Name: Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre KCNJ10 (Kir4.1) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Lernen Sie die DNA-Methylierungsanalyse des KCNJ10-Gens in Astrozyten mittels MS.HRMA und Luciferase-Assay. Diese Methode ermöglicht die Korrelation epigenetischer Veränderungen mit der Transkriptionsaktivität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt von R01NS075062-01A1. FACS-Sortierung, die in der UAB Comprehensive Flow Cytometry Core Facility (P30 AR048311, P30 A1027767) durchgeführt wird. Dr. Scott Philips von der UAB Neurobiology Core Facility und Dr. Susan Nozell von der UAB CDIB halfen bei den technischen Aspekten des Luciferase-Assays.

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien behandelt. Die Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Alabama in Birmingham genehmigte Tierversuche. 1. Erhalten RNA und DNA aus einer Enriched Astrozytäre Bevölkerung mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) von Astrozyten aus Whole Brain Tissue <ol><li> Sedate Tier mit CO 2 für 1 Minute und dann schnell zu enthaupten. Sezieren Kortex wie in Albuquerque et al,. 26; es ist nicht notwendig, Meningen entfernen. Hinweis:. Transgenen Ratten exprimieren eGFP unter der S100β (eine Astrozyten Marker) Promotors wurden durch Itakura et al 27 erzeugt und für die FACS-Sortierung von Astrozyten verwendet. </li><li> Vorbereitung ganze Gehirnhomogenisat mit einer Papain-Kit Dissoziation unter nicht-sterilen Bedingungen nach dem Protokoll des Herstellers. Wärme aktivieren Papain bei 37 ° C in einem Wasserbad für 10 min. Hinweis:Papain-Lösung wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt und enthält L-Cystein und EDTA (Siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Geschnitten oder Dremel ein Loch in der Spitze einer 50 ml konischen Röhrchen Rohrtrag 95% O 2 zu ermöglichen: 5% CO 2 in einem geschlossenen konischen Röhrchen zugeführt werden (1A). Platzieren seziert cortices in 10 mm Kulturschale enthaltend Dissoziation Medium (MEM mit 20 mM Glucose und Penicillin / Streptomycin (500 U / ml) ergänzt und 95% O äquilibriert 2: 5% CO 2) und mit einem sauberen Rasierklinge Gewebe in 1 Hackfleisch x 1 mm 2 Stück. </li></ol></li><li> Mit 10 ml Hand Pipetman zu 50 ml konische Röhrchen mit Papainlösung Transfergewebe. Erlauben Gewebe zur Unterseite der Transferpipette vor dem Entladen, um die Menge der Dissoziation Medien übertragenen minimieren begleichen. Halten Papainlösung zu 95% O 2 äquilibriert: 5% CO 2 über die Oberfläche der Gasaustausch für die Dauer der Inkubation. Nicht Blase Papain solutiam. Inkubieren Gewebe für 20 Minuten in 37 ° C Wasserbad. </li><li> Nach der Inkubation in Papainlösung, triturate Gewebe 10mal mit 10 ml Transferpipette mit langsamer Geschwindigkeit. Zentrifuge trübe Zellsuspension bei 1.000 g für 5 min bei RT. <ol><li> Äquilibrieren DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung (Herstellerangabe) über Oberflächengasaustausch und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung. Bereiten kommerziellen diskontinuierlichen Dichtegradienten gemäß Herstellerangabe. </li></ol></li><li> Spin diskontinuierlichen Dichtegradienten bei 1.000 × g für 6 min. Isolieren dissoziierten Zellen vom Boden des Röhrchens durch Ansaugen unteren Pellet mit einer Pipette. </li><li> Resuspendieren dissoziierten Zellen in 2-3 ml DPBS mit 0,02% Rinderserumalbumin und 1 mg / ml DNase oder bevorzugte HEPES gepufferte Kulturmedien. Fahren Sie durch 40 &amp; mgr; m-Filter vor der FACS (2A). Halten Sie Zellen auf Eis, bis die Sortierung. <ol><li> Führen FACS 28. &lt;/ li&gt; <li> Pellet-Zellen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Anmerkung: Pelletierte Astrozyten kann sofort verwendet oder in -80 ° C bis die DNA-Extraktion zu halten. </li></ol></li><li> Auszug RNA und DNA mit Hilfe bevorzugte Isolierungsverfahren 29 30. Beurteilen Sie RNA- und DNA-Konzentration und Qualität über Spektralphotometer und Bioanalyzer 31. Hinweis: Nutzen Sie nur qualitativ hochwertige RNA und DNA in den nachfolgenden Schritten, 260/280 = 2,0 bis 2,2 und 1,8 