Name: Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Lernen Sie eine optimierte Methode zur Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression in kleinen, anatomisch definierten Gehirnbereichen von Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung epigenetischer Veränderungen durch frühen Stress.

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Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Institut für Psychiatrie und der Europäischen Union im Marie-Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665) gefördert.

1. Die Programmierung von Early Life Missgeschick Mütterliche Trennung (MS) durchgeführt wird, um früh-Life-Stress (ELS) bei Jungtieren durch timed-trächtigen Mäusen C57BL/6N (postnatalen Tag 0 (P0) am Tag der Geburt) geliefert zu induzieren. <ol><li> Einzelne Würfe in sauberen Käfigen (mit Heizkissen) für 3 h täglich von P1-10. </li><li> Control (Nicht-ELS) Jungtiere ungestört im mütterlichen Nest ganz. </li><li> Die Jungen werden mit ihren Müttern bis zum Absetzen (P21), nach welcher Zeit sie in Sex-angepassten Gruppen (3-5 Mäuse pro Käfig) unter Standardbedingungen Versuchstier Haltungsbedingungen untergebracht sind, gehalten. </li></ol> 2. Isolierung und Präparation von Hirngewebe <ol><li> . Mäuse werden an gewünschten Zeiten durch Genickbruch getötet Hinweis: weil dieses Protokoll beinhaltet eine Stress-Paradigma, keine Betäubung vor dem Genickbruch gegeben, nicht zu stören normalen physiologischen Regulation von Stresshormonen. Schädel geöffnet undGehirn werden sorgfältig entfernt und sofort schockgefroren durch Eintauchen in Isopentan-Trockeneis, bevor es bei -80 ° C gelagert </li><li> Gehirne sind kryogeschnitten (10 um Dicke); Abschnitte sind auf Superfrost Glasobjektträger montiert und bei -20 ° C Verweis auf eine Standard-Maus stereotaktischen Atlas (zB Paxinos 6) wird verwendet, um anatomische Präzision zu verifizieren und Einbeziehung der Region of Interest (zB für Neuronen im PVN gewährleisten - PVN - sammeln Abschnitten zunächst auf der Ebene des rostralen PVN, Bregma -0,75 bis -0,85). </li><li> Die Schnitte werden mit Kresylviolett gefärbt, um die Identifizierung der verschiedenen Hirnstrukturen zu erleichtern. Stempel (0,8 mm) der Bereiche von Interesse (zB PVN) durch in loco Mikrodissektion erhalten. </li></ol> 3. Nukleinsäure-Extraktion von Brain Punches Ein optimiertes Protokoll für die gleichzeitige Gewinnung von DNA und RNA aus winzigen Gehirn definiert neuroanatomisch-regIonen für die Bisulfit-und Genexpressionsanalysen 7 beschrieben wird. Hinweis: Unter Berücksichtigung, dass die RNA weniger stabil als DNA in der GTC-Puffer ist, empfehlen wir die Verarbeitung RNA zuerst. Das Homogenat zur DNA-Reinigung verwendet werden kann bei Raumtemperatur (RT) während dieser Zeit gehalten werden. <ol><li> Homogenisieren Stempel mit einer Pipette und Vortexer in 400 ul Guanidiniumthiocyanat (GTC)-Puffer (4,5 M Guanidiniumthiocyanat, 2% N-Lauroylsarcosin, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-Mercaptoethanol, 0,2% Antischaummittel A) bei RT, vorbei mehrmals durch eine Injektionsspritze (29G) (Abbildung 2). </li><li> Split Lysat in gleiche Teile, sowohl RNA und DNA kann zur gleichen Zeit gewonnen werden oder getrennt, abhängig von den jeweiligen experimentellen Anforderungen. </li><li> Für die RNA-Reinigung hinzufügen 1/10 Volumen von NaOAc, 1 Volumen AquaPhenol (Appligene) (pH 4) und 1/2 Volumen Chloroform: Isoamylalkohol (24:1) bis Lysat. Vortex kräftig nach jedem Schritt undInkubation auf Eis für 10 min, Zentrifuge (20 min bei 10.000 g bei 4 ° C); ein gleiches Volumen von 70% EtOH zu wässrigen Phase, die. </li><li> Übertragen Mischung, um ein RNA-Spin-Säule (zB NucleoSpin RNA II von Macherey-Nagel) und führen On-Column-DNase-Verdauung und Waschschritte (folgen Sie dem Protokoll des Herstellers); eluieren RNA in 25 ul H 2 O. </li><li> Für die DNA-Aufreinigung ein optimiertes Protokoll des Qiagen DNeasy Blut und Gewebe Kit verwendet wird. Äquilibrieren Lysat mit gleichen Volumina von Buffer AL und 100% EtOH, Last auf eine Spin-Säule zentrifugieren (1 min bei 10.000 g bei RT) und Durchfluss abschütten. </li><li> Fügen Sie 500 ul Buffer AW1, darunter 5 ul RNAse (1 mg / ml) zur Säule und Inkubation 10 min bei RT. Spin (1 min bei 10.000 g, RT) und Durchfluss abschütten. </li><li> Waschkolonne mit 500 ul Buffer AW2, Durchfluss-und Spin-trockenen leeren Spalte (1 min bei 15.000 g) zu verwerfen. </li><li> In vorgewärmte (70 ° C) Buffer AE und inkubieren Spalten für 10 min bei 70 ° C Eluieren durch Zentrifugation (1 min, 10.000 g), tragen Sie Flow-Through-und Zentrifugationsschritt wiederholen. </li></ol> Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur DNA-und RNA-Konzentrationen zu bestimmen. Ein typisches PVN Punsch Ausbeuten ~ 600 ng DNA und ~ 400 ng RNA. Für die Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR (qPCR), wir verwenden in der Regel ~ 100 ng RNA in die Reverse Transkription-Reaktion. 