Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Zellverhalten innerhalb des embryonalen Neuralrohrs über lange Zeiträume mit hoher Auflösung abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das frühe Neuralrohr mit einem Konstrukt durchtrennt wird, das die Expression eines fluoreszierenden Proteins seiner Wahl zur Markierung einzelner Zellen antreibt. Der nächste Schritt besteht darin, Scheiben des frühen Embryos herzustellen und sie auf Glasböden zu montieren.

Nach der Genesung in einem Inkubator werden die Embryoschnitte in regelmäßigen Abständen auf einem Weitfeldmikroskop abgebildet. Letztendlich kann diese Technik verwendet werden, um das Zellverhalten innerhalb des sich entwickelnden Neuroepithels über lange Zeiträume mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Bildgebung von lebendem Gewebe besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, das Verhalten einzelner Zellen über lange Zeiträume mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beobachten.

Mit dieser Methode können Sie Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entwicklungsneurobiologie beantworten, wie z.B. die Rolle der mitotischen Spindelorientierung bei der Sulfatwahl oder wie die Signaldynamik das Zellverhalten vor der Elektroporation von Plasmiden in das Neuralrohr regulieren könnte. Die Glasnadeln werden mit einem Mikrokapillarzieher unter einem Präpariermikroskop präpariert. Brechen Sie mit einer feinen Pinzette die Spitze der Nadel ab.

Das Ende der Nadel sollte scharf genug sein, um das Neuralrohr zu durchstechen, aber nicht so schmal, dass es die Injektion der DNA-Lösung behindert. Die X für dieses Experiment wurden bei 37 Grad Celsius für etwa 36 Stunden zum Hamburger Hamilton inkubiert. Stufe 10.

Um dieses Verfahren zu beginnen, öffnen Sie das Fenster und die Eizelle und platzieren Sie Elektroden im Abstand von fünf Millimetern auf beiden Seiten des Embryos und injizieren Sie DNA in das Neuralrohr. Die DNA wird zur Visualisierung mit einer kleinen Menge Schnellgrün eingefärbt. Wenden Sie dreimal einen Strom von 12 bis 17 Volt und eine Impulslänge von 50 Millisekunden an, wobei zwischen den Impulsen 950 Millisekunden liegen.

Niedrige DNA-Konzentrationen und niedrige Elektroporationsspannungen werden verwendet, um eine Mosaikexpression zu erreichen, so dass einzelne Zellen verfolgt werden können. Decken Sie zum Schluss das Fenster mit der Eierschale mit Kellerband ab und achten Sie darauf, dass es dicht ist. Lassen Sie die Embryonen sich drei bis vier Stunden lang oder über Nacht bei 37 Grad Celsius erholen.

Die Kollagenmischung und das Schnittkulturmedium sollten etwa eine Stunde vor dem Schneiden der Embryonen vorbereitet werden. Um die Kollagenmischung bei 100 Mikrolitern 0,1%iger Essigsäurelösung auf 300 Mikroliter Kollagen Typ 1 und Wirbel gründlich vorzubereiten, fügen Sie 100 Mikroliter fünfmal L 15, Medium und Wirbel gründlich hinzu. Auch hier sollte sich die Lösung gelb verfärben.

Fügen Sie als nächstes 15 bis 20 Mikroliter 7,5% Natriumbicarbonat hinzu und wirbeln Sie es gründlich ein. Die Lösung sollte leicht rosa werden. Bleiben Sie auf Eis.

Diese Kollagenmischung sollte jedes Mal frisch zubereitet werden. Um das Scheibenkulturmedium wie folgt auf 10 Milliliter neurobasales Medium, B 27 Supplement Glut Max und Gentamycin-Lösung vorzubereiten, geben Sie das Medium in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, gepuffert mit 5% Kohlendioxid. Lassen Sie den Deckel des Behälters locker, damit er sich mindestens eine Stunde lang mit dem Kohlendioxid ausgleichen kann.

Um diesen Vorgang zu beginnen, verwenden Sie eine kleine Schere, um den Embryo herauszuschneiden. Entnehmen Sie den Embryo mit einer Pinzette aus der Eizelle, die L 15 medium wäscht. Legen Sie den Embryo in eine Gewebekulturschale mit einer Schicht Sylschutz an der Unterseite.

Stecken Sie den Embryo durch die umgebenden zusätzlichen embryonalen Membranen, so dass die Membranen straff gedehnt werden. Schneiden Sie den Embryo mit einem Mikromesser so gerade wie möglich durch die interessierende Region. Bei Rückenmarksschnitten sollten zwischen ein und zwei Somiten dicke Blattscheiben am Seitengewebe des Embryos befestigt werden, damit sie nicht verloren gehen, während andere Embryonen geschnitten werden.

Für die Übertragung der Rückenmarksscheiben in die Glasbodenschale wird eine kundenspezifische Mikroperpet-Spitze benötigt. Um dies zuzubereiten, befestigen Sie eine 200-Mikroliter-Spitze an einer P zwei oder P 10 perman und schneiden Sie etwa einen Millimeter vom Ende der Spitze ab. Kodieren Sie die Innenseite der Spitze mit Kollagen, indem Sie einen Mikroliter der zuvor zubereiteten Kollagenmischung vorbereiten.

