10294 vom National Center for Research Resources, NIH zur Verfügung gestellt.

Ein. Vorbereitung <ol><li> Das Tier zu betäuben durch Einspritzen 75-100 ml isotonischer Magnesiumchloridlösung. Die Aplysia verwenden wir für die Bildgebung sind in der Regel 150-200 Gramm und werden von Marinus Scientific erhalten. </li><li> Merken die narkotisierten Tier zu einem Wachs bedeckt Gericht. Spritzennadeln funktionieren gut für diesen Zweck, sterile Techniken sind nicht erforderlich. Mit grober Pinzette und Standard-Schere einen Einschnitt in das Tier den Fuß und setzen die bukkalen Masse. Suchen Sie die bukkale Ganglion. Mit Feder Schere und feinen Pinzette vorsichtig kostenlos das Ganglion, indem alle bukkalen Nerven. </li><li> Entfernen Sie das Ganglion und legen Sie sie in einem Sylgard beschichtete Schale mit künstlichem Meerwasser. Legen Sie ein paar Insekten Stifte durch die bukkalen Nerven das Ganglion stabilisieren. Desheath die bukkale Ganglion mit ultrafeinen Pinzette und Schere Feder, um so die Neuronen für intrazelluläre Aufnahme freizulegen. Dann wieder Pin das Ganglion mit etwa 15 fein Insekt (minutien) Pins. Das Ganglion müssen fest an ihrem Platz gehalten werden, da jede Bewegung wird während der Bildgebung problematisch. </li></ol> 2. Bereiten Elektroden <ol><li> Ziehen Sie Elektroden mit Glas Kapillarrohr mit Filament (zB WPI TW100F-4) und einen Abzieher. Einstellungen sollte individuell festgelegt werden, um Elektroden der erforderlichen Widerstand zu erzeugen. Wenn mit 3 M KAc gefüllt (Kaliumacetat) unserer Elektrodenwiderstand beträgt im allgemeinen etwa 10 MOhm, wenn die Elektroden zu abgeschrägt werden, oder etwa 5 MOhm wenn die Abschrägung Schritt ausgelassen sind. </li><li> Füllen eines Satzes von Elektroden mit einer Lösung, die 3 M KAc/30 mM KCl mit einer Spritze und Nadel Mikrofilters. Diese Elektroden werden für die Elektrophysiologie verwendet werden. </li><li> Füllen eines zweiten Satzes von Elektroden mit dem Calcium-Indikator-Farbstoff durch Eintauchen des hinteren Endes der Elektrode in Farbstoff zuvor rekonstituiert mit ca. 40 ul destilliertes Wasser für 500 &amp;mgr; g Farbstoff. Wenn die Spitze der Elektrode gefüllt ist, zurück zu füllen etwa 1/4 Zolldes Endes der Elektrode mit 200 mM KCl um einen guten elektrischen Kontakt zu gewährleisten. </li><li> Es ist vorteilhaft, die Elektroden Fase, wie dies erleichtert Farbstoffinjektion und reduziert die Beschädigung durch mehrfache Durchdringungen Membran durchgeführt. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Beveler die einen Strom von eine Salzwasser / Aluminiumoxidpulver Suspension erzeugt. Die Elektrode wird in einer Halterung montiert ist und ihre Spitze tritt in den Strom an einer 45 °-Winkel. Elektrodenwiderstand wird kontinuierlich überwacht und die Abschrägung beendet, wenn der Widerstand erreicht etwa 5 MOhm für KAc gefüllten Elektroden. Die Farbstoff gefüllten Elektroden für eine gleiche Zeitdauer abgeschrägt und haben typischerweise Widerstände von 15-20 MOhm. </li></ol> 3. Laden des Calcium-Indikatorfarbstoff <ol><li> Legen Sie die auf der Grundlage einer Elektrophysiologie rig und visuell suchen Sie die präsynaptischen Neuron von Interesse. Viele unserer Experimente sind mit einem identifizierten sensorischen Neuronen während der Fütterung, B21 5, 6 genutzt getan. Die relativ fest position, Größe (~ 100 um) und längliche Form der B21 die soma machen es leicht zu finden. </li><li> Aufzuspießen das Neuron von Interesse mit einer Elektrode mit dem Calcium-Indikator-Farbstoff. B21 kann die Identität durch Aufspießen der postsynaptischen Neuron B8 überprüft werden. Depolarisation B21 mit ~ 8 nA Strom auslösen Spikes und Ergebnis bei der Erleichterung PSPs in B8 7. </li><li> Inject Farbstoff in der präsynaptischen Neuron von Interesse, indem hyperpolarisierenden Impulse (typischerweise -15 nA, 1 Hz, 75% ED) für etwa 30 