4. Bisulfit-Konvertierung Natriumbisulfit wird verwendet, um nicht-methylierte Cytosine zu Uracile konvertieren. Im Gegensatz dazu sind methylierte Cytosine aus der Umwandlung geschützt. Daher stellen alle Cytosine, die in der endgültigen Sequenzierung des PCR-Amplikon Bisulfit erkannt werden methylierte Cytosine. Bisulfit-Konvertierung verursacht erheblichen Abbau der DNA, die ein begrenzender Faktor sein können in PCR-Analyse. Optimierten Reaktionsbedingungen, die Cytosin-Konversion zu maximieren, DNA-Fragmentierung zu reduzieren und zu pflegen Einzelstrang-DNA auch bei niedrigeren Temperaturen kann erreicht werden durchQIAGENs EpiTect-Bisulfit-Kit. In unseren Händen ~ 200 ng DNA aus micropunches gereinigt eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial für die Bisulfit-Umsetzung. Um die Unterschiede in der Effizienz der Umwandlung Reaktion zu verhindern, sollte die Menge der Ziel-DNA konstant gehalten werden bei allen Proben, die während eines Experiments verarbeitet. Darüber hinaus liest Sequenz sollte für Umwandlungseffizienz durch Untersuchen der Anzahl der nicht umgesetzten nicht CpGs geprüft werden. Dieser Satz sollte höchstens 98% betragen. Niedrigere Werte weisen auf unvollständige oder ineffizient Bisulfit-Konvertierung und die zugrunde liegenden Sequenzen sollten aus der Analyse ausgeschlossen werden. 5. Bisulfit-PCR <ol><li> Design-Bisulfit-Sequenzierung Primer, die spezifisch für Bisulfit-konvertierter DNA (siehe Diskussion) sind; Methyl Primer Express-Software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ De / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) wird diese Hilfe und helfen, optimale Annealing-Temperaturen in Pilotversuchen zu bestimmen. </li><li> Planen PCR-Master-Mix (für eine Reaktion) wie folgt: 2,5 ul 10x PCR-Puffer 0,5 ul 10 mM dNTPs 1 ul 10 uM Vorwärtsprimer 1 ul 10 uM Rückwärtsprimer 0,125 ul Qiagen Hotstart Taq Plus- füllen bis zu 23 ul mit H 2 O </li><li> In 2 pl Bisulfit-behandelter DNA, um eine Reaktion. </li><li> Amplify unter folgenden Bedingungen: 1 Zyklus 6 min 95 ° C 45-50 Zyklen von 1 min 95 ° C, 1 min bei optimale Glühtemperatur, 1 min 72 ° C 1 Zyklus 5 min 72 ° C </li></ol> Analysieren 7 ul PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese der Größe des Amplikons zu überprüfen und zu reinigen verbleibenden PCR-Reaktion für die anschließende Ligation unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen PCR Clean-up Kit (z. B. Macherey-NaGel NucleoSpin Extract). Bei zusätzlichen unerwünschten PCR-Produkte erhalten werden, wird Gelreinigung empfohlen. 6. Bisulfit-Sequenzierung Hochauflösende DNA-Methylierungs-Profile von einzelnen Klon Lesungen ableiten lassen erkennen, kleine Veränderungen in der DNA-Methylierung und identifizieren regulatorischen Regionen, die auf eine Behandlung (Umwelt-Programmierung) sind. Die Bisulfit-Sequenzierung Verfahren umfasst drei aufeinander folgenden Arbeitsschritten. Erstens, werden PCR-Produkte durch PCR erhalten vor Bisulfit in einen Vektor ligiert und in Bakterien. Zweitens wird von Kolonie-PCR einzelne Klone eingesetzt, um die korrekte Größe des Einsatzes zu bestimmen. Drittens sind positive Kolonie PCRs aufgeräumt und unterzogen Big-Dye-Sequenzierung-Reaktion. Nach einer Reinigung Schritt werden die Produkte auf einem kapillaren Elektrophorese Sequenzer. 