Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Verhalten von Zellen innerhalb des embryonalen Neuralrohrs über einen langen Zeitraum mit hoher Auflösung abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das frühe Neuralrohr mit einem Konstrukt durchtrennt wird, das die Expression eines beliebigen fluoreszierenden Proteins zur Markierung einzelner Zellen steuert. Im nächsten Schritt werden Schnitte des frühen Embryos angefertigt und auf Glasbodenkulturschalen montiert.

Nach der Regeneration im Inkubator werden die Embryoschnitte in regelmäßigen Abständen an einem Weitfeldmikroskop abgebildet. Letztendlich kann diese Technik verwendet werden, um das Zellverhalten im sich entwickelnden Neuroepithel über längere Zeiträume mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Bildgebung von lebendem Gewebe liegt darin, dass sie es uns ermöglicht, das Verhalten einzelner Zellen über längere Zeiträume mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beobachten.

Diese Methode ermöglicht es Ihnen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Entwicklungsneurobiologie zu untersuchen, wie beispielsweise die Rolle der Orientierung des Mitosespindels bei der Sulfatwahl oder wie Signalübertragungsdynamiken das Zellverhalten vor der Elektroporation von Plasmiden in das Neuralrohr regulieren könnten. Glasnadeln werden mithilfe eines Mikrokappillarziehers unter einem Stereomikroskop hergestellt. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Nadelspitze abzubrechen.

Die Nadelspitze sollte scharf genug sein, um den Neuralrohr zu durchdringen, gleichzeitig aber nicht so eng, dass die Injektion der DNA-Lösung behindert wird. Die X für dieses Experiment wurden etwa 36 Stunden bei 37 Grad Celsius bis zum Hamburger-Hamilton-Stage-10 inkubiert.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Fenster öffnen, das Ei präparieren und Elektroden im Abstand von fünf Millimetern beidseitig des Embryos platzieren. Injizieren Sie DNA in den Neuralrohr. Die DNA ist mit einer geringen Menge Fast Green zur Visualisierung eingefärbt. Geben Sie einen Strom von 12 bis 17 Volt mit einer Impulsdauer von 50 Millisekunden dreimal mit jeweils 950 Millisekunden Pause zwischen den Impulsen an.

Es werden niedrige DNA-Konzentrationen und niedrige Elektroporations-Spannungen verwendet, um eine mosaikartige Expression zu erzielen, sodass einzelne Zellen verfolgt werden können. Schließlich die Öffnung in der Eierschale mit Klebeband abdecken und sicherstellen, dass sie luftdicht verschlossen ist. Die Embryonen drei bis vier Stunden oder über Nacht bei 37 Grad Celsius regenerieren lassen.

Das Kollagen-Gemisch und das Schnittkultur-Medium sollten etwa eine Stunde vor dem Schneiden der Embryonen vorbereitet werden. Um das Kollagen-Gemisch herzustellen, 100 µL einer 0,1 %igen Essigsäurelösung zu 300 µL Typ-I-Kollagen geben und gründlich vortexen; anschließend 100 µL fünfmal konzentriertes L-15-Medium hinzufügen und erneut gründlich vortexen. Die Lösung sollte erneut gelb färben.

Fügen Sie anschließend 15 bis 20 Mikroliter einer 7,5 %igen Natriumbicarbonat-Lösung hinzu und wirbeln Sie gründlich um. Die Lösung sollte leicht rosa werden. Lagern Sie sie weiterhin auf Eis.

Dieses Kollagen-Gemisch sollte jedes Mal frisch hergestellt werden. Um das Schnittkulturmedium herzustellen, die folgenden Komponenten zu 10 Milliliter Neurobasal-Medium, B-27-Zusatz, Glutamax und Gentamycinlösung hinzufügen, das Medium in einen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid gepufferten Inkubator stellen. Den Behälter locker verschließen, damit er sich mindestens eine Stunde lang mit dem Kohlendioxid ausgleichen kann.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit einer kleinen Schere den Embryo ausschneiden. Entfernen Sie den Embryo mit einer Pinzette aus dem Ei, wobei Sie ihn mit L-15-Medium spülen. Legen Sie den Embryo in eine Zellkulturschale, die am Boden eine Schicht Sylgard aufweist.

Fixieren Sie das Embryo durch die umgebenden extraembryonalen Membranen, sodass die Membranen straff gespannt sind. Schneiden Sie mit einem Mikromesser das Embryo möglichst gerade durch die Region von Interesse. Für Rückenmarkschnitte sollten die Schnitte ein bis zwei Somiten dick sein; die Schnittblätter bleiben dabei am seitlichen Gewebe des Embryos befestigt, damit sie nicht verloren gehen, während andere Embryonen präpariert werden.

Ein maßgeschneiderter Mikro-Perpet-Tipp ist erforderlich, um die Rückenmarksschnitte in die Glasbodenschale zu überführen. Bereiten Sie diesen vor, indem Sie einen 200-Mikroliter-Tipp an einem P2 oder P10-Perman befestigen und etwa einen Millimeter vom Ende des Tips abschneiden. Beschichten Sie das Innere des Tips mit Kollagen, indem Sie einen Mikroliter der zuvor hergestellten Kollagenmischung vorbereiten.