Minuten. Wenn Farbstoffbeladung erfolgreich ist, wird des Neurons Soma Erwerb eine schwache rosa Farbe. Entfernen der farbstoffhaltigen Elektrode durch langsames Herausziehen aus dem Neuron. </li><li> Hinterlegen Zubereitungen für etwa 30 Minuten, damit der Farbstoff in die feinen Prozesse synaptischen Kontakt herzustellen mit Folger Neuronen diffundieren. </li></ol> 4. Calcium Imaging und elektrophysiologische Recording <ol><li> Legen Sie die Vorbereitung auf die Bildgebung MicroscOPE. Die Schale mit der Vorbereitung auf einem Kühltisch mit Stücken von Permagum Dichtschnur, die im Gegensatz Ton, bleibt klebrig, wenn feucht gehalten werden. Die feste Stage-Mikroskop konzentriert, indem das Ziel. Die Bühne bleibt stationär, welche ermöglicht Befestigung angebrachten Magneten Manipulatoren. Da die hohe Vergrößerung macht Vibrationen (insbesondere seitliche Bewegung) ein Problem, sollte die gesamte bildgebende Einrichtung auf einer Schwingungsisolierung Plattform platziert werden. </li><li> Aufspießen präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen mit Elektroden, die normale Elektrolyt-Lösung. </li><li> Wählen Sie einen Filter Block geeignet Bild Calcium Orange (Anregung 549 nm, Emission 576 nm) 8 und stellen Sie die Kamera. Wissenschaftlichste CCD-Kameras kann der Untersucher eine Teilmenge der CCD-Zellen, die ausgelesen werden wählen. Darüber hinaus können die Zellen kombiniert (klassierten) werden. Auswählen einer kleineren Teilmenge erhöht die Geschwindigkeit, während Binning erhöht die Empfindlichkeit. Diese beiden Einstellungen, zusammen mit der Belichtungszeit, zu bestimmendie Frame-Rate, dh wie viele Bilder Sie pro Sekunde erfasst werden. Geeignete Einstellungen wird Bild eine Fläche von 580 x 350 um 2 mit 500 x 300 Pixel (mit einem 10x-Objektiv und einem 0,5-Kamera-Adapter). Fügen Neutralfilter zum Lichtweg, um die Beleuchtungsstärke auf die minimale Menge, die korrekte Belichtung mit einer Belichtungszeit &lt;25 ms bietet einzustellen. Diese Einstellungen sollten in einer Bildrate von ca. 30 Hz führen - was in Aplysia ist schnell genug, um Bild single spike evozierte Calcium Veränderungen. Schließlich schließen Feldblende so dass nur der abgebildeten Fläche beleuchtet wird. </li><li> In der Imaging-Software markieren des Neurons Regionen, die Sie messen möchten. Im Elements AR-Software wird dies in der &quot;Time Measurement&quot; Abschnitt, indem Regions of Interest (ROI) durchgeführt. B21 ein bipolarer Neuron und frühere Arbeiten haben gezeigt, dass ihre seitliche Prozess kontaktiert den postsynaptischen Neuron von Interesse 9. Wir in der Regel Bild primären, sekundären und tertiären branches des seitlichen Verfahrens, indem ein ROI über jeden Teil des Neurons. Eine zusätzliche ROI neben dem Farbstoff gefüllt Neuron wird gemessen, um einen Hintergrund-Wert, der von allen anderen später Datenpunkten subtrahiert wird bereitzustellen. </li><li> Weisen Sie den Elektrophysiologie Akquisition (in diesen Experimenten Spike II) für ein Trigger-Signal von der &quot;frame Auslese&quot;-Signal der Kamera vorgesehen warten. Starten Sie die Bildaufnahme (Elements AR); Spike II wird nun startet die Aufnahme automatisch, wenn die Kamera nimmt seinen ersten Frame. Sie können auch ein TTL-Ausgang des Power 1401, kurz auf eine LED in der Mikroskop-Kamera-Anschluss montiert einzuschalten. Dies wird ein Signal, um anschließend zu synchronisieren bildgebende und elektrophysiologische Daten. </li><li> Stimulieren das präsynaptische Neuron durch Injizieren einer Reihe von kurzen Stromimpulsen depolarisierende bei der gewünschten Frequenz. Es ist wichtig, jeden Impuls zu überwachen (z. B. mit einem Reiz ausgelöst Oszilloskop), um zu bestimmen, ob ein Aktionspotential successf istully erzeugt. Während Calcium Orange ist sehr photo-stabil im Vergleich zu anderen Farben, ist es eine gute Idee, eine kontrollierte Studie ohne