Ein bis zwei Minuten einwirken lassen und dann mit L 15 medium abspülen. So wird verhindert, dass das Taschentuch an der Innenseite der Spitze kleben bleibt. Lösen Sie nun mit einem Mikromesser eine Scheibe vom Embryo und entfernen Sie die Scheibe mit dem P two oder P 10 mit der 200-Mikroliter-Spitze aus der Schale.

Versuchen Sie, so wenig Medium wie möglich aufzunehmen. Wirbeln Sie die Kollagenmischung vor und tropfen Sie fünf bis acht Mikroliter davon auf eine mit Polyol-Lysin beschichtete Glasbodenschale mit einem Deckglas als Basis, legen Sie die Embryoscheibe sofort in das Kollagen und positionieren Sie sie mit einer feinen Pinzette. LICs sollten so positioniert werden, dass die abzubildende Seite bündig mit dem Deckglas abschließt.

Das Gewebe sollte an der Polyol-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas haften. Wiederholen Sie dies, bis Sie mehrere Scheiben auf dem Deckglas haben. In der Regel werden sechs bis neun Scheiben auf eine Schüssel gelegt.

Wenn alle Scheiben an Ort und Stelle sind, fügen Sie zwei bis drei Mikroliter L 15 hinzu, Kollagen mit mittlerer bis frühester Stelle und decken Sie die Schüssel ab. Lassen Sie das Kollagen 20 Minuten lang einwirken. Sobald das Kollagen ausgehärtet ist, fügen Sie vorsichtig zwei Milliliter Scheibenkulturmedium hinzu, das mindestens eine Stunde lang in 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius äquilibriert wurde.

muss darauf geachtet werden, dass sich das Kollagen nicht vom Deckglas löst, in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid legen und die Scheiben mindestens drei Stunden lang vor der Bildgebung erholen lassen. Die Abbildung des Zellverhaltens im Gewebe über lange Zeiträume mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ist eine Herausforderung. Eine Kombination aus optimalen Kulturbedingungen und dem Einsatz von Weißfeldmikroskopie ist unerlässlich, um gute Ergebnisse zu erzielen.

Zur Abbildung der Schichten wird ein Kern-Weitfeldmikroskop von Delta Vision verwendet, das mit einer Klimakammer für eine Wetterstation ausgestattet ist. Die Kammer wird mit einem Kohlendioxid-Perfusionsgerät konstant auf 37 Grad Celsius gehalten, um den Mikroskoptisch bei 5 % Kohlendioxid und 95 % zu halten. Die Luftbildgebung wird normalerweise mit einer 40-fachen 1,30-NA-Ölimmersionslinse durchgeführt, und die Bilder werden mit einem Core Snap HQ, zwei, der CCD-Kamera, aufgenommen. Z-Schnitte werden alle 1,5 Mikrometer bis 45 Mikrometer Gewebeexposition aufgenommen. Die Zeit sollte so gering wie möglich gehalten werden, zum Beispiel fünf bis 50 Millisekunden.

Für jeden dieser Abschnitte werden alle sieben Minuten Bilder aufgenommen. Bis zu neun Scheiben können mit den Delta-Bildverarbeitungssystemen besucht werden. Die hier gezeigte präzise Punktbesuchsfunktion ist ein Beispiel für eine Zeitraffersequenz einer Vorläuferzelle des Rückenmarks, die mit einem Konstrukt transfiziert wurde, das GFP alpha exprimiert. Die Tubulin-Bildgebung wurde an einem Rückenmarksschnitt eines zwei Tage alten HH-Embryos im Stadium 12 gestartet.

In diesem frühen Stadium durchlaufen neurale Vorläuferzellen überwiegend Vorläuferzellenteilungen, bei denen sich die Zellen teilen, um zwei weitere zyklische Vorläuferzellen zu erzeugen. Diese Abbildung zeigt ausgewählte Bilder aus der soeben gezeigten Zeitraffersequenz. Nach zwei Stunden und 20 Minuten teilt sich die Zelle mit einer Spaltebene, die senkrecht zur apikalen Oberfläche verläuft, wodurch zwei Tochterzellen entstehen.

Diese beiden Zellen teilen sich nach 24 Stunden und 23 Minuten und 25 Stunden und 54 Minuten erneut. Diese nächste Zeitraffersequenz zeigt eine Zelle, die mit G-F-P-G-P-I transfiziert wurde und die Zellmembran markiert. Diese Zelle durchläuft eine Teilung, bei der sich der Basalfortsatz in zwei Teile aufteilt, die durch die weißen Pfeile gekennzeichnet sind, und zu gleichen Teilen an die Tochterzellen vererbt wird.

Ausgewählte Bilder aus dieser Zeitraffersequenz zeigen, dass die Zellteilung bei null Stunden und 49 Minuten erfolgt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie Rückenmarksschnitte vorbereiten und abbilden können. Denken Sie daran, wenn Sie mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, können Sie anfangs Schwierigkeiten haben, da es eine Reihe von technisch anspruchsvollen Schritten gibt, die alle zusammenkommen müssen, damit dies funktioniert.