Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre KCNJ10 (Kir4.1)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den DNA-Methylierungsstatus von KCNJ 10 in einer angereicherten Population von Astrozyten zu beurteilen und DNA-Methylierungsänderungen des Promotors mit der transkriptionellen optionalen Aktivität zu korrelieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine angereicherte Population kortikaler Astrozyten aus dem gesamten Nagetiergehirn isoliert wird, indem Fakten sortiert werden, dann wird die DNA aus der angereicherten Population von Astrozyten isoliert. Anschließend wird der DNA-Methylierungsstatus von KC J 10 mit Hilfe der methylierungssensitiven hochauflösenden Schmelzanalyse (MS) bestimmt. HRMA.

Schließlich wird der KC J 10-Promotor hypermethyliert und der Luzifer-Assay wird verwendet, um Veränderungen in der DNA-Methylierung des Promotors mit der transkriptionellen Aktivität zu korrelieren. Letztendlich ist MS. HRMA und der Luciferase-Assay werden verwendet, um den DNA-Methylierungsstatus von KCNJ 10 zu messen und Veränderungen in der Methylierung des Promotors und der transkriptionellen Aktivität des Gens zu korrelieren. Als Postdoktorand aus meinem Labor wurden alle Tiere in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt, die vom Animal Care and Use Committee an der University of Alabama in Birmingham genehmigt wurden.

Alle Puffer und Reagenzien wurden gemäß dem Textprotokoll hergestellt. Nach dem Präparieren der Kortexe vom Kopf eines eingeschläferten Tieres wird gemäß dem Textprotokoll ein Loch in die Oberseite eines konischen 50-Milliliter-Röhrchens geschnitten oder gedremelt, damit der Schlauch in das Röhrchen eingeführt werden kann. Geben Sie dann Papinlösung in das Röhrchen.

Legen Sie die präparierten Kortikale in eine 10-Millimeter-Kulturschale mit Dissoziationsmedium, das auf 95 % O2 bis 5 % CO2 ausgeglichen ist, und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sauberen Rasierklinge in ein Quadratmillimeterstück. Mit einer 10-Milliliter-Pipette überträgt der Mann das Gewebe in das 50-Milliliter-Röhrchen, das die Pepan-Lösung enthält. Lassen Sie das Gewebe vor dem Entleeren am Boden der Transferpipette absetzen.

Um die Menge des Dissoziationsmediums zu minimieren, die transportiert wird, ohne die Pepanlösung zu sprudeln, wird während der Inkubation in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 20 Minuten ein konstanter Fluss von 95 % O2 bis 5 % CO2 über den Oberflächengasaustausch angewendet. Nach der Inkubation verwenden Sie eine 10-Milliliter-Transferpipette, um das Gewebe langsam 10 Mal zu zentrifugieren, zentrifugieren Sie die trübe Zellsuspension bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Äquilibrieren Sie die Albumin-Inhibitor-Lösung der DNA über den Oberflächengasaustausch und resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in drei Millilitern der Lösung.

Bereiten Sie dann einen handelsüblichen diskontinuierlichen Dichtegradienten gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Drehen Sie den diskontinuierlichen Dichtegradienten sechs Minuten lang bei 70 g. Isolieren Sie dann die dissoziierten Zellen vom Boden des Röhrchens, indem Sie das Medium mit einer Pipette absaugen.

Verwenden Sie zwei bis drei Milliliter DPBS mit 0,02 % Rinderserumalbumin und einem Milligramm pro Milliliter DNA oder bevorzugtes Medium. Um wiederverwendet zu werden, suspendieren Sie die dissoziierten Zellen. Lassen Sie die Zellen durch einen 40-Mikrogramm-Filter, bevor Sie die Faktensortierung und die DNA- oder RNA-Extraktion gemäß dem Textprotokoll durchführen.

Nach dem Entwerfen von Primern gegen eine Bi-Sulfit-umgewandelte DNA-Sequenz und der Amplifikation der DNA gemäß dem Textprotokoll durch Sulfit werden 500 bis 1000 Nanogramm DNA jeder Probe und methylierte DNA-Standards von null bis 100 % von derselben Tierart unter Verwendung einer bevorzugten DNA-Polymerase und fünf mikromolaren Primern umgewandelt. Richten Sie 20 Mikroliter-Reaktionen für die Ms HRM-Amplifikation ein. Gemäß dieser Tabelle werden alle Proben, einschließlich Fax, DNA und methylierte Standards, in dreifacher Ausfertigung ausgeführt, abhängig von der eingestellten Analysesoftware und den Parametern vor und nach dem Start und Stopp um die Übergänge der Schmelzkurve.

Legen Sie die Parameter "Prem Melt", "Start" und "Prem Melt Stop" fest. Die Differenz zwischen den beiden beträgt also 0,2 bis 0,5 Grad Celsius. Stellen Sie nach dem Schmelzen, Starten und Stoppen auf ähnliche Weise ein und extrahieren Sie die Daten zur Spitzentemperaturdifferenz für jede Probe unter Verwendung von prozentualen methylierten Standards und den entsprechenden Spitzentemperaturdifferenzen.

Generieren Sie eine lineare Regressionsgleichung. Verwenden Sie diese lineare Regressionsgleichung, um den Methylierungsstatus unbekannter Proben nach der Identifizierung von CPG-Inseln von Interesse und der Amplifikation und Klonierung des CPG-Insel-Luke-Zwei-Plasmids gemäß dem Textprotokoll zu schätzen. Verwenden Sie die bevorzugte Cutter-Software, um die Stellen für den Restriktionsverdau zu verifizieren, um Doppelschnitte zu vermeiden und 30 Mikrogramm Plasmid zu linearisieren, sobald die Probe mit den entsprechenden Enzymen aufgeschlossen wurde.