Stimulation aufnehmen, um zu überprüfen, wie viel Farbbleichung auftritt. </li><li> In Experimenten, in denen intrazelluläre Kalziumkonzentration manipuliert wird ein Arzneimittel, wie EGTA in das präsynaptische Neuron eingeführt und die Stimulation und Datenerfassung oben beschriebenen Schritte werden wiederholt. </li></ol> 5. Analyse von repräsentativen Daten <ol><li> Exportieren Sie die Bilddaten (die Liste der gemessenen Intensitätswerte für jede ROI), indem Sie ihn in eine Textdatei. Ein benutzerdefiniertes Skript in Spike II kann dann importieren Sie die Textdatei. Dieses Skript normalisiert auch die Werte mit den einzelnen Sonde Bereich, und subtrahiert den Wert des Hintergrunds Sonde. Die Datenpunkte werden dann neben den elektrophysiologischen Daten als &quot;virtuelle RealWave&quot; Kanal aufgetragen. Der &quot;Kanal Prozess / Timeshift-Funktion&quot; in Spike II wird verwendet, um genau ausrichten Bilddaten points, ​​mit dem LED-Signal als Referenz. </li><li> Um Werte als prozentuale Veränderung zu erhalten, analysiert die Bilddaten durch Berechnung der relativen Änderung in der Fluoreszenz als dF / F o = (FF o) / F o. F o die Fluoreszenzpegel kurz vor der Stimulus und F die Fluoreszenz während der Stimulus. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Die Experimente werden in einem Ganglion Vorbereitung der Aplysia durchgeführt. Veränderungen der intrazellulären Calcium werden mit einem fluoreszierenden Farbstoff, der iontophoretisch in das präsynaptische Neuron eingeführt wird abgebildet. Prä-und postsynaptischen Neuronen werden dann mit scharfen Elektroden aufgespießt, so dass die synaptische Übertragung kann induziert und überwacht werden. <img src="/files/ftp_upload/3907/3907fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> <strong&gt; Abbildung 2. Calcium imaging und intrazelluläre Aufnahme von identifizierten Neuronen in der bukkalen Ganglion Aplysia. (A) Foto des abgebildeten Seitenarm des Neurons B21. Die Box gibt den gemessenen Bereich von Interesse. (B1) Intrazelluläre Stimulation der B21 erinnert Aktionspotentiale (untere Kurve) und die Erleichterung postsynaptischen Potentiale (PSPs) in der postsynaptischen Follower Neuron B8 (mittlere Spur), was es auch Feuer Aktionspotentiale. Erhöhungen der präsynaptischen Calcium Fluoreszenz sind in der oberen Kurve dargestellt. (B2) Effekt der präsynaptischen EGTA auf homosynaptische Erleichterung. EGTA wurde intrazellulär in B21 ~ 15 Minuten vor intrazelluläre Stimulation injiziert. Es wird vermutet, dass EGTA ein langsam wirkendes Calciumchelator, die bei niedrigen Konzentrationen ist nicht schnell genug auf die synaptische Transmission zu unterdrücken. Beachten Sie die Reduzierung der weit verbreiteten Kalzium-Signal und die entsprechende Abnahme der PSP Amplitude. (C) Die PSP Amplitude korreliert mit der präsynaptischen Calcium Signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3907/3907fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol><li>Zucker, R. S., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).</li>
<li>Eberhard, M., Erne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+to+fluorescent+calcium+indicators%3A+Calcium+green%2C+calcium+orange+and+calcium+crimson%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophysical+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson.</a> Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).</li>
<li>Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+properties+of+DM-nitrophen+and+calcium+indicators%3A+rapid+transient+response+to+flash+photolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis.</a> Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).</li>
<li>Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+spike-mediated+synaptic+transmission+by+presynaptic+background+Ca2%2B+in+leech+heart+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons.</a> J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).</li>