6,1 Ligation und Transformation Hinweis: Wir verwenden routinemäßig den pGEM-T Vektor clenantrieb Kits (Promega). Unserer Erfahrung nach hängt die Klonierungseffizienz kritisch an dem Einsatz zu ligiert werden. Verschiedene Vektoren sollte getestet bei einer geringen Zahl von rekombinanten Klonen wiederholt erhalten werden. <ol><li> Richten Sie Ligationsreaktion: 5 ul 2x Ligationspuffer 1 ul pGEM-T Vektor 1 ul T4-Ligase 3 ul-up gereinigt PCR-Produkt </li><li> Mischen Reaktion durch Pipettieren und Inkubation über Nacht bei 4 ° C Hinweis: Ligation kann auch für 1 h bei RT durchgeführt werden sowie. Um die Anzahl der rekombinanten Klone zu erhöhen, über Nacht Ligation bei 4 ° C ist bevorzugt. </li><li> Clean-up von Ligationsprodukte durch Ethanolfällung: <ol class="lalpha"><li> Fügen Sie 1 ul Glycogen, 1 ul 3 M NaAc und 25 ul 100% EtOH auf die Ligationsreaktion und Niederschlag für 1 min in flüssigem Stickstoff. </li><li> Zentrifuge (15,0000 g für 30 min bei 4 ° C) und Überstand verwerfen. </li><li> Waschen mit 300 ul70% EtOH und dann zentrifugiert (15.000 g für 20 min bei 4 ° C), Überstand verwerfen und Pellet trocken bei RT (10 min). </li><li> Pellet in 10 ul H 2 O. </li></ol></li></ol> 6,2 Transformation von Ligationsprodukte in elektrokompetente Bakterien <ol><li> Vorkühlen Elektroporationsküvetten (1 mm breit) auf Eis und Tauwetter Aliquot elektrokompetente DH5a Bakterien auf Eis. </li><li> In 45 ul DH5a Bakterien zu 10 pl bis Ligationsprodukt gereinigt (siehe oben) und Transfer zum Küvette. </li><li> Verwandeln Bakterien bei 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF und fügen Sie 1 ml vorgewärmten SOB-Medium direkt nach dem Puls-Lieferung. </li><li> Recover Bakterien für 1 h bei 37 ° C, verteilt 100 ul Suspension auf LB / Ampicillin-Platten mit IPTG / X-Gal beschichtet. </li><li> Platten über Nacht bei 37 ° C </li></ol> 6,3 Kolonie-PCR Hinweis: Kolonie-PCR aus einzelnen Klonen wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Einsätze sindder vorhergesagten Größe. Verzögerte Entwicklung von der Farbe blau / weiß-Screening, unerwünschte Rekombinationsereignisse während der Ligation, Einbau von oligomeren Primerpaare oder verkürzte PCR-Produkte kann sonst zu fehlerhaften Ergebnissen führen Sequenzierung. Wir verwenden routinemäßig T7-und SP6-Primer an klonierten Inserts zu verstärken; führt dieser Ansatz zusätzliche Vektorsequenzen von ca. 150 bp. T7-Primer wird in der Sequenzierreaktion in einem späteren Schritt verwendet. <ol><li> Einrichten Kolonie-PCR-Reaktion in 96-Well-Platte. Für eine Reaktion zu verwenden: 3 ul 2,5 mM MgCl 2 2,5 ul 10x Taq-Puffer 1,5 ul 10 mM dNTP 2 ul 2,5 mM Primer T7 2 ul 2,5 mM SP6-Primer 1 ul Fermentas Taq-Polymerase füllen bis zu 25 ul mit H 2 O </li><li> Je 25 ul / Vertiefung Master-Mix in jedes Well einer 96-Well-Platte. </li><li> Pick-positiven (weiß) von Klon Platte mit Pipettenspitze und tauchen Sie ein in PCR-Reaktion. </li><li> Amplify mit folfolgenden Bedingungen: 1 Zyklus 4 min bei 95 ° C 10 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 56 ° C und 30 s bei 72 ° C 30 Zyklen von 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 48 ° C und 30 s bei 72 ° C 1 Zyklus von 5 min bei 72 ° C </li><li> Laden 5 ul Kolonie-PCR auf einem Agarosegel und bestimmen Reaktionen, die das Recht Insert-Größe enthalten. </li><li> Kolonie PCRs mit den gewünschten Amplikons bis Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Macherey Nagel Nucleofast) gereinigt. </li></ol> 6,4 Big-Dye Terminator Reaktion und Sequenzierung <ol><li> Und Master-Mix für Big-Dye-Reaktion. Für eine Reaktion zu verwenden: 1 ul H 2 O 0,5 ul Big-Dye-Reagenz 1,5 ul Sequenzierungspuffer </li><li> Dispense 3 ul / Vertiefung in jedes Well einer 96-Well-Platte, in jede Vertiefung hinzufügen 2 ul aufgeräumt Kolonie-PCR-Produkt und führen Reaktion auf einem Thermocycler mit folgenden Parametern: 35 Zyklen von 10 s bei 96 ° C, 5 s bei 50 ° C und 4 Minuten bei 60 ° C </li><li> Der Big-Dye Reaktion wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Millipore Montage 96 Sequenzierung Clean-Up Kit) gereinigt und verarbeitet auf einem Kapillar-Sequenzer (zB ABI 3100 DNA). </li><li> Die Sequenzen werden mit Hilfe der Biq Analyzer ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) oder das Online-Tool BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) zur Ableitung der Methylierungsmuster der DNA-Region untersucht (Abbildung 4). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Um einen Einblick in den Einfluss von ELS auf der AVP Expression und Methylierung Status zu erhalten, wurden C57BL/6N Mäuse nach der oben beschriebenen Workflow verarbeitet. Kurz gesagt, war eine Gruppe von Mäusen C57BL/6N subjected zu ELS während die Kontrollgruppe wurde in Ruhe gelassen. Die PVN und der Nucleus supraopticus (SON) gestanzt und DNA und RNA isoliert wurden gleichzeitig aus den einzelnen Schläge. RNA wurde revers transkribiert und die Ebenen von AVP-Transkripte wurden durch qPCR Analyse und normiert auf die Expression von HPRT und GAPDH Housekeeping-Gene gemessen. DNA wurde Bisulfit behandelt, amplifiziert mit Primern, die spezifisch den AVP-Enhancer (4a) und der PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Mindestens 20 rekombinante Klone von jeder Maus / PCR wurden analysiert, um die Frequenzen für die Methylierung CpGs in der PCR-Amplikons (4b) enthalten bestimmen. Im Vergleich zu Kontrollen, ELS einen signifikanten Hypomethylierung bei CpG10, CpG12, CpG13 und Cpg14 der AVP-Enhancer (p &lt;0,05, n = 6-8 Tiere) induziert darauf hindeutet, epigenetische Markierung dieser regulatorischen Region durch frühe Lebenserfahrungen. Im Gegensatz zu der PVN, Methylierungder AVP-Enhancer war unbeeinflusst von ELS im Sohn illustriert Gewebsspezifität epigenetische Markierung (Abbildung 4c). Die Analyse des DNA-Methylierungs-Status bei CpG10 und AVP-Genexpression in Kontrolltieren (n = 6) zeigte eine negative Korrelation, die auf eine Rolle der DNA-Methylierung in der Feinabstimmung der AVP-Genexpression (Abbildung 4d). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Abbildung 1. Micropunches werden aus sezierten Gehirne von Steuer-und im frühen betonte Mäusen erhalten. Nach DNA und RNA-Isolierung wird die Genexpression mittels qRT-PCR bestimmt, während Bisulfit behandelten DNA amplifiziert und gereinigt Produkte werden in einen geeigneten Vektor zur Identifizierung von rekombinanten Klonen von blau / Weiß-Selektion kloniert. Richtiger Einsatz Größen werden von geprüftenKolonie-PCR vor der Durchführung von Big-Dye Reaktions-und Bearbeitungszeiten auf einem Kapillar-Sequenzer. Methylierungsmuster werden visualisiert durch entsprechende Software-Tools. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Abbildung 2. Timeline von DNA / RNA-Extraktion zur Bisulfit-Sequenzierung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Abbildung 3. Workflow für die gleichzeitige Extraktion von DNA und RNA. Der Stempel des hypothalamischen Nucleus paraventricularis, einem winzigen Avp exprimierenden Hirnregion, wird in 400 ul GTA Puffer gelegt, gevortext, bis gestört und weiter homogenisiert, indem sie durch eine Spritze (29G). Das Homogenat wird dann für die Aufreinigung von RNA und DNA gespalten. Die Spaltung kann 1:1 sein oder aus unterschiedlichen Anteilen jevon der jeweiligen experimentellen Frage. Homogenate sollten innerhalb weniger Stunden verarbeitet werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Abbildung 4. CpG-Methylierung bei der AVP-Locus in 6 Wochen alt-Steuerung und ELS Tiere. (A) Schema der AVP und Oxytocin Gene orientiert Schwanz-Schwanz und getrennt von der Zwischengenregion (IGR). Exons sind durch offene (nummeriert) Boxen dargestellt. Die Verteilung von CpG-Reste angegeben wird und eine Größe und Position des jeweiligen PCR-Fragments mit CpG 10 bis CpG14 durch eine fette Linie markiert. (B) Methylierung der AVP-Enhancer im PVN in Steuer-und ELS Tiere (n = 6-8). (C) Methylierung der AVP-Enhancer an den Sohn in Steuer-und ELS Tiere (n = 8-10). (D) AVP-Genexpression wurde korreliertmit Methylierung an CpG10 (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Epigenetischen Programmierung wird zunehmend als wichtiger Mechanismus zugrunde liegen, Gesundheit und Krankheit anerkannt. Hier präsentieren wir eine verfeinerte Methode zur simultanen Isolierung von DNA und RNA aus micropunches und die nachfolgenden Schritte, um DNA-Methylierungs-Profile durch Bisulfit-Sequenzierung zu erhalten. Der optimierte Workflow ermöglicht eine bequeme Analyse der epigenetischen Programmierung im Gehirn als Reaktion auf Reize aus der Umwelt. Darüber hinaus ermöglicht dieser Ansatz für die Untersuchung von den funktionalen Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression sowohl aus derselben Probe analysiert. Schließlich kann der Tiernummer für das Experiment benötigten signifikant reduziert werden. Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien zu befolgen, während Sie die Workflow vorgestellt werden. Angesichts der außerordentlichen Komplexität und Heterogenität des Gehirns und da-Methylierung und Expression kann in einem Zell-und Gewebe-spezifische Weise zu variieren ist es von größterwichtig, dass micropunching in einer standardisierten Art und Weise durchgeführt. Als Beispiel hierfür wird epigenetische Programmierung von AVP in der paravaventriuclar nachgewiesen, aber nicht im Nucleus supraopticus (4b-d), Expression zweier Avp Regionen des Hypothalamus 4. In dieser Hinsicht ist die Verfügbarkeit von DNA und RNA aus der gleichen Gewebestanze vorteilhaft, da RNA Expression bestimmter Gewebe-spezifischen Markergene kann in einigen Fällen verwendet werden, zu bestätigen, dass der richtige Bereich gestanzt wurde. Obwohl micropunching zellulären Heterogenität reduzieren kann, ist zu bedenken, dass dieser Ansatz nicht auf die Isolierung einzelner Zelltypen oder Populationen führen kann. Zusätzliche Reinigung Schritte könnten erwogen werden, um dieses Thema anzugehen. Für eine optimale Bisulfit-Sequenzierung Primer-Design für die PCR-Amplifikation folgenden Bisulfit-Behandlung ist unerlässlich. PCR-Produkte von mehr als 400 bp Länge kann problematisch sein, infolge des Abbaus von DNA durch bisulfite Behandlung. Es sollte auch beachtet werden, dass nested PCR kann verzerrten Ergebnissen führen, wenn nur noch wenige intakte Vorlagen zur Verstärkung beitragen. Primerpaare, die spezifisch für das modifizierte Amplikon sind gestaltet werden sollte, ihre Sequenzen sollten keine CpG-Dinukleotide, um Methylierung vorgespannte Verstärkung zu vermeiden. Darüber hinaus sollte Primer enthalten nicht-CpG Cytosine um die Amplifikation von nicht modifizierten oder nicht vollständig umgesetzte DNA zu verhindern. Verstärkung von einigen Vorlagen kann von der Durchführung von Hot-Start PCR profitieren. In jedem Fall sollte die Eignung von Primerpaaren in Pilot-Experimente verifiziert werden, so Verderb von wertvollen experimentellen Proben zu verhindern. Bisulfit-Sequenzierung stellt eine Standardmethode für die ortsspezifische Methylierungsanalyse, wie es in der Lage, zuverlässig und präzise erkennen die Methylierung von CpG einzigen Rückstände in einer Allel-spezifischen Art und Weise 8 ist. Direkte Sequenzierung des PCR-Produkt wird nicht als gemischte Methylierung o empfohlenfa CpG Rest wird als C / T Doppel-Peak im Elektropherogramm, die Quantifizierung der Methylierung am betreffenden Standort kann verhindern, erscheinen. Aus diesem Grund eine Zwischenschicht Klonierung durchgeführt wird, und mehrere Klone sequenziert (~ 20-30), um das Ausmaß der Methylierung zu bestimmen. Pyrosequenzierung stellt eine alternative Methode zur Quantifizierung von DNA-Methylierung. Außerdem verwendet Bisulfitumwandlung und Bisulfit PCR sondern der Klonierung und Sequenzierung das Amplifikat, um eine direkte Reaktion, bei der Pyrosequenzierung der Methylierungsstatus einer CpG-Rest als C / T Einzel-Nukleotid-Polymorphismus, der leicht quantifiziert werden kann gelesen werden, unterzogen wird. Beide Methoden ermitteln ähnliches Ausmaß an Methylierung 9, aber da das Klonen-Schritt kann übersprungen werden Pyrosequenzierung ist zeiteffizienter. In Abhängigkeit von der Vorlage nur 40 bis 100 Nukleotide auf einmal sequenziert werden, so dass mehrere Runden der Pyrosequenzierung mit unterschiedlichen Sequenzierprimer erforderlich sind. Dies ist eine kritische Begrenzung, da that höhere Mengen an DNA (ca. 1 pg pro Reaktion) benötigt, was absehbar über die Beträge zur Verfügung, von winzigen Hirngewebe Schläge. So anfängliche Abtasten der Regionen im Bereich von mehreren Kilobasen von Pyrosequenzierung scheint weniger geeignet als einzigen Klon Lesen. Dennoch sollte nach der Identifizierung von einem kleinen Bereich von Interesse Pyrosequenzierung betrachtet werden. Insgesamt bietet der oben beschriebenen Protokoll eine genaue, effiziente und optimierte Ansatz für die schnelle und kostengünstige Analyse von Gehirn micropunches für epigenetische Veränderungen. Mehrere Proben können in einem einzigen Durchlauf verarbeitet werden und die Verfahren sind geeignet, wenn der Analyse von Proben von mittlerer Größe Experimenten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.955,50 </td></tr><tr><td> EpiTect Bisulfite Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> NucleoSpin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743.100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sequencing Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> HotStar Taq-Polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq-Polymerase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

