Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA-Methylierungs- und Genexpressionsveränderungen infolge von Stress in der frühen Lebensphase zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem neugeborene Mäusewelpen zunächst einer mütterlichen Trennung unterzogen werden, um Stress in der frühen Lebensphase auszulösen; im zweiten Schritt werden die interessierenden Gehirnareale – hier der PVN – durch eine in-situ-Mikrodissektion gewonnen, und DNA sowie RNA werden gleichzeitig aus einer einzelnen Gewebeprobe isoliert.

Anschließend wird die gewonnene DNA durch Sulfite behandelt, und der gewünschte Bereich wird mittels Bisulfat-PCR amplifiziert. Dieser wird dann in einen Vektor eingefügt und in Bakterien transformiert. Erfolgreiche Transformationen werden anhand der Markerausprägung und der Größe des PCR-Fragments identifiziert.

Und schließlich wird die Bisulfitsequenzierung zur Beurteilung des Methylierungsstatus verwendet. Der Hauptvorteil dieses Arbeitsablaufs besteht darin, dass er eine komfortable Analyse der epigenetischen Programmierung als Reaktion auf Umweltreize ermöglicht. Diese Methode kann Einblicke in die epigenetische Programmierung durch Belastungen im frühen Leben liefern.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, bei denen DNA-Methylierung und Genexpression in einem stark gewebespezifischen Umfeld analysiert werden, und überall dort, wo die Gewebeverfügbarkeit begrenzt ist, um Frühstress zu induzieren. Die mütterliche Trennung wird an Welpen von zeitlich befruchteten C57BL/6N-Dams durchgeführt, um die mütterliche Trennung zu bewirken.

Überführen Sie jeden Wurf täglich von den postnatalen Tag eins bis zehn für drei Stunden in einen beheizten, sauberen Käfig; lassen Sie unbehandelte Kontrollwelpen ungestört. Abgesehen von der dreistündigen Trennung bleiben alle Würfe bis zum Entwöhnen am postnatalen Tag 21 bei ihren Müttern. Anschließend werden die Welpen in geschlechtshomogenen Gruppen mit drei bis fünf Mäusen pro Käfig unter Standardhaltungsbedingungen untergebracht. Um die Gewinnung von Hirngewebe einzuleiten, werden die Maushirne aus den Schädeln entfernt, sofort in Isopropanol auf Trockeneis schockgefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Wenn die Gewebeproben entnommen werden sollen, entfernen Sie die Gehirne aus dem Minus-80-Grad-Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis. Beginnen Sie damit, die Gehirne in 10 µm dicke koronale Schnitte von rostral nach kaudal im Kryostaten zu schneiden. Bringen Sie die Schnitte auf Superfrost-Glaskäfern auf und trocknen Sie sie für die Kristallviolett-Färbung.

Weitere Schnitte können angefertigt und bei minus 20 Grad zur späteren Analyse gelagert werden, beispielsweise für die in-situ-Hybridisierung. Wenn die Entnahme der Gewebeproben erfolgen soll, färben Sie die Schnitte mit Cresylviolett, um die interessierenden Hirnstrukturen zu identifizieren. Anschließend entnehmen Sie mit einer Stanznadel 0,8 Millimeter große Proben der gewünschten Regionen mittels in-loco-Mikrodissektion.

Die Gewebeproben sollten bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Mikroschneiden standardisiert durchgeführt wird, da die Genexpression und Methylierung stark gewebespezifisch sind. Homogenisieren Sie die Proben in 400 µL Guanidiniumthiocyanat-Puffer unter Verwendung einer Pipette und wirbeln Sie anschließend bei Raumtemperatur.

Als Nächstes das resultierende Lysat mehrmals durch eine 29-Gauge-Spritze geben, bis der Punch nicht mehr sichtbar ist. Das Lysat in gleiche Teile aufteilen.