<li>Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+mechanisms+mediate+potentiating+effects+of+depolarization+on+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission.</a> J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).</li>
<li>Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+holding+potential+on+the+dynamics+of+homosynaptic+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation.</a> J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%22">The Handbook</a>. , 10th edition, Invitrogen. (2005).</li>
<li>Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proprioceptive+role+for+an+exteroceptive+mechanoafferent+neuron+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia.</a> J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).</li>
<li>Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoldberg%2C+JH+%22Imaging+in+Neuroscience+and+Development%22">Imaging in Neuroscience and Development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir demonstrieren Techniken, die verwendet werden, um gleichzeitig zu überwachen die intrazelluläre Calciumkonzentration und Beurteilung der Wirksamkeit der synaptischen Übertragung kann. Diese Techniken sind nützlich, um zu bestimmen, wie verschiedene Formen von kurzfristigen Plastizität vermittelt werden. Das Abbildungssystem wird mit einem Fluoreszenzmikroskop und CCD-Kamera durchgeführt wird. Diese Anforderungen an die Ausrüstung sind relativ bescheiden, wenn die meisten der funktionelle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> Calcium orange </td><td> Invitrogen </td><td> C-3013 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E-4378 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium Kalibrierpuffer Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C-3008MP </td><td> zum Testen der Empfindlichkeit und den Dynamikbereich des Signals </td></tr><tr><td> Magnesiumchloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> verwendet in 0,33 M Lösung Tier zu betäuben </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung Name </td><td> Firma </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> FN-1 aufrecht Fluoreszenzmikroskop </td><td> Nikon Instruments </td><td> mit Narishige ITS-FN1 Bühne </td></tr><tr><td> NMN-21 Manipulatoren </td><td> Narishige </td><td> montiert auf der Bühne mit Magneten </td></tr><tr><td> CoolSNAP HQ 2-CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td></td></tr><tr><td> NIS Elementen AR (Version 3.22) </td><td> Nikon Instruments </td><td> Imaging-Software verwendet werden, um Fluoreszenz-Daten zu erfassen </td></tr><tr><td> 10X/0.3w Plan Fluor Ziel </td><td> Nikon Instruments </td><td> Dieses Wasser Immersionslinse hat einen sehr langen Arbeitstag Abstand von 3,5 mm </td></tr><tr><td> X-Cite 120 PC Metallhalogenidlampe </td><td> EXFO </td><td> verwendet für die Fluoreszenz-Bildgebung </td></tr><tr><td> LS-DWL Halogenlampe </td><td> Sumica </td><td></td></tr><tr><td> ET-CY3 Filter-Set </td><td> Chroma Technology </td><td>; </td></tr><tr><td> Macht 1401 A / D-Wandler </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Probenahme wurde bei 3 kHz getan </td></tr><tr><td> Spike II (Version 7.07) </td><td> Cambridge Electronic Design </td><td> Software zur Elektrophysiologie Daten erfassen </td></tr><tr><td> SEC-10 LX-Verstärker </td><td> NPI-Elektronik </td><td> verwendet mit einem 10X Headstage </td></tr><tr><td> Modell 410 Verstärker </td><td> Brownlee Präzision </td><td> zum Verstärken und Filtern des Signals </td></tr><tr><td> WS-4 </td><td> minus k Technologie </td><td> Schwingungsisolierung für die Bildgebung </td></tr><tr><td> Kühltisch </td><td> Maßarbeit </td><td> Messingplatte durch welche Eiswasser mit einer variablen Rate gepumpt </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Ausrüstung verwendet.

