Name: Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Lernen Sie hochauflösende Live-Bildgebung von Zellverhalten im embryonalen Neuralrohr. Diese Methode ermöglicht langzeitbeobachtungen einzelner Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

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1. Dish Vorbereitung <ol><li> Geschirr für Stück Kultur verwendet werden, sind mit Glasboden (mit einem Deckglas als Basis) (Willco Gerichte). Diese basieren auf Linsengewebe in einer 6 cm Gewebekulturschale zu halten Glasboden sauber platziert. </li><li> Am Tag vor dem Experiment, 2 ml 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung für den Glasboden Schüssel und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur, damit das Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Glasboden. </li><li> Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie drei Mal in vollentsalztem Wasser, und dann noch einmal in 70% Ethanol. </li><li> Lassen Sie über Nacht trocknen. Geschirr kann auch durch leichtes Erwärmen in der Mikrowelle bei niedriger Leistung für 30-45 Sekunden getrocknet werden. </li></ol> 2. Embryo Elektroporation <ol><li> Eier inkubieren bei 37 ° C zu Hamburger-Hamilton (HH) Stufe 10 (~ 36 Stunden) (oder einem anderen gewünschten Stufe). </li><li> Vor Beginn der Vorbereitung Glasnadeln (wir verwenden eine Flaming / Brown-Modell p87 Mikrokapillare Abzieher) und brechen Sie die Spitze des needle mit einer feinen Pinzette unter einem Binokular. Das Ende der Nadel sollte scharf genug zu durchbohren der Embryo zwar nicht so eng, dass es der Injektion des DNA-Lösung behindert. </li><li> Fenster Eier und Ort Elektroden (5mm Abstand) auf beiden Seiten des Embryos </li><li> Inject DNA (~ 0,025 bis 0,5 ug / ul in VE-Wasser mit einer geringen Menge schnell grün eingefärbt) in das Neuralrohr. </li><li> Tragen Sie aktuelle - 12-17 V dreimal, 50ms Pulslänge mit 950 ms zwischen den Impulsen. </li><li> Wir verwenden niedrigen Konzentrationen von DNA und niedrigen Spannungen an Elektroporation Mosaik Expression zu erreichen, so dass wir einzelnen Zellen zu folgen. </li><li> Cover Fenster in der Eierschale mit Klebeband und sicherzustellen, dass es dicht ist. </li><li> Erlauben Embryonen für 3-4 Stunden oder über Nacht bei 37 ° C erholen </li></ol> 3. Collagen und Slice-Kulturmedium Vorbereitung <ol><li> Bereiten Collagen-Mix und in Scheiben schneiden Kulturmedium etwa eine Stunde vor dem Schneiden. </li><li> Zu 300 ul typ 1-Kollagen mit 100 ul 0,1% Essigsäure-Lösung und 100 ul 5 x L15 Medium. Vortex gründlich nach jeder Zugabe. Die Lösung sollte gelb werden. </li><li> Fügen Sie nun 15-20 ul 7,5% Natriumbicarbonat und gründlich vortexen. Die Lösung sollte leicht rosa geworden, und das Volumen von Natriumbicarbonat dafür benötigten können abweichen. Halten Sie auf dem Eis und machen jedes Mal frisch. </li><li> Zu 10 ml Neurobasalmedium hinzufügen B-27 Ergänzung und Glutamax, zu einem 1 x Endkonzentration und 10 ul Gentamicin-Lösung. </li><li> Ort Medium in einem 37 ° C Inkubator gepuffert mit 5% CO 2. Lassen Sie die Oberseite des Behälters locker, damit es mit dem CO 2 ausgleichen. </li></ol> 4. Slice-Kultur <ol><li> Entfernen Embryonen aus Ei und waschen in L15 Medium. </li><li> In eine Gewebekulturschale mit einer Schicht aus Sylgard an der Unterseite und stecken Sie sie durch die umliegenden extra-embryonalen Membranen, so dass sie straff gespannt sind. </li><li> Mit einem Mikrofonroknife, Slice Embryo so gerade wie möglich durch Region von Interesse. Für die Wirbelsäule, sollte Scheiben zwischen 1-2 Somiten dick sein. Lassen Sie Scheiben, die an Embryo, während Sie andere Embryonen, so dass Sie nicht verlieren, sie zu schneiden. </li><li> Bereiten Sie eine 200 pl Mikropipettenspitze durch Abschneiden ~ 1 mm von der Spitze und Anbringen dieser auf eine P2-oder P10. Dieser Tipp wird verwendet, um die