Eins zur Verarbeitung von RNA, was zuerst erfolgen sollte, und ein anderes zur Verarbeitung von DNA, das bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann, bis die RNA für die RNA-Reinigung mit einem Zehntelvolumen Natriumacetat, einem Volumen Aqua-Phenol und einem halben Volumen 24:1-Chloroform zu Isoamylalkohol (AML) verwirbelt wird. Die Mischung nach jeder Zugabe kräftig verwirbeln und die endgültige Mischung 10 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend die Mischung zentrifugieren.

Sammeln Sie die wässrige Phase und geben Sie ein gleiches Volumen von 70 % Ethanol hinzu. Unter Verwendung eines RNA-Spin-Säulen-Kits führen Sie eine on-column-DNA-Digestion durch und waschen, um die RNA in 25 Mikrolitern Wasser zu eluieren.

Reinigen Sie nun die DNA mithilfe eines Kit-Protokolls, das modifiziert wurde, um eine RNase-Digestion einzuschließen, und erwärmen Sie den Elutionspuffer und die Elutionssäule vor der Verwendung auf 70 Grad Celsius. 10 Minuten bei 70 Grad Celsius sind für die Säulen ausreichend. Bestimmen Sie abschließend die DNA- und RNA-Konzentrationen mittels eines Spektrophotometers.

Eine typische PVN-Punch liefert etwa 600 Nanogramm DNA und etwa 400 Nanogramm RNA, wobei etwa 100 Nanogramm RNA für die Genexpressionsanalyse mittels quantitativer PCR vor der Amplifikation durch Sulfid beiseitegestellt werden. Behandeln Sie 200 Nanogramm der isolierten DNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit, um DNA aus den methylierten Regionen zu amplifizieren. Bestellen Sie Primer, die speziell für bisulfitkonvertierte DNA entworfen wurden. Eine optimale Primer-Design bei der Bis-PCR ist entscheidend, da Qualität und Spezifität des PCR-Amplicons den Erfolg der nachfolgenden Schritte bestimmen.

Wenn die Primer eintreffen, bestimmen Sie deren optimale und annealing-Temperatur anhand von Vorversuchen. Verwenden Sie zwei Mikroliter bisulfitbehandelter DNA als Vorlage für jedes 25-Mikroliter-PCR-Gemisch.

Amplifizieren Sie die Mischung, beginnend mit einer sechsminütigen Denaturierung bei 95 Grad Celsius, gefolgt von 45 bis 50 Amplifikationszyklen, bevor eine abschließende fünfminütige Verlängerung bei 72 Grad Celsius erfolgt. Analysieren Sie sieben Mikroliter des PCR-Produkts mittels Agarose-Gelelektrophorese, um die Größe des Amplikons zu überprüfen. Reinigen Sie das verbleibende PCR-Produkt für die anschließende Ligierung mit einem im Handel erhältlichen PCR-Reinigungskit.

Wenn unerwünschte PCR-Produkte erhalten werden, verwenden Sie die Gelelektrophorese, um das Produkt von Interesse für dieses Protokoll zu isolieren. Ein kommerzielles Klonierungs-Kit wird verwendet. Die Klonierungseffizienz hängt entscheidend vom Insert ab.

Wenn also wiederholt nur geringe Zahlen rekombinanter Klone erhalten werden, versuchen Sie einen anderen Klonierungsvektor. Richten Sie eine 10 µL Ligationsreaktion mit einem µL Vektor und drei µL aufgereinigtem PCR-Produkt ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius am nächsten Tag.

Reinigen Sie die Ligationsreaktion durch klassische Ethanolfällung und transformieren Sie die Bakterien mit dem Produkt. Geben Sie direkt nach der Pulsübertragung ein Milliliter vorgewärmtes SOB-Medium hinzu und überführen Sie die transformierten Bakterien in ein Reaktionsröhrchen. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius tragen Sie jeweils 100 Mikroliter jeder Suspension auf eine mit IPTG beschichtete LB-Ampicillin-Platte auf.