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären calcium-konzentration und synaptic wirksamkeit in der muschel<em&gt; aplysia</em

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Es wurde vorgeschlagen, dass Änderungen in intrazellulärem Calcium die Induktion einer Reihe von wichtigen Formen der synaptischen Plastizität (zB homosynaptische Erleichterung) 1 vermitteln. Diese Hypothesen lassen sich durch gleichzeitiges Überwachen von Änderungen der intrazellulären Calcium-und Umbauten in der synaptischen Wirksamkeit getestet werden. Wir zeigen, wie dies durch die Kombination von Calcium-Imaging mit intrazellulären Aufnahme Techniken erreicht werden kann. Unsere Experimente sind in einer bukkalen Ganglienzellen der Mollusken Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat hat eine Reihe von vorteilhaften Merkmalen experimentell: Ganglia leicht aus Aplysia entfernt werden und Experimente verwendet adulten Neuronen, die normale synaptische Verbindungen herzustellen und haben eine normale Ionenkanal Verteilung. Aufgrund der niedrigen Stoffwechsel des Tieres und den relativ niedrigen Temperaturen (14-16 ° C), die natürlich für Aplysia sind, sind die Vorbereitungen für längere Zeit stabil. ent &quot;&gt; Um Änderungen in der intrazellulären freien Calcium wir die Zelle impermeante Version von Calcium Orange 2, die leicht &#39;geladen&#39; in einem Neuron über Iontophorese ist verwenden. erkennen Wenn diese langwellige Fluoreszenz-Farbstoff bindet an Kalzium, Fluoreszenzintensität steigt. Calcium Orange hat schnelle kinetische Eigenschaften 3 und im Gegensatz ratiometrische Farbstoffe (beispielsweise Fura 2), erfordert keine Filterrad zur Bildgebung. Es ist ziemlich stabil und weniger Foto phototoxische als andere Farbstoffe (zB Fluo-3) 2,4. Wie alle nicht-ratiometrische Farbstoffe, Calcium orange relativen Änderungen der Kalziumkonzentration anzeigt. Aber weil es nicht möglich ist, um Veränderungen in Farbstoffkonzentration durch Belastung und Diffusion, kann es nicht zur absoluten kalibrierten Calciumkonzentrationen bereitzustellen. Ein aufrechter, feste Phase, zusammengesetzten Mikroskop wurde Bildes Neuronen mit einer CCD-Kamera in der Lage ist die Aufnahme etwa 30 Bildern pro Sekunde verwendet. In Aplysia diese zeitliche Auflösungist mehr als ausreichend, um auch nur einen einzigen Dorn induzierte Veränderung der intrazellulären Calcium-Konzentration zu detektieren. Sharp Elektroden gleichzeitig verwendet zu induzieren und aufzuzeichnen synaptischen Übertragung in identifizierten prä-und postsynaptischen Neuronen. Am Ende eines jeden Prozesses vereint ein benutzerdefiniertes Skript Elektrophysiologie und Bildgebung Daten. Um eine korrekte Synchronisation zu gewährleisten verwenden wir einen Lichtimpuls aus einer LED in den Kamera-Anschluss des Mikroskops montiert. Manipulation von präsynaptischen Kalziumspiegel (zB über intrazelluläre EGTA Injektion) ermöglicht es uns, spezifische Hypothesen über die Rolle der intrazellulären Calcium bei der Vermittlung verschiedener Formen von Plastizität zu testen.