Wirbelsäule Scheiben an den Glasboden Gericht übertragen werden. Ein 10 ul Spitze ist nicht breit genug, um abholen Scheiben schneiden. </li><li> Bestreichen Sie die Innenseite der Spitze mit Kollagen durch Pipettieren 1 ul Collagen-Mix vorbereitet früher. Verlassen Sie für 1-2 Minuten und dann spülen mit L15 Medium. Dies wird das Gewebe Kleben an der Innenseite der Spitze zu verhindern. </li><li> Nehmen Scheibe von Embryo mit Hilfe eines microknife und entfernen aus der Schale mit einem P2 oder P10 mit einer 200 ul Spitze versehen und auf 1 pl. Versuchen Sie, mit möglichst wenig Medium wie möglich. </li><li> Vortex das Kollagen Mischung Drop 5-8 ul diese an das Poly-L-Lysin beschichtete Schale. </li><li> ImmediaTely setzen Embryo Scheibe in Kollagen und Position in Stelle mit einer feinen Pinzette. Scheiben sollten so positioniert, dass die Seite, die abgebildet werden bündig mit dem Deckglas ist. Das Gewebe sollte der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas haften. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie einige Scheiben auf dem Deckglas zu haben. Wir können in der Regel 6-9 legen Scheiben auf einem Teller. </li><li> Nachdem alle Scheiben vorhanden sind, decken Sie die Schüssel und lassen Sie das Kollagen zu 20 Minuten eingestellt. Einige der frühesten angeordnet Kollagen kann bereits begonnen haben zu trocknen. Um dies zu verhindern eine kleine Menge von L15, diese vor abdeckt. </li><li> Einmal eingestellt, vorsichtig 2ml Scheibe Kulturmedium, das äquilibriert wurde in 5% CO 2 bei 37 ° C für mindestens eine Stunde. Es ist darauf zu verdrängen nicht das Kollagen aus dem Deckglas werden. </li><li> Platz in einem 37 ° / 5% CO 2-Inkubator und erlauben Scheiben für mindestens 3 Stunden vor der Bildgebung zu erholen. Wenn es keine Feuchtigkeit, statt Schüssel in einer Plexiglas-Box Witzha bisschen feuchten Papiertüchern in einer Ecke. </li></ol> 5. Imaging Embryo Scheiben <ol><li> Wir verwenden eine DeltaVision Core-wide-field-Mikroskop mit einem WeatherStation Klimakammer zu Bildschnitten ausgestattet. Die Kammer wird konstant auf 37 ° C, mit einem CO 2-Perfusion Vorrichtung gehalten, um die Mikroskoptisch bei 5% CO 2/95% Luft zu halten. </li><li> Imaging wird in der Regel mit einem 40-x / 1,30 NA Ölimmersionslinse und Bilder sind mit einem CoolSnap HQ2 eingefangen gekühlte CCD-Kamera durchgeführt. </li><li> Z-Profile werden alle 1,5 um bis 45 um Gewebe eingefangen. Belichtungszeit sollte so niedrig wie möglich gehalten werden. Wir in der Regel für 5 bis 50 ms aussetzen für jeden Z-Abschnitt. Die Bilder werden alle 7 Minuten gefangen genommen und bis zu 9 Scheiben können besichtigt Verwendung des Systems DeltaVision genauen Punkt zu besuchen Funktion sein. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel Zeitraffer-Sequenz des Rückenmarks Progenitorzellen istgezeigt in. 2a und entsprechenden Movie 1. Imaging wurde auf einer Rückenmark Slice aus einer zwei Tage alten (HH Stadium 12) Embryo begonnen. Diese Zelle wurde mit einem Konstrukt, die GFP-αTubulin transfiziert. Während dieser frühen Phase durchlaufen neuronale Vorläuferzellen überwiegend Vorläuferzellen-Vorläuferzellen Modus Divisionen, während der die Zellen sich teilen, um zwei weitere Rad-Vorläuferzellen zu erzeugen. Abb. 2b und entsprechende Film 2 zeigt eine Zelle mit GFP-GPI (GPI-verankerten GFP) transfiziert, Kennzeichnung der Zellmembran. Diese Zelle erfährt eine Spaltung, während der die basalen Prozess spaltet sich in zwei und sind zu gleichen Teilen an die Tochterzellen vererbt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Abbildung 1. Slice-Kultur-Protokoll für Zeitraffer-Bildgebung. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zelle behavior während der normalen Entwicklung des Rückenmarks. (a) ausgewählte Bilder aus Film 1. Zelle, die GFP-Tubulin unterteilt mit einer Schnittstelle Ebene, die senkrecht zu der apikalen Oberfläche (2 h 20 min), Erzeugen von zwei Tochterzellen, die wieder (24 h 23 min und 25 h 54 min) zu unterteilen. (B) ausgewählte Bilder aus Movie 2. Zelle mit GFP-GPI transfiziert erfährt die Zellteilung, während der die basalen Prozess aufgeteilt (weiße Pfeile) und wird zu gleichen Teilen von den Tochterzellen vererbt. Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Hier klicken, um Film anzusehen</a> . Movie 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Hier klicken, um Film anzusehen</a> .

