Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Untersuchung der DNA. Methylierung und Genexpression verändern sich bei Stress im frühen Leben. Dies wird erreicht, indem neugeborene Mauswelpen zunächst einer mütterlichen Trennung unterzogen werden, um als zweiten Schritt Stress im frühen Leben zu induzieren. Hier interessierende Hirnareale, die PVN, werden durch In-Loco-Mikrodissektion gewonnen und DNA und RNA gleichzeitig aus einem einzigen Gewebestempel isoliert.

Als nächstes wird die erhaltene DNA durch Sulfit behandelt, und die Region of Interest wird durch Bi-Sulfit-PCR amplifiziert. Dieser wird dann zu einem Vektor ligiert und in Bakterien umgewandelt. Erfolgreiche Transformationen werden durch die Markerexpression und die Größe des PCR-Fragments identifiziert.

Und schließlich wird die Bisulfid-Sequenzierung verwendet, um den Methylierungsstatus zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, dass er eine bequeme Analyse der epigenetischen Programmierung als Reaktion auf Umweltreize ermöglicht. Diese Methode kann Aufschluss über die epigenetische Programmierung durch Widrigkeiten im frühen Leben geben.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden. Überall dort, wo Methylierung und Genexpression in hochgradig gewebespezifischen Umgebungen analysiert werden und wo die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist, um Stress im frühen Leben zu induzieren. Die mütterliche Trennung wird bei Welpen von zeitlich trächtigen C 57 schwarzen Sechs-N-Hündinnen durchgeführt, um die mütterliche Trennung zu beeinflussen.

Bringen Sie jeden Wurf vom ersten bis zum zehnten postnatalen Tag täglich drei Stunden lang in einen beheizten, sauberen Käfig und lassen Sie die ungestressten Kontrollwelpen ungestört. Abgesehen von der dreistündigen Trennung werden alle Würfe bis zur Entwöhnung am 21. Tag nach der Geburt bei ihren Müttern belassen. Dann werden die Jungtiere in geschlechtlich angepassten Gruppen untergebracht, drei bis fünf Mäuse pro Käfig unter Standardhaltungsbedingungen, um die Entnahme von Hirngewebe zu initiieren, die Mäusegehirne werden aus den Schädeln entnommen und sofort in Isop-Trockeneis eingefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Wenn Sie bereit sind, die Gewebestempel zu sammeln, nehmen Sie die Gehirne aus dem minus 80 Grad heißen Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis. Beginnen Sie mit der Kryosektion des Gehirns in 10 Mikrometer große koronale Schnitte von rostral bis coddle. Montieren Sie die Abschnitte auf Super Frosts Glasobjektträger und trocknen Sie sie für die violette Färbung des Kamms.

Zusätzliche Objektträger können entnommen und bei minus 20 Grad für weitere Analysen, wie z. B. die In-situ-Zwei-Hybridisierung, gelagert werden. Wenn Sie bereit sind, Schläge zu nehmen, färben Sie die Objektträger mit krestalem Violett, um interessante Gehirnstrukturen zu identifizieren. Nehmen Sie dann mit einer Stanznadel 0,8 Millimeter Stanzen der interessierenden Regionen mit Hilfe der In-Loco-Mikrodissektion.

Die Stempel sollten bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Mikrostanzen auf standardisierte Weise durchgeführt wird, da Genexpression und Methylierung sehr gewebespezifisch sind. Homogenisieren Sie die Stempel mit einer Pipette in 400 Mikrolitern Qadiumthiocyanat-Puffer und wirbeln Sie sie dann bei Raumtemperatur vortexen.

Geben Sie anschließend das resultierende Lysat durch eine 29-Gauge-Spritze. Mehrmals sollte der Stempel nicht mehr sichtbar sein. Teilen Sie das Lysat in gleiche Teile.