Wir zeigen, wie Veränderungen in der intrazellulären freien Calciumkonzentration und synaptische Wirksamkeit gleichzeitig in einem Ganglion Herstellung überwachenden<em&gt; Aplysia</em&gt;. Wir Bild intrazellulärem Calcium unter Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, Calcium Orange, und induzieren und zu überwachen synaptischen Übertragung mit scharfen (intrazellulären) Elektroden.

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel<em&gt; Aplysia</em

Es wurde vorgeschlagen, dass Änderungen des intrazellulären Calciums die Induktion einer Reihe wichtiger Formen der synaptischen Plastizität vermitteln (z. B. ...

Intrazelluläres Kalzium wurde als wichtiger Bestandteil mehrerer Mechanismen der synaptischen Plastizität diskutiert. Diese Vorstellungen können geprüft werden, indem gleichzeitig Veränderungen des Kalziums und Modifikationen der synaptischen Wirksamkeit überwacht werden. Hier zeigen wir, wie dies durch die Kombination von Kalzium-Bildgebung mit intrazellulärer Ableitung erreicht wird.Unsere Experimente werden mit einem Ganglion des Weichtiers Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat bietet mehrere Vorteile wie große identifizierte Neuronen, die für Aplysia natürlichen niedrigen Temperaturen, langsame Signale und eine erleichterte Bildgebung, doch die hier demonstrierten allgemeinen Techniken lassen sich problemlos auf andere Systeme übertragen. Hallo, ich bin Colin Evans im Labor von Elizabeth Cropper an der Fishburg-Abteilung für Neurowissenschaften und dem Freedman Brain Institute an der Mount Sinai School of Medicine in New York City.Heute werden wir die simultane Abbildung von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der synaptischen Wirksamkeit im bukkalen Ganglion des Weichtiers Aplysia cahora demonstrieren. Um intrazelluläres Kalzium nachzuweisen, injizieren wir eine präsynaptische Nervenzelle mit dem zellpermeablen Kalziumindikatorfarbstoff Calcium Orange. Anschließend wird das Präparat unter das Mikroskop gebracht, und die prä- und postsynaptischen Neuronen werden mit scharfen Elektroden impaliert.Wiederholte präsynaptische Stimulation führt zu einer verstärkten postsynaptischen Antwort, die als zunehmende postsynaptische Potential- oder PSP-Amplitude sichtbar ist. Die Messung des fluoreszierenden Signals des Kalziumindikatorfarbstoffs ermöglicht es uns, gleichzeitige Änderungen des intrazellulären Kalziums im präsynaptischen Bereich nachzuweisen. Um zu beginnen, betäuben Sie ein erwachsenes Tier mit einem Gewicht von etwa 150 Gramm, indem Sie 75 ml isotonische Magnesiumchloridlösung injizieren, heften Sie das betäubte Tier auf eine mit Wachs bedeckte Schale und machen Sie dann mit groben Pinzetten und einer Schere einen Schnitt im Fuß des Tieres, um die bukkale Masse freizulegen.Das bukkale Ganglion liegt auf der ventralen Seite der bukkalen Masse und besteht aus zwei verbundenen Hemiganglien. Es enthält mehrere hundert Neuronen, die zusammen mit Neuronen in anderen Ganglien zur Erzeugung und Steuerung des Fressverhaltens des Tieres beitragen. Lösen Sie das Ganglion vorsichtig, indem Sie alle eingeklemmten Nerven mit feiner Schere durchtrennen, und entfernen Sie es aus dem Tier. Dann fixieren Sie das freigelegte Ganglion an der Basis einer mit Silikon beschichteten Schale, die mit künstlichem Meerwasser gefüllt ist. Das Ganglion ist von einer Hülle aus Bindegewebe umgeben, die entfernt werden muss, um die einzelnen Neuronen freizulegen. Verwenden Sie feine Pinzette, Iris-Schere und äußerste Vorsicht, um diese Hülle zu entfernen.Um Neurone nicht zu beschädigen, stabilisieren Sie das entmantelte Ganglion mit etwa 15 Minuten langen Stiften, da jegliche Bewegung während der Bildgebung problematisch sein wird. Um scharfe Elektroden für die intrazelluläre Ableitung und Farbstoffinjektion vorzubereiten, ziehen Sie Kapillarrohre mit einem Mikroelektrodenzieher. Wir verwenden dünne, mit Filament versehene Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter.Die Ableitelektroden sollten einen Widerstand von etwa 10 Megaohm aufweisen, wenn sie mit dreimolarer Kaliumacetatlösung gefüllt sind, daher stellen wir den Puller entsprechend ein, um die D-Elektroden zu füllen. Tauchen Sie das hintere Ende der gezogenen Elektrode in eine 10-Millimolar-Lösung des Calcium-Orange-Farbstoffs; durch Kapillarwirkung wird der Farbstoff entlang des Glasfadens im Inneren der Elektrode in die Spitze gezogen. Danach füllen Sie die Elektrode mit 200 Millimolar Kaliumchlorid auf, um einen guten elektrischen Kontakt sicherzustellen. Wir verwenden ein selbstgebauten Bela, um die Elektrodeneigenschaften zu verbessern und den Widerstand der Ableitelektrode auf etwa fünf Megaohm zu senken.Die Elektrode wird in einem Winkel von 45 Grad in einen Strom einer Aluminiumoxid-Suspension gehalten. Durch Zugabe von Natriumchlorid in die Suspension und Anschließen eines Ohmmeters kann der Elektrodenwiderstand überwacht werden. Während des Abschrägens überführen wir die Schale mit