optimierte analyse von dna-methylierung und genexpression von klein, anatomisch-definierte bereiche des gehirns

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Die Exposition gegenüber Diät, können Medikamente und frühes Leben Widrigkeiten während der sensiblen Fenstern des Lebens 1,2 zu nachhaltigen Veränderungen in der Genexpression, die zur Darstellung von physiologischen und Verhaltens-Phänotypen beitragen führen. Solche Umwelt-Programmierung geeignet ist, die Anfälligkeit für Stoffwechsel-, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychische 3,4 zu erhöhen. DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen sind wichtige Prozesse in der Vermittlung der Gen-Umwelt-Dialog berücksichtigt und erscheinen auch auf Umwelt-Programmierung zu unterlegen 5. Bei Säugetieren, DNA-Methylierung in der Regel umfasst die kovalente Addition einer Methylgruppe an der 5-Position von Cytosin im Kontext der CpG Dinukleotide. CpG methyliert in einem hoch-Gewebe und Zell-spezifischen Weise so dass es eine Herausforderung, um diskrete, kleine Regionen des Gehirns, wo zellulären Heterogenität ist hoch und Gewebe Menge beschränkt zu studieren. Darüber hinaus beil Genexpression und Methylierung eng miteinander verknüpft Ereignisse, können erhöhte Wert durch den Vergleich beider Parameter in der gleichen Probe gewonnen werden. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll (Abbildung 1) für die Untersuchung der epigenetischen Programmierung im Gehirn präsentiert mit der &quot;mütterlichen Trennung &#39;Paradigma der frühen Leben Widrigkeiten zu illustrativen Zwecken. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von micropunches von differentiell Alters Mäusehirnen, aus denen DNA und RNA gleichzeitig isoliert werden können, so dass DNA-Methylierung und Genexpressionsanalysen in der gleichen Probe.

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Die Exposition gegenüber Ernährung, Medikamenten und belastenden frühen Lebensereignissen während sensiblen Lebensphasen 1,2 kann zu dauerhaften Veränderungen der Genexpression führen, die zu ... beitragen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA-Methylierungs- und Genexpressionsveränderungen infolge von Stress in der frühen Lebensphase zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem neugeborene Mäusewelpen zunächst einer mütterlichen Trennung unterzogen werden, um Stress in der frühen Lebensphase auszulösen; im zweiten Schritt werden die interessierenden Gehirnareale – hier der PVN – durch eine in-situ-Mikrodissektion gewonnen, und DNA sowie RNA werden gleichzeitig aus einer einzelnen Gewebeprobe isoliert. Anschließend wird die gewonnene DNA durch Sulfite behandelt, und der gewünschte Bereich wird mittels Bisulfat-PCR amplifiziert. Dieser wird dann in einen Vektor eingefügt und in Bakterien transformiert. Erfolgreiche Transformationen werden anhand der Markerausprägung und der Größe des PCR-Fragments identifiziert.Und schließlich wird die Bisulfitsequenzierung zur Beurteilung des Methylierungsstatus verwendet. Der Hauptvorteil dieses Arbeitsablaufs besteht darin, dass er eine komfortable Analyse der epigenetischen Programmierung als Reaktion auf Umweltreize ermöglicht. Diese Methode kann Einblicke in die epigenetische Programmierung durch Belastungen im frühen Leben liefern.Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen DNA-Methylierung und Genexpression in einem stark gewebespezifischen Umfeld analysiert werden, und überall dort, wo die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist, um Frühstress zu induzieren. Die mütterliche Trennung wird an Welpen von zeitlich befruchteten C57BL/6N-Dams durchgeführt, um die mütterliche Trennung zu bewirken.