bis 1,9 auf. Bioanalyzer Analyse ist wichtig, für die RNA-Abbau oder DNA-Fragmentierung zu bewerten. RNA oder DNA kann sofort verwendet oder in -80 ° C oder -20 ° C, jeweils für die nachfolgenden Untersuchungen gespeichert werden. </li></ol> 2. Bewertung der DNA-Methylierungsstatus eines Gens mit methylierungssensitiven Hohe Auflösung Schmelzanalyse (MS-HRMA) <ol><li> Geben Sie Gen-Sequenz von Interesse in bevorzugten Online-Methylierungs-Mapping-Software, um alle CpG-Inseln im Gen zu identifizierenInteressen 32. <ol><li> Design-Primer gegen Bisulfit-konvertierter DNA-Sequenz 33 und verstärken mit bevorzugten DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll. Stellen Sie sicher, verstärkte Produktgröße, indem Sie einen 1% -igen DNA-Gel bei 100 V für 45 min. Shop Primer bei Stammkonzentration von 20 um -20 ° C. </li></ol></li><li> Bisulfit konvertieren 500-1000 ng DNA von jeder Probe und methylierten DNA-Standards im Bereich von 0-100% von der gleichen Tierart 34. Eluieren Proben auf eine Konzentration von 20 ng / &amp; mgr; l bereitzustellen. Stellen Sie sicher, Konzentration von Bisulfit-konvertierter DNA mittels Spektralphotometer 31. </li><li> Setup 20 &amp; mgr; l-Reaktionen für MS-HRM-Amplifikation unter Verwendung bevorzugte DNA-Polymerase und Primern bei 5 &amp; mgr; M-Konzentration gemäß Tabelle 1 und 2. Führen Sie alle Proben, einschließlich FACS DNA methylierte und Standards, in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Je nach Analysesoftware, setzen vor und nach dem Start und Stopp-Parameterum die Übergänge der Schmelzkurve. Set vor, eine Schmelz Start und Pre-Schmelzstoppparameter so dass der Unterschied zwischen den beiden ist von 0,2 bis 0,5 ° C. Stellen Sie nach dem Schmelzbeginn und nach der Schmelze zu stoppen ähnlich. Extrahieren Spitzentemperatur Differenzdaten für jede Probe. </li><li> Verwenden Prozent methylierte Standards (y-Wert) und die entsprechenden durchschnittlichen Spitzentemperaturunterschiede (x-Wert) erzeugen einen linearen Regressionsgleichung (3A-B, Tabelle 3-4). Verwenden Sie dieses linearen Regressionsgleichung zur Methylierungsstatus von unbekannten Proben 35 zu schätzen. </li></ol> 3. Bewertung Hyper-methyliert Promotoraktivität durch Verwendung von Luciferase Assay <ol><li> Identifizieren CpG-Inseln des Zielgens (Schritt 2.1). PCR zu amplifizieren interessierenden Bereiche 36 und Klon stromaufwärts des luc2 Firefly Luziferase-Reportergens an CpG-Insel-luc2 Plasmide 37 zu produzieren. </li><li> Linearisieren 30 &amp; mgr; g CpG-Insel-luc2 Plasmid über RestriktionsEnzymverdau 38. Stellen Sie sicher, Standorte für Restriktionsverdau und vermeiden Doppel Schnitte mit bevorzugten Schneidesoftware 38. Wärme inaktivieren Enzyme bei geeigneter Temperatur und Dauer, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalen Verlust an DNA erfolgt während der Linearisierungsschritt. </li><li> Methylat linearisierte Plasmide mit CpG-Methylase (M.Sssl) O / N bei 30 ° C oder lassen Sie unbehandelten folgenden Herstellerprotokoll mit Ausnahme der folgenden Einstellungen. </li><li> Führen Sie 50 ul-Reaktionen. </li><li> Verwenden Sie 5 Einheiten CpG Methylase bis 700 ng linearisierte Plasmid methylieren. </li><li> Führen Reaktionen O / N für 13-19 Std. </li><li> Nach CpG Methylase-Reaktion, führen DNA-Bereinigung mit handelsüblichen Silicagel-Membran reinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Erhebliche Verluste der DNA auftreten folgenden CpG Methylase-Reaktion, 30-60% Verlust. </li><li> Stellen Sie sicher, Methylierung von Plasmiden über einen HpaII Restriktionsverdau. </li&gt; <li> Nehmen 1 ug methylierten oder unmethylierten DNA und Restriktionsverdau mit Hpa II für 1 h bei 37 ° C. Verwenden Sie 5-10 Einheiten HpaII pro ug DNA. Nach HpaII Verdauung, führen DNA-Bereinigung mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Laufen die beiden CpG-methylierter und nicht-methylierter Plasmide auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-DNA oder TBE-Puffer bei 100 V für 45 min zur Visualisierung (4B). </li><li> Gegenstand sowohl methylierten und nicht-methylierten