den deprimierten Buckelganglien auf eine Elektrophysiologie-Apparatur und lokalisieren die interessierenden Neuronen, indem wir sie mit Elektroden spicken und ihre Identität verifizieren.Um Neuronen für die Kalzium-Bildgebung vorzubereiten, führen wir zunächst eine mit Farbstoff gefüllte Elektrode in das Zellkörper ein und laden den Farbstoff elektrophoretisch mittels 30 Minuten dauernder hyperpolarisierender Stromimpulse mit 15 Nanoampere. Während der D-Calcium-Orange-Farbstoff in die Zelle eindringt, nimmt das SOR eine schwache rosa Färbung an. Anschließend ziehen wir die Ableitelektroden vorsichtig zurück und lassen das Präparat mindestens 30 Minuten ruhen, damit sich der Farbstoff in den feinen Ausläufern des Neurons ausbreiten kann.Als Nächstes überführen Sie die Schale mit der Präparation auf ein Fluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein 10-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 mit Wassereintauchung an einem aufrechten Mikroskop mit feststehendem Objekttisch, bei dem die Fokussierung durch Bewegen des Objektivs und nicht des Tisches erfolgt. Dies erleichtert die Montage von Manipulatoren.Wählen Sie für die Aufnahmeelektroden einen geeigneten Filterblock aus. Ein SI-Drei-Filterblock liefert die richtigen Anregungs- und Emissionsfilter für Calcium Orange. Stellen Sie die Kameraparameter sowie die Beleuchtungsintensität mit Neutraldichtefiltern und der Feldblende ein. Mehr Licht führt zu weniger Rauschen, kann aber möglicherweise die Probe ausbleichen.Die schnelle CCD-Kamera mit Kühlung kann ein Bildfeld von 500 mal 300 Pixeln mit einer Bildrate von etwa 30 Bildern pro Sekunde und einem guten Signal-Rausch-Verhältnis erfassen. Minimieren Sie die Beleuchtung der Fil-Neuronen, indem Sie den Verschluss der Lichtquellen so oft wie möglich geschlossen halten. Wählen Sie im Bildgebungssoftware Bereiche von Interesse oder R ois aus.Diese Bereiche definieren die Stellen, an denen die Software Intensitätsmessungen durchführt. Üblicherweise bilden wir die primären, sekundären und tertiären Verzweigungen des präsynaptischen Neurons ab. Platzieren Sie ein zusätzliches ROI neben dem difi-Neuron, um einen Hintergrundwert zu erhalten, der anschließend von allen anderen Datenpunkten subtrahiert wird.Intrazelluläre Aufnahmeelektroden in prä- und postsynaptischen Neuronen werden verwendet, um die synaptische Übertragung auszulösen und zu überwachen. Sie können die Synchronisation zwischen elektrophysiologischer und bildgebender Datenaufnahme sicherstellen, indem Sie das Frame-Out-Auslössignal der Kamera verwenden, um die Datenaufnahmesoftware zu starten. Eine andere Möglichkeit zur Sicherstellung der Synchronisation besteht darin, eine LED im Kameraport anzubringen.Diese LED wird kurz zu Beginn der Aufnahmesitzung eingeschaltet und liefert so eine Synchronisationsmarkierung. Während eines typischen Experiments lösen Sie Aktionspotentiale im präsynaptischen Neuron durch Injektion kurzer Strompulse aus. In diesem Beispiel zeigen wir einen Spikeschub und die entsprechenden Anstiege des Kalziumsignals, um spezifische Hypothesen zu überprüfen.Das Kalziumsignal kann manipuliert und die Auswirkungen auf die synaptische Übertragung bestimmt werden. Beispielsweise können Wirkstoffe wie der Kalziumchelator EGTA präsynaptisch injiziert oder über das Perfusionsystem appliziert werden. Die Daten werden analysiert, indem sie aus der Bildgebungssoftware in eine Textdatei und anschließend in die Software exportiert werden, mit der die elektrophysiologischen Daten aufgezeichnet wurden, im vorliegenden Fall spike two von Cambridge Electronic Design.Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Skript, um die Intensitätswerte der ROI und die entsprechenden Änderungen im Membranpotenzial darzustellen, und quantifizieren die Änderungen im Kalziumsignal, indem wir das Hintergrundsignal, das von der Hintergrund-ROI stammt, subtrahieren und die relative Änderung anhand der dargestellten Gleichung berechnen. F null ist die Fluoreszenz unmittelbar vor der Stimulation, und F ist die Fluoreszenz während der Stimulation. Hier zeigen wir die Ergebnisse eines Experiments, bei dem wir Änderungen der Kalziumfluoreszenz in dem identifizierten Neuron B 21 abgebildet haben.Der Bereich, den wir abgebildet haben, ist in A dargestellt. In B induzierten wir einen Spikeschub in B 21, der postsynaptische Potentiale in B 8 und eine Änderung des Kalziumsignals hervorrief. B 2 zeigt die Wirkung der Injektion des Kalziumchelators. EGTA-Spikes in B 21 rufen keine weitverbreiteten Zunahmen der Kalziumfluoreszenz mehr hervor, und die Amplitude des postsynaptischen Potentials ist vermindert.Zusammenfassend haben wir Techniken vorgestellt, die gleichzeitig die intrazelluläre Kalziumkonzentration überwachen und die Wirksamkeit der synaptischen Übertragung bewerten können. Diese Techniken erfordern im Vergleich zu den meisten funktionellen Bildgebungsverfahren nur bescheidene Ausrüstung und sind einfach und schnell zu erlernen.