Xal die Platten über Nacht inkubieren, sobald Kolonien abgestochen werden können. Bereiten Sie 25-Mikroliter-Kolonie-PCR-Reaktionen in einer 96-Well-Platte vor, wobei drei Mikroliter einer 2,5-Millimolar-Magnesiumchloridlösung pro Reaktion verwendet werden. Wählen Sie positive weiße Klone mit einer Pipettenspitze aus und übertragen Sie sie durch einfaches Eintauchen in eine PCR-Mischung.

Beginnen Sie die PCR mit einem vierminütigen Schmelzzyklus. Darauf folgen 10 Amplifikationszyklen mit einer Annealing-Temperatur von 56 Grad Celsius. Jeder Schritt dieser Zyklen dauert 30 Sekunden.

Danach senken Sie die Annealing-Temperatur auf 48 Grad Celsius für weitere 30 Amplifikationszyklen. Schließen Sie mit einem fünfminütigen Verlängerungszyklus ab. Geben Sie nun je fünf Mikroliter jedes Produkts auf ein Agarosegel und identifizieren Sie die Reaktionen, die das Insert der richtigen Größe enthalten.

Verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Kit, um die gewünschten PCR-Produkte aufzubereiten, damit diese mittels Big-Dye-Terminator-Cycling-Sequenzierung sequenziert werden können. Geben Sie in eine 96-Well-Platte in die Vertiefungen jeweils drei Mikroliter Big-Dye-Reaktions-Mastermix, gefolgt von zwei Mikrolitern aufgereinigtem Kolonie-PCR-Produkt. Führen Sie die Reaktion in einem Thermocycler durch, beginnend mit einer Minute bei 96 Grad Celsius, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 10 Sekunden bei 96 Grad Celsius, fünf Sekunden bei 50 Grad Celsius und vier Minuten bei 60 Grad Celsius.

Nach Abschluss der großen Die-Reaktion reinigen Sie die Reaktion mithilfe einer großen Die-Reinigungsplatte. Nach Erhalt der Sequenzen analysieren Sie diese mit dem Online-Großanalysator oder dem B-I-S-M-A-Tool, um das Methylierungsmuster des untersuchten DNA-Abschnitts abzuleiten und Erkenntnisse über den Einfluss von Stress in der frühen Lebensphase oder ELS auf die VP-Expression und den Methylierungsstatus zu gewinnen. C57 Black Sticks und Mäuse wurden gemäß dem beschriebenen Protokoll verarbeitet; der paraventrikuläre Kern und der supraventrikuläre Kern wurden ausgestanzt, um DNA zu isolieren, die R-N-A-D-N-A wurde bisulfitbehandelt, mit Primern, die spezifisch für den aVP-Enhancer sind, amplifiziert, und die PCR-Produkte wurden kloniert und aus mindestens 20 rekombinanten Klonen pro Maus sequenziert.

PCR wurden analysiert, um die Methylierungshäufigkeiten der in dem PCR-Amplicon enthaltenen CPGs in Gewebe aus der P-V-N-E-L-S zu bestimmen, die eine signifikante Hypomethylierung an vier Stellen im A-VP-Enhancer zeigte, was auf eine epigenetische Markierung dieses regulatorischen Bereichs durch frühe Lebenserfahrungen hindeutet. Im Gegensatz zur PVN blieb die Methylierung des A-VP-Enhancers im SON durch ELS unbeeinflusst, was die Gewebespezifität des epigenetischen Effekts bei Kontrolltieren verdeutlicht. Der DNA-Methylierungsstatus an CPG 10 korrelierte negativ mit der VP-Genexpression, was auf eine Rolle der DNA-Methylierung bei der Feinabstimmung der VP-Genexpression hinweist. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie UPCR problemlos an der isolierten RNA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise Veränderungen der Genexpression im analysierten Gewebe.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA-Methylierungsänderungen als Reaktion auf umweltbedingte oder erfahrungsabhängige Reize untersucht.