Plasmiden doppelten Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen, um Volllängen-luc 2 (Vektor) und CpG-Insel (insert) -Fragmente 38 freizugeben. Zuführen doppelten Verdau O / N bei geeigneten Temperatur- und Wärme Enzyme zu deaktivieren, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalem Verlust an DNA-Konzentration tritt bei Doppel Restriktionsverdau. </li><li> Laufen Doppel verdauten Plasmide auf 1% DNA Agarosegel bei 100 V für 1 Stunde, um die Trennung zu ermöglichen of Vektor und Insert (4C). Vorsicht. Das Tragen von Schutz UV-Gesichtsschutz, legen DNA-Gel auf einer Tischplatte Schwarzlicht, um Bands zu visualisieren. Basierend auf Größe, Verbrauch methylierter und nicht-methylierter Einsatz und nicht-methylierte Vektor mit einem sauberen Skalpell. </li><li> Gel-Extrakt DNA mit gesättigtem Phenol, pH-Wert 6,6. Kurz gesagt, wiegen DNA Gel-enthaltenden Vektor oder Einsatz. Verwenden Sie 100 ul Phenol pro 0,1 g DNA-Gel. Homogenisieren DNA-Gel in Phenol unter Verwendung von Glas Dounce-Homogenisator. </li><li> In Chloroform (mit 1/5 der Phenolvolumen) und schütteln Proben für 20 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 min. Zentrifuge für 15 min bei Maximalgeschwindigkeit (16,1 x 1.000 x g) bei 4 ° C. </li><li> Entfernen wässrigen Lösung und füge 0,1 X Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 X Volumen Ethanol. Proben Inkubation für 1 h bei -80 ° C. Nach der Inkubation Ethanol entfernen und erneut zu suspendieren DNA in 30 ul bevorzugte Puffer. Signifikanten Verlust der DNA erfolgt nach der Isolierung von Einsätzen und Vektoren, 30-50% loss. </li><li> Wieder Ligat methylierter und nicht-methylierter Einsätze nicht methylierte Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase 38. Verwenden Sie eine 1: 4-Verhältnis von Vektor für Ligationsreaktionen einfügen. Setup-Reaktion nach Herstellerangaben. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 50 &amp; mgr; l für Reaktionen und Inkubation O / N bei -20 ° C oder auf Eis mit Deckel auf Eis Eimer. </li><li> Nach der Ligation durchführen DNA Cleanup mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Signifikanten Verlust der DNA auftreten folgenden Ligationsreaktion, eine ungefähre 30-50% Verlust der DNA. Überprüfen Religation von auf 1% Agarose Gel DNA läuft bei 100 V für 45 min und Beurteilung Konzentration re-ligiert Plasmide (Figur 4D). </li><li> Transfektion von methylierten oder unmethylierten Plasmide in D54-Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagens gemäß dem Protokoll des Herstellers. Samen D54 Zellen auf 12-Well-Platte mit einer 0,14 x 10 6 Zellen / Vertiefung. </li><li> Nach 24 Stunden, Transfektion von Zellen, with gleiche Konzentrationen von entweder (1) Nicht methyated CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor oder (2) methylierte CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor. </li><li> Zulassen-Zellen für 24 Stunden Transfektion vor der Durchführung Dual Luciferase-Assay. Führen Sie Test gemäß Herstellerangaben. Führen Sie Messwerte unter Verwendung eines Luminometers. Lesen Sie jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Berechnen Verhältnis von Firefly Luziferase-Aktivität zu Renilla oder andere Steuer Luciferase-Aktivität. Normalisieren methylierte Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität, um nicht methylierten Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität durch Division methylierte Luciferase-Aktivität von nicht methylierten Luciferaseaktivität </li></ol>

Die Autoren machen keine Angaben.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung einer angereicherten Population von Astrozyten mittels FACS sowie eine Vielzahl von Techniken, die sowohl korrelative als auch ursächliche Studien zwischen DNA-Methylierung und Genexpression ermöglichen. Diese Techniken, die isoliert oder in Kombination eingesetzt werden, sind besonders nützlich für Laboratorien, die mit Geweben mit hoher zellulärer Heterogenität arbeiten oder sich für den DNA-Methylierungsstatus eines bestimmten Gens oder einer bestimmten Genregion im Vergleich...