Inaktivierte Enzyme bei der entsprechenden Temperatur und Dauer in 50-Mikroliter-Reaktionen erhitzen. Verwenden Sie fünf Einheiten CPG-Methylat zum Methylieren. 700 Mikrogramm linearisierte Plasmide bei 30 Grad Celsius für 13 bis 19 Stunden.

Nach der Reinigung der DNA, wie im Textprotokoll beschrieben, führen Sie einen HPA-Zwei-Restriktionsverdau an einer Mikrogramm-Probe methylierter DNA durch, indem Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Reinigung der DNA werden die Proben zur Visualisierung 45 Minuten lang auf ein 1%agros, DNA-Gel bei 100 Volt geführt. Als nächstes wurden methylierte und nicht-methylierte Plasmide über Nacht einer doppelten Verdauung mit geeigneten Restriktionsenzymen unterzogen, um die Luke-Vektor- und CPG-Inselfragmente in voller Länge freizusetzen.

Hitze inaktiviert die Enzyme nach der Verdauung. Lassen Sie die doppelt verdauten Proben eine Stunde lang auf einem 1%DNA-Agros-Gel bei 100 Volt laufen, um den Vektor zu trennen und dann unter Schutz vor UV-Licht einzuführen, legen Sie das Gel auf Schwarzlicht und mit sauberen chirurgischen Klingen, entfernen Sie die methylierten und nicht methylierten Einsätze nach der Gelextraktion der DNA gemäß dem Textprotokoll. Verwenden Sie die T-Vier-DNA-Ligase und ein Verhältnis von eins zu vier zwischen Vektor und Insert, um die methylierten und nicht methylierten Inserts in einen unmethylierten Vektor zu verbannen. Nach der Ligatur bei minus 20 Grad Celsius oder über Nacht auf Eis inkubieren.

Reinigen Sie die DNA und überprüfen Sie die Religation, indem Sie Proben auf ein 1%%DNA-Aros-Gel laufen lassen und die Konzentration von religierten Plasmid-CD 54-Zellen auf einer 12-Well-Platte bei 140.000 Zellen pro Well bestimmen. 24 Stunden später. Verwenden Sie ein kommerzielles Transfektionsreagenz, um Zellen mit gleichen Konzentrationen von entweder nicht-methylierten CPG-Schleifen, zwei Plasmiden plus RAN, Vanilla oder einem anderen Kontroll-Ferus-Vektor oder methyliertem c pg, Luke-Zwei-Plasmid plus ELLA oder einem anderen Kontroll-Luzifer-Vektor zu transfizieren. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang transfizieren, bevor Sie einen Luzifer-Assay durchführen.

Verwenden Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers das Luminometer, um jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung abzulesen. Berechnen Sie das Verhältnis der Aktivität von Firefly Luzifers zu Run Vanilla oder einer anderen Kontrolle. Luzifers Aktivität.

Normalisieren Sie die Luciferase-Aktivität der methylierten Glühwürmchen zur Kontrolle der Luziferase-Aktivität durch Division der methylierten Aktivität durch methylierte Luc-Aktivität. Wie hier gezeigt, wurde eine angereicherte Population von Astrozyten durch Faxsortierung von E-G-F-P-S 100 beta-transgenen Tieren gewonnen. Eine Gated Population wurde basierend auf Vorwärts- und Seitwärtsstreuung ins Visier genommen, und eine lebende Zellpopulation wurde unter Verwendung eines Bromid-Indikators für tote Zellen bestimmt, und das hier gezeigte Gating sind repräsentative Bilder von EGFP-positiven Astrozyten nach der Dissoziation, aber sowohl vor der Sortierung als auch nach der Sortierung zeigt diese Abbildung eine isolierte EGFP-positive Zellpopulation, die einen 40-fachen Anstieg der mRNA für den Astrozyten-spezifischen Marker zeigte.

Ein LDH eins L eins. Darüber hinaus wurde trotz der gemeinsamen Expression von S 100 beta und NG zwei positiven OPCs und Astrozyten eine vierfache Reduktion von NG zwei mRNA, A Marker für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen beobachtet, was auf die Isolierung einer angereicherten astrozytären Zellpopulation hinweist. Diese Tabelle listet die Gesamt-RNA und -DNA auf, die aus unterschiedlichem Alter und einer unterschiedlichen Anzahl von Tieren isoliert wurden, und wird als Referenz für die erwartete Ausbeute an molekularen Molekülen nach Fakten aufgeführt.

Schließlich wurde ein dualer Lucifers-Assay verwendet, um die transkriptionelle Aktivität hypermethylierter Regionen des interessierenden Gens zu bewerten, nachdem das methylierte Insert in einen nicht methylierten Vektor verschoben wurde. HPA zwei, das nur nicht-methylierte DNA verdaut, wurde verwendet, um den Methylierungsstatus des Plasmids zu überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine angereicherte Population von Astrozyten anhand von Fakten isoliert und wie man die DNA-Methylierung eines Gens misst und Veränderungen in der DNA-Methylierung des Promotors mit der Transkriptionsaktivität korreliert, indem man die methylierungsempfindliche hochauflösende Schmelzanalyse bzw. den Luciferase-Assay verwendet.