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Neurowissenschaften

Vorbereitung der Aplysia Sensory-Motor neuronalen Zellkulturen

Eine Technik ist für die Implantation vier...

Electrode Herstellung und Implantation in Aplysia californica Für Multi-Channel-Neuro-und Muskel-Recordings in Intact, Frei Behaving Tiere

Die Experimente zeigen, eine einfache Möglichkeit für Studenten, um Erfahrungen bei der Prüfung Muskulatur, synaptische Antworten, die Auswirkungen der Ionengradienten und Durchlässigkeit auf Membranpotentiale zu gewinnen. Auch ist ein sinnlich-ZNS-motor-Muskel-Schaltung vorgestellt, um ein Mittel, um Wirkungen von Verbindungen auf einem neuronalen Schaltkreis-Test zeigen.

Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

Mit seinem kleinen transparenten Körper, gut dokumentierte Neuroanatomie und einer Vielzahl von zugänglicher genetischen Techniken und...

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

Wir beschreiben die Dissektion des Nervensystems der Meeresumwelt...

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

Meeresschnecke Aplysia californica wurde weithin als neurobiologisches Modell für die Studien auf zellulärer und molekularer Basis des Verhaltens verwendet. Hier wird eine Methodik zur Erforschung des Nervensystems von Aplysia für die elektrophysiologischen und molekularen Analysen einzelner Neuronen identifizierter neuronischer Schaltkreise beschrieben.

Aplysia Ganglien-Vorbereitung für elektrophysiologische und molekulare Analysen einzelner Neuronen

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von genetisch codierte Ca2 + Reporter Datensatzänderungen in neuronale Aktivität im Verhalten Caenorhabditis Elegans Würmer.

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Optogenetik und genetisch kodierte Kalziumsensoren zu koppeln, um die zytosolischen Kalziumspiegel und Veränderungen in evozierten Kalziumtransienten in den Körperwandmuskeln des Modellorganismus C. elegansabzubilden.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Körperwandmuskeln

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Das Protokoll beschreibt die Methode, einen fluoreszierenden Kalziumfarbstoff durch den geschnittenen Nerv in die motorischen Nervenenden der Maus zu laden. Darüber hinaus wird eine einzigartige Methode zur Erfassung schneller Kalziumtransienten in den peripheren Nervenenden mittels konfokaler Mikroskopie vorgestellt.

Registrierung von Kalziumtransienten in neuromuskulären Verbindungen von Mäusen mit hoher zeitlicher Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie

Die aktuellen Methoden beschreiben einen nicht-ratiometrischen Ansatz für die hochauflösende, subkompartimentelle Kalziumbildgebung in vivo in Caenorhabditis elegans unter Verwendung leicht verfügbarer genetisch kodierter Kalziumindikatoren.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Lernen Sie die simultane Überwachung von intrazellulärem Calcium und synaptischer Wirksamkeit in Aplysia-Ganglien. Diese Methode kombiniert Calcium-Imaging mit intrazellulärer Ableitung für Neurowissenschaftler.

Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel

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