Epigenetik ist die Lehre von chemischen Modifikationen, die die transkriptionelle Aktivität des Genoms beeinflussen können. Ohne eine Veränderung der DNA-Sequenz reichen epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierung, Histon-Acetylierung und Histon-Methylierung im Wesentlichen aus, um die Muster der Genexpression reversibel zu verändern 1. Die DNA-Methylierung, ein potenter Regulator der Genexpression, ist die am besten charakterisierte epigenetische Modifikation. DNA-Methylierung ist die kovalente Bindung von Methylgruppen an die C5-Position eines Cytosinsins, typischerweise das Cytosin eines Cytosin-Guanin-Dinukleotids, auch bekannt als CpG-Stelle. Gebiete, die eine hohe Dichte an CpG-Standorten aufweisen, werden als CpG-Inseln (CGIs) bezeichnet. CGIs sind häufig mit transkriptionellen Startstellen (TSS) und Genpromotoren 1-3 assoziiert. Während also Veränderungen der DNA-Methylierung an CGIs nicht immer mit Veränderungen der zellulären Expression oder Funktion einhergehen, können Änderungen der DNA-Methylierung an CGIs eine starke Regulation der Transkriptionsaktivität ausüben 2. 
Historisch wurde beobachtet, dass die DNA-Methylierung für die Embryogenese, Prägung und Entwicklung essentiell ist, mit geringen Veränderungen im Ausmaß der DNA-Methylierung, die in postmitotischen Zellen auftreten (mit Ausnahme von Veränderungen in krebsbedingten Genen) 4,5. Das Gebiet der Neuroepigenetik hat jedoch eine wichtige nicht-entwicklungsbezogene Rolle für die DNA-Methylierung hervorgehoben. Insbesondere hat die kognitive Epigenetik die DNA-Methylierung als einen hochplastischen Mechanismus neu definiert, der sowohl die transkriptionelle Aktivierung als auch die Repression von Genen vermittelt, die für den Lern- und Gedächtnisprozess essentiell sind 6. Neben der kognitiven Epigenetik charakterisieren Studien, die ischämische Verletzungen und neuropathische Schmerzen modellieren, die DNA-Methylierung als einen labilen Mechanismus, der schnell auf eine Vielzahl von ZNS-Beleidigungen reagiert 7-9. In Bezug auf Astrozyten deuten mehrere Beweise darauf hin, dass die DNA-Methylierung eine wichtige Rolle bei der Astrogliogenese spielt. Fan et al. fanden heraus, dass die bedingte KO von DNMT1 in neuralen Vorläuferzellen (NPCs) zu einer frühreifen Entwicklung von Astrozyten führte, die mit einem globalen Zustand der Hypomethylierung übereinstimmt 10. Darüber hinaus kamen Perisic et al. zu dem Schluss, dass unterschiedliche Expressionsniveaus des GLT-1-Promotors unterschiedliche Expressionsniveaus des Glutamattransporters im Kortex und Kleinhirn vermitteln, was eine Rolle bei der DNA-Methylierung bei der Etablierung von hirnregionenspezifischen Mustern der astrozytären Genexpression unterstreicht 11. Insgesamt unterstreichen zahlreiche Studien die dynamische und labile Natur der DNA-Methylierung im ZNS, da gezeigt wurde, dass Umwelt, Medikamente und Verletzungen die DNA-Methylierung und oft auch die Genexpression verändern 4,9. Zusammengenommen deuten diese neuroepigenetischen Studien darauf hin, dass die DNA-Methylierung ein praktikables therapeutisches Ziel ist, das das Potenzial hat, eine Vielzahl von ZNS-Pathologien zu lindern.