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
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<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Fundamental+Limits+in+Confocal+Microscopy+Handbook+Of+Biological+Confocal%22">Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal</a>. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).</li>
<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
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<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir stellen Ihnen hier eine neue Zeitraffer-Imaging-Test des Verhaltens von Zellen in Hühner-Embryonen Hirnschnittmodell überwachen. Dieser Assay ermöglicht die hochauflösende Bildgebung von lebendem Gewebe für bis zu 70 Stunden, obwohl Zeitrahmen zwischen 24-48 Stunden leichter zu erfassen sind. Die Verwendung eines hohen NA Öl-Objektiv und relativ kurzen Abständen zwischen Zeit-Punkte ermöglicht Bildaufnahme mit hoher Auflösung, sowie es uns ermöglicht, das Verhalten der Zelle, die oft auftreten rasch zu überwachen, und kann einfach während herkömmliche Zeitraffer-Bildgebung mit Hilfe der konfokalen entgehen lassen Mikroskopie. Der große Vorteil dieses Tests ist die Fähigkeit, Bildzellen über lange Zeiträume. Die Verwendung von Weitwinkel-6 statt konfokalen Laser Scanning Mikroskopie 7 ist von entscheidender Bedeutung für diese. Die konfokale Mikroskopie ist traditionell mehrere Vorteile gegenüber Weitfeld-Mikroskopie angeboten, einschließlich der Möglichkeit, optische Schnitte zu nehmen und zu beseitigen unscharf Informationen direkt <sup&gt; 7, aber die Verwendung einer Lochblende führt zu einem Verlust von Licht zu dem Detektor 8, ohne eine signifikante Menge an Information, und es muss längere Belichtungszeiten. Weitwinkel-Mikroskopie, auf der anderen Seite, verwendet volle Hellfeldbeleuchtung und alle das Licht, das durch das Objektiv mit dem Detektor gesandt. Dies gepaart mit einer hohen Quanteneffizienz gekühlt Coupled Device (CCD)-Kamera sorgt für Bildgebung mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu konfokalen Mikroskopie 9, mit sehr schnellen Belichtungszeiten. In unserer Anwendung müssen wir die Grafik für eine längere Zeit, Rekord 3D-Stacks und letztlich zu lösen kleine Beinahe-beugungsbegrenzte Strukturen. Obwohl der konfokalen Mikroskopie wird verhindert, out-of-focus Licht aus immer den Detektor erreicht und damit deutlich reduziert Hintergrundgeräusche in dicken, dicht-markierten Proben 7, 8, es werde nur ein brauchbares Signal-Rausch-Verhältnis mit viel größeren Licht-Eingang als breit- Mikroskopie 10. Für sehr lichtempfindlich sparsely-markierten Proben wie unsere elektroporierte Rückenmark Scheiben, deshalb führt Weitfeldmikroskopie besser als der konfokalen Mikroskopie. Wenn es mit Image-Wiederherstellung durch Entfaltung kombiniert, entfernt die Informationen aus dem Fokus und verbessert den Kontrast, wide-field ist dann besonders gut für die Erfassung von kleinen, dunklen Objekten 11. Während nicht für jede Tissue Imaging Experiment wurde dieser Ansatz als sehr wirksam für unsere Live Cell Imaging Anwendung. Die Wahl der fluoreszierende Protein ist ein wichtiger Faktor, der das Überleben der Zelle zu beeinflussen kann. Wir finden, dass die besten Ergebnisse, Konstrukte, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) 12 zu