Ein bis zwei Minuten einwirken lassen und anschließend mit L-15-Medium ausspülen. Dies verhindert, dass das Gewebe an der Innenseite der Pipettenspitze haftet. Nun mit einem Mikromesser eine Scheibe vom Embryo ablösen und die Scheibe mithilfe einer P2- oder P10-Pipette, ausgestattet mit einer 200-Mikroliter-Spitze, aus der Petrischale entfernen.

Versuchen Sie, so wenig Medium wie möglich aufzunehmen. Vortexen Sie die Kollagenmischung und geben Sie fünf bis acht Mikroliter davon auf eine mit Poly-L-Lysin beschichtete Glasbodenkulturschale mit Deckglas als Untergrund. Legen Sie den Embryoschnitt sofort in das Kollagen und positionieren Sie ihn mit einer feinen Pinzette. Die LICs sollten so positioniert werden, dass die zu bildgebende Seite bündig mit dem Deckglas liegt.

Das Gewebe sollte sich an die Polyol-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas heften. Wiederholen Sie dies, bis mehrere Schnitte auf dem Deckglas liegen. Üblicherweise werden sechs bis neun Schnitte in eine Schale gegeben.

Wenn alle Schnitte platziert sind, geben Sie zwei bis drei Mikroliter L-15-Medium an die früheste Stelle des Kollagens und bedecken Sie die Petrischale. Lassen Sie das Kollagen 20 Minuten lang aushärten. Sobald das Kollagen ausgehärtet ist, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter Schnittkulturmedium hinzu, das mindestens eine Stunde lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius equilibriert wurde.

Es ist darauf zu achten, dass das Kollagen nicht von dem Deckglas gelöst wird; dieses wird in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gestellt, und die Schnitte müssen mindestens drei Stunden vor der Bildaufnahme zur Erholung bleiben. Die langzeitige Aufnahme des Zellverhaltens innerhalb von Gewebe mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ist herausfordernd. Eine Kombination aus optimalen Kulturbedingungen und der Verwendung der Hellfeldmikroskopie ist entscheidend, um gute Ergebnisse zu erzielen.

Ein Delta-Vision-Core-Weitfeldmikroskop, das mit einer Umweltkammer vom Typ Weather Station ausgestattet ist, wird zum Abbilden der Schnitte verwendet. Die Kammer wird konstant bei 37 Grad Celsius gehalten, wobei eine CO₂-Zufuhrvorrichtung dafür sorgt, dass auf der Mikroskopbühne 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft herrschen. Die Aufnahmen werden normalerweise mit einem 40-fach-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,30 durchgeführt, und die Bilder werden mit einer Core-Snap-HQ2-Kühl-CCD-Kamera aufgenommen. Z-Schnitte werden alle 1,5 Mikrometer über eine Gewebetiefe von 45 Mikrometern aufgenommen. Die Belichtungszeit sollte so gering wie möglich gehalten werden, beispielsweise zwischen fünf und 50 Millisekunden.

Für jeden genannten Abschnitt werden alle sieben Minuten Bilder aufgenommen. Mit den Delta-Vision-Systemen können bis zu neun Schnitte angefahren werden. Die hier gezeigte Funktion zur präzisen Positionsanfahrt zeigt eine Beispiel-Zeitraffersequenz einer Vorläuferzelle des Rückenmarks, die mit einem Konstrukt transfectiert wurde, das GFP-alpha-Tubulin exprimiert; die Bildaufnahme wurde an einem Rückenmarksschnitt aus einem zwei Tage alten Embryo im HH-Stadium 12 begonnen.

In diesem frühen Stadium durchlaufen neurale Vorläuferzellen vorwiegend Teilungen im Vorläufer-Vorläufer-Modus, bei denen die Zellen sich teilen und zwei weitere proliferierende Vorläuferzellen hervorbringen. Diese Abbildung zeigt ausgewählte Einzelbilder aus der soeben gezeigten Zeitrafferaufnahme. Nach zwei Stunden und 20 Minuten teilt sich die Zelle entlang einer Spaltechene, die senkrecht zur apikalen Oberfläche verläuft, und erzeugt so zwei Tochterzellen.

Diese beiden Zellen teilen sich erneut nach 24 Stunden und 23 Minuten sowie nach 25 Stunden und 54 Minuten. Diese nächste Zeitrafferaufnahme zeigt eine mit G-F-P-G-P-I markierte Zelle, die die Zellmembran hervorhebt. Diese Zelle teilt sich, wobei sich der basale Fortsatz, wie durch die weißen Pfeile angezeigt, in zwei Teile spaltet und gleichmäßig auf die Tochterzellen übergeht.

Ausgewählte Einzelbilder aus dieser Zeitrafferaufnahme zeigen, dass die Zellteilung bei null Stunden und 49 Minuten erfolgt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine klare Vorstellung davon haben, wie man Schnitte des Rückenmarks präpariert und bildlich darstellt. Beachten Sie: Wenn Sie neu in dieser Methode sind, könnten Sie zunächst Schwierigkeiten haben, da mehrere technisch anspruchsvolle Arbeitsschritte präzise aufeinander abgestimmt werden müssen, damit das Verfahren erfolgreich ist.