Während das Gebiet der Epigenetik sein Verständnis der Rolle der DNA-Methylierung bei der Neuroentwicklung und Krankheit erweitert, besteht die Herausforderung bei der Verlagerung der DNA-Methylierung in Richtung eines therapeutischen Ziels nicht nur darin, korrelative, sondern auch ursächliche Studien durchzuführen, die spezifische Genziele und -stellen definieren. Darüber hinaus bleibt die Untersuchung von Veränderungen der DNA-Methylierung, die für die Gehirnregion und den Zelltyp spezifisch sind, eine fortlaufende und zeitlose Herausforderung, die nur auf dem Gebiet der Neuroepigenetik zu finden ist. Dieses Protokoll verwendet eine Vielzahl von Techniken, darunter die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) von Astrozyten, die methylierungsempfindliche hochauflösende Schmelzanalyse (MS-HRM) und einen Methylierungs-Luciferase-Assay, um den DNA-Methylierungsstatus von KCNJ10 zu untersuchen, einem Gen, das für Kir4.1 kodiert. Kir4.1 ist ein glialspezifischer Kaliumkanal, der sowohl hirnregionen- als auch zellspezifische Expressionsmuster im ZNS 12-16 zeigt. Die Kir4.1-Expression nimmt zu, wenn sie sich von rostralen zu kaudalen ZNS-Regionen bewegt, wobei die höchste Expression im Rückenmark auftritt 15. Obwohl der Kanal in Ependymzellen, Oligodendrozyten und deren Vorläuferzellen exprimiert wird, wird Kir4.1 überwiegend in Astrozyten exprimiert und es wird angenommen, dass es für die Aufrechterhaltung des homöostatischen Kaliumspiegels sowie für die Unterstützung der Glutamataufnahme unerlässlich ist, indem das Potential der astrozytären Ruhemembran auf ein hyperpolarisiertes -80mV eingestellt wird 12,16-19. Wichtig ist, dass die Expression von Kir4.1 sowohl während der Entwicklung als auch nach mehreren Formen der ZNS-Verletzung nicht statisch ist 20-25. Wir wollten die epigenetische Regulation dieses Kanals untersuchen, insbesondere in Astrozyten während der Entwicklung. Die verwendeten Techniken bieten genspezifische und gezielte CpG-Standortanalysen, die kausale Beweise für eine Rolle der DNA-Methylierung bei der Regulation der KCNJ10-Genexpression liefern. Diese Techniken können auf andere Gene angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Papain-Dissoziationssystem</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Methyl Primer</td><td>Applied Biosystems</td><td>Online-Software</td><td>zur Lokalisierung von CpG Islands</td></tr><tr><td>EZ DNA-Methylierungskit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Premixed Calibration Standard</td><td>EpiGenDx</td><td>80-8060R-Premix</td><td></td></tr><tr><td>CpG-Methylase (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAschnelle Gel-Extraktion&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>Wird für die Gelextraktion und DNA-Reinigung verwendet</td></tr><tr><td>Restriktionsenzyme</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB-Cutter</td><td>New England BioLabs</td><td>online</td><td>verifizieren Restriktionsverdau-Stellen</td></tr><tr><td>Dual Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2-Vektor, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>Renilla-Vektor, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 Luminometer</td><td>Turner Designs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX und Plus Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>Phenol, gesättigter pH-Wert 6,6/6,9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spektrophtometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>High Resolution Melt (HRM) Software v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS Software v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB High Resolution Melting Erste Schritte&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>online</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT Schnelles Echtzeit-System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

korrelieren von gen-spezifischen dna-methylierungsänderungen mit expression und transkriptionsaktivität astrozytäre<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