verwenden als Marker erhalten. Wir prüfen derzeit eine Reihe von rot fluoreszierende Proteine, die effektiv in Kombination mit GFP für Dual-Channel-Zeit erlischt, kann verwendet werden. Es gibt eine Vielzahl solcher Proteine ​​verfügbar 13. Obwohl viele Proteine ​​sind als Fusionen mit einem fluoreszierenden Protein stabilKönnen einige Proteine ​​unstabil gemacht werden durch Schmelzen, was zu einer verringerten Lebensfähigkeit der Zellen. In solchen Fällen ist die Verwendung von Konstrukten, die eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) nützlich, um das Protein von Interesse aus dem fluoreszierenden Protein zu trennen. Bei der Darstellung des Rückenmarks Scheiben, muss darauf geachtet werden, um die Exposition gegenüber Fluoreszenzlicht zu minimieren. Die Mikroskop-Okulare dürfen nur mit Durchlicht (Hellfeld) verwendet werden, zu lokalisieren und zu Position Scheiben schneiden. Fluoreszierende Bilder sollten immer aufgenommen mit der Mikroskop-Software mit minimalen Belichtungszeiten werden. Diese sollten in dem Bereich von 5-50 ms gehalten werden und die Verwendung von Neutralfilter sollte experimentiert werden. Obwohl längere Belichtungszeiten produzieren kann zunächst klarere Bilder, so können die phototoxische Effekte von Fluoreszenzlicht Exposition zum Zelltod führen. Die ersten 5-10 um Gewebe, das auf das Deckglas am nächsten ist nicht abgebildet, wie diese Region enthält Gewebe, das während geschädigt worden sein werdenSlicing. Obwohl die hier vorgestellten Beispiele von Embryonen bei HH Stadium 10 und abgebildeten 6-7 Stunden später elektroporiert sind, kann diese Methode für Embryonen verwendet werden, bis zu Stufe 18 HH. In späteren Stadien ist das Gewebe des Rückenmarks viel größer und so schwierig ist, von Hand zu schneiden. In diesen Fällen kann das Einbetten der Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Schneiden mit einem Vibratom zu besseren Ergebnissen. Obwohl wir diesen Test zu präsentieren als Verfahren zur Abbildung von Zellen im sich entwickelnden Rückenmark, hat dieser Ansatz auch auf andere Bild embryonalen Geweben, einschließlich der sensorischen Plakoden 3 geändert worden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Willco Dish </td><td> Willco Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% Tris </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> Harvard Instruments </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser </td></tr><tr><td> Elektroden (Genetrodes in ovo, L-förmigen </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm vergoldet </td></tr><tr><td> ECM 830 Quadratmeter Impulsgeber </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> für die in ovo electroopration </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Typ I-Kollagen-Ratte </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15-Medium (Pulver) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L in destilliertem Wasser für 5-fach-Lösung </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonat </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% ige Lösung </td></tr><tr><td> Neurobasalmedium </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> ohne Phenolrot </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x-Lösung </td></tr><tr><td> B-27 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 Medium (Flüssigkeit 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 Grad Neigung </td></tr><tr><td> Edelstahl-Gewindestifte </td><td> Watkins und Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Format DIN A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Elastomer </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Core-Mikroskop-System </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD-Kamera </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hochauflösende live-bildgebung von zell-verhalten in der entwicklung von neuroepithel