Einer zur Verarbeitung von RNA, was zuerst erfolgen sollte, und der andere zur Verarbeitung von DNA, die bei Raumtemperatur gelagert werden kann, bis die RNA für die RNA-Reinigung bei einem 10. Volumen Natriumacetat, einem Volumen Aquaphenol und einem halben Volumen von 24 zu einem Chloroform-Isoamyl-AML-Vortex verarbeitet wird. Die Mischung nach jeder Zugabe kräftig anrichten und das fertige Gebräu 10 Minuten auf Eis inkubieren. Dann zentrifugieren Sie die Mischung.

Sammeln Sie die wässrige Phase und fügen Sie ihr das gleiche Volumen von 70 % Ethanol hinzu. Mit einem RNA-Spin-Säulen-Kit. Führen Sie einen DNA-Verdau auf der Säule durch und waschen Sie die RNA in 25 Mikrolitern Wasser.

Nun wird die DNA mit einem Kit-Protokoll aufgereinigt, das so modifiziert wurde, dass es die Zugabe eines Aufschlusses von RN a einschließt und den elucianischen Puffer und die elucianische Säule vor ihrer Verwendung auf 70 Grad Celsius erwärmt. 10 Minuten bei 70 Grad Celsius reichen für die Säulen aus. Verwenden Sie abschließend ein Spektralphotometer, um die DNA- und RNA-Konzentrationen zu bestimmen.

Ein typischer PVN-Punch liefert etwa 600 Nanogramm DNA und etwa 400 Nanogramm RA, beiseite gelegt, etwa 100 Nanogramm RNA für die Genexpressionsanalyse durch quantitative PCR vor der Amplifikation durch Sulfit. Behandeln Sie 200 Nanogramm der isolierten DNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, um DNA aus den methylierten Regionen zu amplifizieren. Bestellen Sie Primer, die speziell für bi-sulfit-konvertierte DNA entwickelt wurden Ein optimales Primer-Design in der bi-PCR ist von entscheidender Bedeutung, da die Qualität und Spezifität des PCR-Amplikons über den Erfolg der folgenden Schritte entscheidet.

Wenn die Zündhütchen ankommen, bestimmen Sie mit Pilotversuchen ihre optimale und kniende Temperatur. Verwenden Sie zwei Mikroliter mit Bissulfit behandelte DNA als Vorlage für jeweils 25 Mikroliter. PCR-Mischung.

Amplifizieren Sie die Mischung, beginnend mit einer sechsminütigen Denaturierung bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 45 bis 50 Verstärkungszyklen, bevor Sie eine abschließende fünfminütige Verlängerung bei 72 Grad Celsius erreichen. Analysieren Sie sieben Mikroliter des PCR-Produkts durch Agros-Gelelektrophorese, um die Größe des Amplikons zu überprüfen. Reinigen Sie das restliche PCR-Produkt für die anschließende Ligation mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit.

Wenn unerwünschte PCR-Produkte erhalten werden, verwenden Sie eine Gelreinigung, um das Produkt von Interesse für dieses Protokoll zu isolieren. Es wird ein kommerzielles Klonierungskit verwendet. Die Effizienz des Klonens hängt entscheidend vom Insert ab.

Wenn also wiederholt eine geringe Anzahl rekombinanter Klone erhalten wird, versuchen Sie es mit einem anderen Klonierungsvektor. Richten Sie eine 10-Mikroliter-Ligationsreaktion mit einem Mikroliter Vektor und drei Mikrolitern gereinigtem PCR-Produkt ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius.

Reinigen Sie die Ligationsreaktion durch klassische Ethanolfällung und transformieren Sie die Bakterien mit dem Produkt. Geben Sie direkt nach der Impulsabgabe einen Milliliter vorwarmes SOB-Medium hinzu und überführen Sie die transformierten Bakterien in ein Reaktionsröhrchen. Nachdem Sie die Bakterien eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius zurückgewonnen haben, verteilen Sie 100 Mikroliter jeder Suspension auf einer mit IPTG beschichteten LB-Ampicillinplatte.