Die DNA-Methylierung dient der Regulierung der Genexpression durch die kovalente Bindung einer Methylgruppe an die C5-Position eines Cytosins in einem Cytosin-Guanin-Dinukleotid. Während die DNA-Methylierung zu lang anhaltenden und stabilen Veränderungen der Genexpression führt, können sich auch Muster und Niveaus der DNA-Methylierung aufgrund einer Vielzahl von Signalen und Reizen ändern. Als solche fungiert die DNA-Methylierung als leistungsstarker und dynamischer Regulator der Genexpression. Die Untersuchung der Neuroepigenetik hat eine Vielzahl von physiologischen und pathologischen Zuständen aufgedeckt, die sowohl mit globalen als auch mit genspezifischen Veränderungen der DNA-Methylierung verbunden sind. Insbesondere bestehen auffällige Korrelationen zwischen Veränderungen der Genexpression und der DNA-Methylierung bei neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Erkrankungen, während der synaptischen Plastizität und nach ZNS-Verletzungen. Da die Neuroepigenetik jedoch ihr Verständnis der Rolle der DNA-Methylierung in der ZNS-Physiologie weiter erweitert, ist es wichtig, kausale Zusammenhänge in Bezug auf Veränderungen der Genexpression und der DNA-Methylierung abzugrenzen. Darüber hinaus erfordert das Vorhandensein großer regionen- und zellspezifischer Unterschiede im größeren Bereich der Neurowissenschaften Techniken, die diese Varianzen bei der Untersuchung des Transkriptoms, des Proteoms und des Epigenoms berücksichtigen. Hier beschreiben wir die FACS-Sortierung von kortikalen Astrozyten, die eine anschließende Untersuchung sowohl der RNA-Transkription als auch der DNA-Methylierung ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der DNA-Methylierung, die methylierungsempfindliche hochauflösende Schmelzanalyse (MS-HRMA) sowie einen Luciferase-Promotor-Assay. Durch den Einsatz dieser kombinierten Techniken ist es nicht nur möglich, korrelative Veränderungen zwischen DNA-Methylierung und Genexpression zu untersuchen, sondern auch direkt zu beurteilen, ob Änderungen im DNA-Methylierungsstatus einer bestimmten Genregion ausreichen, um die Transkriptionsaktivität zu beeinflussen.

Eine angereicherte Population von Astrozyten wurde mittels FACS-Sortierung von eGFP-S100β transgenen Tieren 27 erworben. Aufgrund abnehmender Qualität der Zellen und molekularen Moleküle von Tieren, die älter sind als postnatalen Tag 50 (p50) isoliert, alten Tieren p0-p40 sind optimal für solche Experimente. Cortexgewebe wurde für diese Experimente verwendet. Cortices von zwei bis sechs Tiere wurden gepoolt. FACS wurde UAB Umfassende Durchflusszytometrie Core Facility durchgeführt. Sortier wurde am Becton Dic...

DNA-Methylierung ist in der Lage, ein stabiles Niveau der Genexpression aufrechtzuerhalten und dynamische Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen zu ermöglichen. Wir beschreiben Techniken, die es ermöglichen, genspezifische Veränderungen der DNA-Methylierung und die Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Genexpression zu untersuchen.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den DNA-Methylierungsstatus von KCNJ10 in einer angereicherten Population von Astrozyten zu bewerten und Veränderungen der DNA-Methylierung des Promotors mit der transkriptionellen Aktivität zu korrelieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine angereicherte Population kortikaler Astrozyten aus dem gesamten Nagetierhirn mittels FACS-Sortierung isoliert wird; anschließend wird die DNA aus der angereicherten Astrozytenpopulation gewonnen. Danach wird der DNA-Methylierungsstatus von KCNJ10 mittels methylierungssensitiver Hochauflösender Schmelzanalyse (MS.HRMA) bestimmt.Schließlich ist der KCNJ10-Promotor hypermethyliert, und ein Luciferase-Assay wird verwendet, um Veränderungen der DNA-Methylierung des Promotors mit der transkriptionellen Aktivität zu korrelieren. Letztendlich werden MS-HRMA und der Luciferase-Assay eingesetzt, um den DNA-Methylierungsstatus von KCNJ10 zu messen und Veränderungen in der Methylierung des Promotors mit der transkriptionellen Aktivität des Gens zu korrelieren. Das Verfahren wird veranschaulicht werden durch einen Postdoktoranden aus meinem Labor. Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health behandelt, die Verwendung von Tieren wurde vom Ausschuss für Tierversuche und Tierschutz an der University of Alabama at Birmingham genehmigt.Alle Puffer und Reagenzien wurden gemäß dem Textprotokoll hergestellt. Nachdem die Kortexregionen gemäß dem Textprotokoll aus dem Kopf eines euthanasierten Tieres präpariert wurden, bohren oder fräsen Sie ein Loch in die Oberseite eines 50-Milliliter-Konischkolbens, um Schläuche in den Kolben führen zu können. Geben Sie anschließend Papinlösung in den Kolben.Legen Sie die dissezierten Kortizes in eine 10 Millimeter große Kulturschale, die mit auf 95 % O2 zu 5 % CO2 equilibriertem Dissoziationsmedium gefüllt ist, und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sauberen Rasierklinge in Stücke von je einem Quadratmillimeter. Überführen Sie das Gewebe mit einer 10-Milliliter-Pipette in das 50-Milliliter-Röhrchen, das die Pepan-Lösung enthält. Lassen Sie das Gewebe vor dem Ausbringen auf den Boden der Übertragungspipette sedimentieren.Um die Menge des übertragenden Dissoziationsmediums zu minimieren, ohne dass die Pepanlösung blubbert, leiten Sie während der Inkubation in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius 20 Minuten lang einen konstanten Fluss von 95 % O₂ zu 5 % CO₂ über einen Oberflächengasaustausch ein. Verwenden Sie nach der Inkubation eine 10-Milliliter-Transferpipette, um das Gewebe langsam zehnmal umzupipettieren, und zentrifugieren Sie die trübe Zellsuspension fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 300 × g. Äquilibrieren Sie die Albumin-DNA-Inhibitorlösung über Oberflächengasaustausch und resuspendieren Sie die Zellpellets in drei Milliliter dieser Lösung. Dann bereiten Sie eine kommerzielle diskontinuierliche Dichtegradientenlösung gemäß den Herstelleranweisungen vor. Zentrifugieren Sie den diskontinuierlichen Dichtegradienten mit 70 G für sechs Minuten. Anschließend isolieren Sie die dissoziierten Zellen vom Boden des Reaktionsgefäßes, indem Sie mithilfe einer Pipette das Medium abpipettieren.Verwenden Sie zwei bis drei Milliliter DPBS mit 0,02 % Rinderserumalbumin und ein Milligramm pro Milliliter DNA oder dem bevorzugten Medium. Zum Wiederaufschwemmen suspendieren Sie die dissoziierten Zellen. Filtern Sie die Zellen durch einen 40 µm-Filter, bevor Sie die Zellsortierung sowie die DNA- oder RNA-Extraktion gemäß dem Textprotokoll durchführen.Nachdem Primer gegen eine bisulfitkonvertierte DNA-Sequenz entworfen und die DNA gemäß dem Textprotokoll amplifiziert wurden, konvertieren Sie 500 bis 1000 Nanogramm DNA jeder Probe sowie methylierter DNA-Standards im Bereich von 0 bis 100 % aus derselben Tierart mittels einer bevorzugten DNA-Polymerase und 5 µM Primern. Richten Sie 20-µL-Reaktionen für die Ms-HRM-Amplifikation ein. Führen Sie alle Proben, einschließlich der FAX-DNA und der methylierten Standards, entsprechend dieser Tabelle in dreifacher Ausführung durch, abhängig von der verwendeten Analyse-Software, sowie vorher festgelegten Start- und Stopp-Parametern vor und nach den Übergängen der Schmelzkurve.Stellen Sie die Parameter für die Schmelzbeginn- und Schmelzendeinstellungen ein, sodass die Differenz zwischen beiden 0,2 bis 0,5 Grad Celsius beträgt. Stellen Sie den Schmelzende-Bereich analog ein und extrahieren Sie die Daten zur Peaktemperaturdifferenz für jede Probe unter Verwendung der prozentual methylierten Standardproben und ihrer entsprechenden Peaktemperaturdifferenzen.Erstellen Sie eine lineare Regressionsgleichung. Verwenden Sie diese lineare Regressionsgleichung, um den Methylierungsstatus unbekannter Proben abzuschätzen, nachdem CPG-Inseln von Interesse identifiziert und die CPG-Insel Luke zwei Plasmid gemäß dem Textprotokoll amplifiziert und kloniert wurden. Verwenden Sie eine geeignete Schnitter-Software, um Schnittstellen für den Restriktionsverdau zu überprüfen, um Doppelschnitte zu vermeiden, und linearisieren Sie 30 µg des Plasmids, sobald die Probe mit den geeigneten Enzymen verdaut wurde.Enzyme in 50-Mikroliter-Reaktionen bei der geeigneten Temperatur und Dauer hitzeinaktivieren. Fünf