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Die embryonale Rückenmark besteht aus Radfahren neuronale Vorläuferzellen, die Anlass zu einem großen Prozentsatz der neuronalen und glialen Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS). Obwohl viel über die molekularen Mechanismen, die Muster des Rückenmarks bekannt ist und entlocken neuronalen Differenzierung 1, 2, fehlt uns ein tiefes Verständnis dieser frühen Ereignisse auf der Ebene des Verhaltens von Zellen. Es ist daher wichtig, das Verhalten der neuralen Vorläuferzellen in Echtzeit zu untersuchen, wie sie Neurogenese unterzogen. In der Vergangenheit Echtzeit-Bildgebung von frühen embryonalen Gewebe durch Zellen / Gewebe Lebensfähigkeit in Kultur als auch die phototoxische Effekte von Fluoreszenz-Bildgebung beschränkt. Hier präsentieren wir eine neuartige Assays für die Bildgebung solche Gewebe für längere Zeit, die Verwendung eines neuartigen Ex-vivo-Kokultur-Protokoll und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 1). Dieser Ansatz erzielt langfristige Zeitraffer-Überwachung von Kükenembryonen sPinal Schnur Progenitorzellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Dieser Assay modifiziert werden, um Bild eine Reihe von embryonalem Gewebe 3, 4 Neben der Beobachtung von zellulären und subzellulären Verhaltensweisen, die Entwicklung von neuartigen und hochsensiblen Reporter-Gen-Aktivität werden (z. B. Notch 5) macht diesen Test ein leistungsstarkes Tool, mit dem zu verstehen, wie Signalweg reguliert das Verhalten der Zelle während der embryonalen Entwicklung.

Imaging embryonalem Gewebe in Echtzeit wird über längere Zeit eine Herausforderung. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test zur Überwachung der zellulären und subzellulären Veränderungen im Rückenmark Küken für längere Zeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Diese Technik kann für andere Regionen des Nervensystems und sich entwickelnden Embryo angepasst werden.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

Das embryonale Rückenmark besteht aus proliferierenden neuralen Progenitorzellen, aus denen ein großer Prozentsatz der neuronalen und glialen Zellen des zentralen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Verhalten von Zellen innerhalb des embryonalen Neuralrohrs über einen langen Zeitraum mit hoher Auflösung abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das frühe Neuralrohr mit einem Konstrukt durchtrennt wird, das die Expression eines beliebigen fluoreszierenden Proteins zur Markierung einzelner Zellen steuert. Im nächsten Schritt werden Schnitte des frühen Embryos angefertigt und auf Glasbodenkulturschalen montiert.Nach der Regeneration im Inkubator werden die Embryoschnitte in regelmäßigen Abständen an einem Weitfeldmikroskop abgebildet. Letztendlich kann diese Technik verwendet werden, um das Zellverhalten im sich entwickelnden Neuroepithel über längere Zeiträume mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Bildgebung von lebendem Gewebe liegt darin, dass sie es uns ermöglicht, das Verhalten einzelner Zellen über längere Zeiträume mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beobachten.Diese Methode ermöglicht es Ihnen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Entwicklungsneurobiologie zu untersuchen, wie beispielsweise die Rolle der Orientierung des Mitosespindels bei der Sulfatwahl oder wie Signalübertragungsdynamiken das Zellverhalten vor der Elektroporation von Plasmiden in das Neuralrohr regulieren könnten. Glasnadeln werden mithilfe eines Mikrokappillarziehers unter einem Stereomikroskop hergestellt. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Nadelspitze abzubrechen.Die Nadelspitze sollte scharf genug sein, um den Neuralrohr zu durchdringen, gleichzeitig aber nicht so eng, dass die Injektion der DNA-Lösung behindert wird. Die X für dieses Experiment wurden etwa 36 Stunden bei 37 Grad Celsius bis zum Hamburger-Hamilton-Stage-10 inkubiert.