Überführen Sie jeden Wurf täglich von den postnatalen Tag eins bis zehn für drei Stunden in einen beheizten, sauberen Käfig; lassen Sie unbehandelte Kontrollwelpen ungestört. Abgesehen von der dreistündigen Trennung bleiben alle Würfe bis zum Entwöhnen am postnatalen Tag 21 bei ihren Müttern. Anschließend werden die Welpen in geschlechtshomogenen Gruppen mit drei bis fünf Mäusen pro Käfig unter Standardhaltungsbedingungen untergebracht. Um die Gewinnung von Hirngewebe einzuleiten, werden die Maushirne aus den Schädeln entfernt, sofort in Isopropanol auf Trockeneis schockgefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert.Wenn die Gewebeproben entnommen werden sollen, entfernen Sie die Gehirne aus dem Minus-80-Grad-Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis. Beginnen Sie damit, die Gehirne in 10 µm dicke koronale Schnitte von rostral nach kaudal im Kryostaten zu schneiden. Bringen Sie die Schnitte auf Superfrost-Glaskäfern auf und trocknen Sie sie für die Kristallviolett-Färbung.Weitere Schnitte können angefertigt und bei minus 20 Grad zur späteren Analyse gelagert werden, beispielsweise für die in-situ-Hybridisierung. Wenn die Entnahme der Gewebeproben erfolgen soll, färben Sie die Schnitte mit Cresylviolett, um die interessierenden Hirnstrukturen zu identifizieren. Anschließend entnehmen Sie mit einer Stanznadel 0,8 Millimeter große Proben der gewünschten Regionen mittels in-loco-Mikrodissektion.Die Gewebeproben sollten bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Mikroschneiden standardisiert durchgeführt wird, da die Genexpression und Methylierung stark gewebespezifisch sind. Homogenisieren Sie die Proben in 400 µL Guanidiniumthiocyanat-Puffer unter Verwendung einer Pipette und wirbeln Sie anschließend bei Raumtemperatur. Als Nächstes das resultierende Lysat mehrmals durch eine 29-Gauge-Spritze geben, bis der Punch nicht mehr sichtbar ist. Das Lysat in gleiche Teile aufteilen.Eins zur Verarbeitung von RNA, was zuerst erfolgen sollte, und ein anderes zur Verarbeitung von DNA, das bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann, bis die RNA für die RNA-Reinigung mit einem Zehntelvolumen Natriumacetat, einem Volumen Aqua-Phenol und einem halben Volumen 24:1-Chloroform zu Isoamylalkohol (AML) verwirbelt wird. Die Mischung nach jeder Zugabe kräftig verwirbeln und die endgültige Mischung 10 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend die Mischung zentrifugieren.Sammeln Sie die wässrige Phase und geben Sie ein gleiches Volumen von 70 % Ethanol hinzu. Unter Verwendung eines RNA-Spin-Säulen-Kits führen Sie eine on-column-DNA-Digestion durch und waschen, um die RNA in 25 Mikrolitern Wasser zu eluieren.Reinigen Sie nun die DNA mithilfe eines Kit-Protokolls, das modifiziert wurde, um eine RNase-Digestion einzuschließen, und erwärmen Sie den Elutionspuffer und die Elutionssäule vor der Verwendung auf 70 Grad Celsius. 10 Minuten bei 70 Grad Celsius sind für die Säulen ausreichend. Bestimmen Sie abschließend die DNA- und RNA-Konzentrationen mittels eines Spektrophotometers.Eine typische PVN-Punch liefert etwa 600 Nanogramm DNA und etwa 400 Nanogramm RNA, wobei etwa 100 Nanogramm RNA für die Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR vor der Amplifikation durch Sulfid beiseitegestellt werden. Behandeln Sie 200 Nanogramm der isolierten DNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, um DNA aus den methylierten Regionen zu amplifizieren. Bestellen Sie Primer, die speziell für bisulfitkonvertierte DNA entworfen wurden. Eine optimale Primer-Design bei der Bis-PCR ist entscheidend, da Qualität und Spezifität des PCR-Amplicons den Erfolg der nachfolgenden Schritte bestimmen.Wenn die Primer eintreffen, bestimmen Sie deren optimale und annealing-Temperatur anhand von Vorversuchen. Verwenden Sie zwei Mikroliter bisulfitbehandelter DNA als Vorlage für jedes 25-Mikroliter-PCR-Gemisch.Amplifizieren Sie die Mischung, beginnend mit einer sechsminütigen Denaturierung bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 45 bis 50 Amplifikationszyklen, bevor eine abschließende fünfminütige Verlängerung bei 72 Grad Celsius erfolgt. Analysieren Sie sieben Mikroliter des PCR-Produkts mittels Agarose-Gelelektrophorese, um die Größe des Amplikons zu überprüfen. Reinigen Sie das verbleibende PCR-Produkt für die anschließende Ligierung mit einem im Handel erhältlichen PCR-Reinigungskit. Wenn unerwünschte PCR-Produkte erhalten werden, verwenden Sie die Gelelektrophorese, um das Produkt von Interesse für dieses Protokoll zu isolieren. Ein kommerzielles Klonierungs-Kit wird verwendet. Die Klonierungseffizienz hängt entscheidend vom Insert ab.Wenn also wiederholt nur geringe Zahlen rekombinanter Klone erhalten werden, versuchen Sie einen anderen Klonierungsvektor. Richten Sie eine 10 µL Ligationsreaktion mit einem µL Vektor und drei µL aufgereinigtem PCR-Produkt ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius am nächsten Tag.Reinigen Sie die Ligationsreaktion durch klassische Ethanolfällung und transformieren Sie die Bakterien mit dem Produkt. Geben Sie direkt nach der Pulsübertragung ein Milliliter vorgewärmtes SOB-Medium hinzu und überführen Sie die transformierten Bakterien in ein Reaktionsröhrchen. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius tragen Sie jeweils 100 Mikroliter jeder Suspension auf eine mit IPTG beschichtete LB-Ampicillin-Platte auf.Xal die Platten über Nacht inkubieren, sobald Kolonien abgestochen werden können. Bereiten Sie 25-Mikroliter-Kolonie-PCR-Reaktionen in einer 96-Well-Platte vor, wobei drei Mikroliter einer 2,5-Millimolar-Magnesiumchloridlösung pro Reaktion verwendet werden. Wählen Sie positive weiße Klone mit einer Pipettenspitze aus und übertragen Sie sie durch einfaches Eintauchen in eine PCR-Mischung.Beginnen Sie die PCR mit einem vierminütigen Schmelzzyklus. Darauf folgen 10 Amplifikationszyklen mit einer Annealing-Temperatur von 56 Grad Celsius. Jeder Schritt dieser Zyklen dauert 30 Sekunden.Danach senken Sie die Annealing-Temperatur auf 48 Grad Celsius für weitere 30 Amplifikationszyklen. Schließen Sie mit einem fünfminütigen Verlängerungszyklus ab. Geben Sie nun je fünf Mikroliter jedes Produkts auf ein Agarosegel und identifizieren Sie die Reaktionen, die das Insert der richtigen Größe enthalten.Verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Kit, um die gewünschten PCR-Produkte aufzubereiten, damit diese mittels Big-Dye-Terminator-Cycling-Sequenzierung sequenziert werden können. Geben Sie in eine 96-Well-Platte in die Vertiefungen jeweils drei Mikroliter Big-Dye-Reaktions-Mastermix, gefolgt von zwei Mikrolitern aufgereinigtem Kolonie-PCR-Produkt. Führen Sie die Reaktion in einem Thermocycler durch, beginnend mit einer Minute bei 96 Grad Celsius, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 10 Sekunden bei 96 Grad Celsius, fünf Sekunden bei 50 Grad Celsius und vier Minuten bei 60 Grad Celsius.Nach Abschluss der großen Die-Reaktion reinigen Sie die Reaktion mithilfe einer großen Die-Reinigungsplatte. Nach Erhalt der Sequenzen analysieren Sie diese mit dem Online-Großanalysator oder dem B-I-S-M-A-Tool, um das Methylierungsmuster des untersuchten DNA-Abschnitts abzuleiten und Erkenntnisse über den Einfluss von Stress in der frühen Lebensphase oder ELS auf die VP-Expression und den Methylierungsstatus zu gewinnen. C57 Black Sticks und Mäuse wurden gemäß dem beschriebenen Protokoll verarbeitet; der paraventrikuläre Kern und der supraventrikuläre Kern wurden ausgestanzt, um DNA zu isolieren, die R-N-A-D-N-A wurde bisulfitbehandelt, mit Primern, die spezifisch für den aVP-Enhancer sind, amplifiziert, und die PCR-Produkte wurden kloniert und aus mindestens 20 rekombinanten Klonen pro Maus sequenziert.PCR wurden analysiert, um die Methylierungshäufigkeiten der in dem PCR-Amplicon enthaltenen CPGs in Gewebe aus der P-V-N-E-L-S zu bestimmen, die eine signifikante Hypomethylierung an vier Stellen im A-VP-Enhancer zeigte, was auf eine epigenetische Markierung dieses regulatorischen Bereichs durch frühe Lebenserfahrungen hindeutet. Im Gegensatz zur PVN blieb die Methylierung des A-VP-Enhancers im SON durch ELS unbeeinflusst, was die Gewebespezifität des epigenetischen Effekts bei Kontrolltieren verdeutlicht. Der DNA-Methylierungsstatus an CPG 10 korrelierte negativ mit der VP-Genexpression, was auf eine Rolle der DNA-Methylierung bei der Feinabstimmung der VP-Genexpression hinweist. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie UPCR problemlos an der isolierten RNA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise Veränderungen der Genexpression im analysierten Gewebe.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA-Methylierungsänderungen als Reaktion auf umweltbedingte oder erfahrungsabhängige Reize untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

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räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Lernen Sie eine optimierte Methode zur Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression in kleinen, anatomisch definierten Gehirnbereichen von Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung epigenetischer Veränderungen durch frühen Stress.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

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