Xal inkubieren die Platten über Nacht, sobald die Bienenvölker gepflückt werden können. Richten Sie 25-Mikroliter-Kolonie-PCR-Reaktionen in einer 96-Well-Platte ein, wobei in jeder Reaktion drei Mikroliter 2,5 millimolares Magnesiumchlorid verwendet werden. Entnehmen Sie positive weiße Klone mit einer Pipettenspitze und übertragen Sie sie mit einem einfachen Tauchen in einen PCR-Mix.

Beginnen Sie die PCR mit einem vierminütigen Schmelzzyklus. Es folgen 10 Verstärkungszyklen mit einer Temperatur von 56 Grad Celsius. Jeder Schritt dieser Zyklen dauert 30 Sekunden.

Senken Sie dann die Ealing-Temperatur auf 48 Grad Celsius für 30 weitere Verstärkungszyklen. Beenden Sie mit einem fünfminütigen Dehnungszyklus. Laden Sie nun fünf Mikroliter jedes Produkts auf ein aros Gel und identifizieren Sie Reaktionen, die den Einsatz in der richtigen Größe enthalten.

Verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Kit, um die PCR-Produkte von Interesse zu reinigen, so dass sie mit Hilfe der Sequenzierung mit großen Farbstoffterminator-Zyklen sequenziert werden können. In einem 96-Well-Plattenlade-Wells mit drei Mikrolitern großem DI-Reaktions-Mastermix, gefolgt von zwei Mikrolitern gereinigtem Kolonie-PCR-Produkt. Führen Sie die Reaktion auf einem Thermocycler mit einer Minute bei 96 Grad Celsius durch, gefolgt von 35 Zyklen von 10 Sekunden bei 96 Grad Celsius, fünf Sekunden bei 50 Grad Celsius und vier Minuten bei 60 Grad Celsius.

Nachdem die Big-Die-Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie die Reaktion mit einer großen Chip-Reinigungsplatte. Nachdem Sie Sequenzen erhalten haben, analysieren Sie diese mit dem Online-Big-Analyzer oder dem B-I-S-M-A-Tool, um das Methylierungsmuster der untersuchten DNA-Region abzuleiten und einen Einblick in den Einfluss von Stress im frühen Leben (ELS) auf die VP-Expression und den Methylierungsstatus zu erhalten. C 57 Black Sticks und Mäuse wurden gemäß dem beschriebenen Protokoll verarbeitet, der paraventrikuläre Kern und der supraoptische Kern wurden gestanzt, um DNA zu isolieren, und R-N-A-D-N-A wurde bi-sulfitbehandelt, amplifiziert mit Primern, die für den a VP-Enhancer spezifisch sind, amplifiziert und die PCR-Produkte wurden kloniert und mindestens 20 rekombinante Klone von jeder Maus sequenziert.

PCR wurde analysiert, um die Methylierungsfrequenzen für die im PCR-Amplikon enthaltenen CPGs im Gewebe des P-V-N-E-L-S zu bestimmen, das eine signifikante Hypomethylierung an vier Stellen des A VP-Enhancers induzierte, was auf eine epigenetische Markierung dieser regulatorischen Region durch frühe Lebenserfahrungen hindeutet. Im Gegensatz zur PVN-Methylierung des A VP-Enhancers, die im SON nicht von ELS beeinflusst wurde, was die Gewebespezifität des epigenetischen Effekts bei Kontrolltieren verdeutlicht, korrelierte der DNA-Methylierungsstatus bei CPG 10 negativ mit einer VP-Genexpression, was auf eine Rolle der DNA-Methylierung bei der Feinabstimmung einer VP-Genexpression hinweist. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie UPCR problemlos an der isolierten RNA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Genexpressionsänderungen im analysierten Gewebe zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Veränderungen der DNA-Methylierung als Reaktion auf Umwelt- oder erlebte abhängige Reize untersuchen können.