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Fenster öffnen, das Ei präparieren und Elektroden im Abstand von fünf Millimetern beidseitig des Embryos platzieren. Injizieren Sie DNA in den Neuralrohr. Die DNA ist mit einer geringen Menge Fast Green zur Visualisierung eingefärbt. Geben Sie einen Strom von 12 bis 17 Volt mit einer Impulsdauer von 50 Millisekunden dreimal mit jeweils 950 Millisekunden Pause zwischen den Impulsen an.Es werden niedrige DNA-Konzentrationen und niedrige Elektroporations-Spannungen verwendet, um eine mosaikartige Expression zu erzielen, sodass einzelne Zellen verfolgt werden können. Schließlich die Öffnung in der Eierschale mit Klebeband abdecken und sicherstellen, dass sie luftdicht verschlossen ist. Die Embryonen drei bis vier Stunden oder über Nacht bei 37 Grad Celsius regenerieren lassen.Das Kollagen-Gemisch und das Schnittkultur-Medium sollten etwa eine Stunde vor dem Schneiden der Embryonen vorbereitet werden. Um das Kollagen-Gemisch herzustellen, 100 µL einer 0,1 %igen Essigsäurelösung zu 300 µL Typ-I-Kollagen geben und gründlich vortexen; anschließend 100 µL fünfmal konzentriertes L-15-Medium hinzufügen und erneut gründlich vortexen. Die Lösung sollte erneut gelb färben.Fügen Sie anschließend 15 bis 20 Mikroliter einer 7,5 %igen Natriumbicarbonat-Lösung hinzu und wirbeln Sie gründlich um. Die Lösung sollte leicht rosa werden. Lagern Sie sie weiterhin auf Eis.Dieses Kollagen-Gemisch sollte jedes Mal frisch hergestellt werden. Um das Schnittkulturmedium herzustellen, die folgenden Komponenten zu 10 Milliliter Neurobasal-Medium, B-27-Zusatz, Glutamax und Gentamycinlösung hinzufügen, das Medium in einen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid gepufferten Inkubator stellen. Den Behälter locker verschließen, damit er sich mindestens eine Stunde lang mit dem Kohlendioxid ausgleichen kann.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einer kleinen Schere den Embryo ausschneiden. Entfernen Sie den Embryo mit einer Pinzette aus dem Ei, wobei Sie ihn mit L-15-Medium spülen. Legen Sie den Embryo in eine Zellkulturschale, die am Boden eine Schicht Sylgard aufweist.Fixieren Sie das Embryo durch die umgebenden extraembryonalen Membranen, sodass die Membranen straff gespannt sind. Schneiden Sie mit einem Mikromesser das Embryo möglichst gerade durch die Region von Interesse. Für Rückenmarkschnitte sollten die Schnitte ein bis zwei Somiten dick sein; die Schnittblätter bleiben dabei am seitlichen Gewebe des Embryos befestigt, damit sie nicht verloren gehen, während andere Embryonen präpariert werden.Ein maßgeschneiderter Mikro-Perpet-Tipp ist erforderlich, um die Rückenmarksschnitte in die Glasbodenschale zu überführen. Bereiten Sie diesen vor, indem Sie einen 200-Mikroliter-Tipp an einem P2 oder P10-Perman befestigen und etwa einen Millimeter vom Ende des Tips abschneiden. Beschichten Sie das Innere des Tips mit Kollagen, indem Sie einen Mikroliter der zuvor hergestellten Kollagenmischung vorbereiten.Ein bis zwei Minuten einwirken lassen und anschließend mit L-15-Medium ausspülen. Dies verhindert, dass das Gewebe an der Innenseite der Pipettenspitze haftet. Nun mit einem Mikromesser eine Scheibe vom Embryo ablösen und die Scheibe mithilfe einer P2- oder P10-Pipette, ausgestattet mit einer 200-Mikroliter-Spitze, aus der Petrischale entfernen.Versuchen Sie, so wenig Medium wie möglich aufzunehmen. Vortexen Sie die Kollagenmischung und geben Sie fünf bis acht Mikroliter davon auf eine mit Poly-L-Lysin beschichtete Glasbodenkulturschale mit Deckglas als Untergrund. Legen Sie den Embryoschnitt sofort in das Kollagen und positionieren Sie ihn mit einer feinen Pinzette. Die LICs sollten so positioniert werden, dass die zu bildgebende Seite bündig mit dem Deckglas liegt.Das Gewebe sollte sich an die Polyol-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas heften. Wiederholen Sie dies, bis mehrere Schnitte auf dem Deckglas liegen. Üblicherweise werden sechs bis neun Schnitte in eine Schale gegeben.Wenn alle Schnitte platziert sind, geben Sie zwei bis drei Mikroliter L-15-Medium an die früheste Stelle des Kollagens und bedecken Sie die Petrischale. Lassen Sie das Kollagen 20 Minuten lang aushärten. Sobald das Kollagen ausgehärtet ist, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter Schnittkulturmedium hinzu, das mindestens eine Stunde lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius equilibriert wurde.Es ist darauf zu achten, dass das Kollagen nicht von dem Deckglas gelöst wird; dieses wird in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gestellt, und die Schnitte müssen mindestens drei Stunden vor der Bildaufnahme zur Erholung bleiben. Die langzeitige Aufnahme des Zellverhaltens innerhalb von Gewebe mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ist herausfordernd. Eine Kombination aus optimalen Kulturbedingungen und der Verwendung der Hellfeldmikroskopie ist entscheidend, um gute Ergebnisse zu erzielen.Ein Delta-Vision-Core-Weitfeldmikroskop, das mit einer Umweltkammer vom Typ Weather Station ausgestattet ist, wird zum Abbilden der Schnitte verwendet. Die Kammer wird konstant bei 37 Grad Celsius gehalten, wobei eine CO₂-Zufuhrvorrichtung dafür sorgt, dass auf der Mikroskopbühne 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft herrschen. Die Aufnahmen werden normalerweise mit einem 40-fach-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,30 durchgeführt, und die Bilder werden mit einer Core-Snap-HQ2-Kühl-CCD-Kamera aufgenommen. Z-Schnitte werden alle 1,5 Mikrometer über eine Gewebetiefe von 45 Mikrometern aufgenommen. Die Belichtungszeit sollte so gering wie möglich gehalten werden, beispielsweise zwischen fünf und 50 Millisekunden.Für jeden genannten Abschnitt werden alle sieben Minuten Bilder aufgenommen. Mit den Delta-Vision-Systemen können bis zu neun Schnitte angefahren werden. Die hier gezeigte Funktion zur präzisen Positionsanfahrt zeigt eine Beispiel-Zeitraffersequenz einer Vorläuferzelle des Rückenmarks, die mit einem Konstrukt transfectiert wurde, das GFP-alpha-Tubulin exprimiert; die Bildaufnahme wurde an einem Rückenmarksschnitt aus einem zwei Tage alten Embryo im HH-Stadium 12 begonnen.In diesem frühen Stadium durchlaufen neurale Vorläuferzellen vorwiegend Teilungen im Vorläufer-Vorläufer-Modus, bei denen die Zellen sich teilen und zwei weitere proliferierende Vorläuferzellen hervorbringen. Diese Abbildung zeigt ausgewählte Einzelbilder aus der soeben gezeigten Zeitrafferaufnahme. Nach zwei Stunden und 20 Minuten teilt sich die Zelle entlang einer Spaltechene, die senkrecht zur apikalen Oberfläche verläuft, und erzeugt so zwei Tochterzellen.Diese beiden Zellen teilen sich erneut nach 24 Stunden und 23 Minuten sowie nach 25 Stunden und 54 Minuten. Diese nächste Zeitrafferaufnahme zeigt eine mit G-F-P-G-P-I markierte Zelle, die die Zellmembran hervorhebt. Diese Zelle teilt sich, wobei sich der basale Fortsatz, wie durch die weißen Pfeile angezeigt, in zwei Teile spaltet und gleichmäßig auf die Tochterzellen übergeht.Ausgewählte Einzelbilder aus dieser Zeitrafferaufnahme zeigen, dass die Zellteilung bei null Stunden und 49 Minuten erfolgt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine klare Vorstellung davon haben, wie man Schnitte des Rückenmarks präpariert und bildlich darstellt. Beachten Sie: Wenn Sie neu in dieser Methode sind, könnten Sie zunächst Schwierigkeiten haben, da mehrere technisch anspruchsvolle Arbeitsschritte präzise aufeinander abgestimmt werden müssen, damit das Verfahren erfolgreich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

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