Einheiten CPG-Methylase verwenden, um 700 Mikrogramm linearisierte Plasmide bei 30 Grad Celsius 13 bis 19 Stunden lang zu methylieren.Nach der Reinigung der DNA gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll wird ein zweifacher HPA-Restriktionsverdau an Ein-Mikrogramm-Proben der methylierten DNA durchgeführt, indem diese eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Nach der Reinigung werden die Proben auf einem 1 %igen Agarose-Gel bei 100 Volt für 45 Minuten zur Visualisierung aufgetragen. Danach werden methylierte und nicht-methylierte Plasmide einer Doppelverdauung mit den geeigneten Restriktionsenzymen über Nacht unterzogen, um den vollständigen Luke-Zwei-Vektor und CPG-Insel-Fragmente freizusetzen.Die Enzyme nach der Verdauung durch Erhitzen inaktivieren. Die doppelt verdauten Proben eine Stunde lang auf einem 1 %igen Agarosegel bei 100 Volt laufen lassen, um Vektor und Insert zu trennen. Dann, unter UV-Lichtschutz arbeitend, das Gel auf eine Schwarzlichtquelle legen und mit sauberen chirurgischen Klingen die methylierten und nicht-methylierten Inserts herausschneiden. Nach der DNA-Extraktion aus dem Gel gemäß dem Textprotokoll T4-DNA-Ligase und ein Verhältnis von eins zu vier (Vektor zu Insert) verwenden, um die methylierten und nicht-methylierten Inserts in einen unmethylierten Vektor zu ligieren. Nach der Ligierung über Nacht bei minus 20 Grad Celsius oder auf Eis inkubieren.Reinigen Sie die DNA und überprüfen Sie die Re-Ligation, indem Sie Proben auf einem 1%-DNA-Agrose-Gel laufen lassen, und bestimmen Sie die Konzentration des re-ligierten Plasmids. Säen Sie CD54-Zellen in einer 12-Loch-Platte mit 140.000 Zellen pro Loch aus. 24 Stunden später verwenden Sie ein kommerzielles Transfektionsreagenz, um die Zellen mit gleichen Konzentrationen entweder eines nicht-methylierten CpG-Loop-2-Plasmids zusammen mit RAN-Vanilla oder eines anderen Kontroll-Vektors oder eines methylierten CpG-Loop-2-Plasmids zusammen mit ELLA oder einem anderen Kontroll-Luciferase-Vektor zu transfectieren. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang inkubieren, bevor Sie einen Luciferase-Assay durchführen.Lesen Sie jeden Wells entsprechend den Anweisungen des Herstellers im Triplikat mit einem Luminometer aus. Berechnen Sie das Verhältnis der Firefly-Luciferase-Aktivität zur Renilla-Luciferase-Aktivität oder einer anderen Kontrolle. Luciferase-Aktivität.Normalisieren Sie die methylierte Firefly-Kontrollluciferase-Aktivität relativ zur nicht-methylierten Firefly-Kontrollluciferase-Aktivität, indem Sie die methylierte Aktivität durch die methylierte Luc-Aktivität dividieren. Wie hier gezeigt, wurde eine angereicherte Population von Astrozyten durch FACS-Sortierung von E-G-F-P-S-100-beta-transgenen Tieren gewonnen. Eine gezielte Population wurde basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung definiert, und eine Population lebender Zellen wurde mithilfe eines Bromid-Totzellindikators bestimmt. Die hier dargestellten Gates zeigen repräsentative Bilder EGFP-positiver Astrozyten nach Dissoziation, jedoch vor der Sortierung sowie nach der Sortierung. Diese Abbildung zeigt eine isolierte EGFP-positive Zellpopulation, die eine 40-fache Erhöhung der mRNA für den Astrozyten-spezifischen Marker aufwies.Ein LDH pro L eins. Darüber hinaus wurde trotz gemeinsamer Expression von S100β und NG2 in positiven OPCs und Astrozyten eine vierfache Reduktion der NG2-mRNA, einem Marker für oligodendrozytäre Vorläuferzellen, beobachtet, was auf die Isolierung einer angereicherten Population astrozytärer Zellen hinweist. Diese Tabelle listet die Gesamtmengen an isolierter RNA und DNA aus Tieren unterschiedlichen Alters und unterschiedlicher Stückzahlen auf und dient als Referenz für die erwartete Ausbeute an molekularen Bestandteilen nachfolgender Fakten.Schließlich wurde ein duales Luciferase-Assay verwendet, um die transkriptionelle Aktivität hypermethylierter Regionen des Gens von Interesse zu bewerten, nachdem das methylierte Insert in einen nicht methylierten Vektor übertragen worden war. HpaII, das ausschließlich nicht methylierte DNA verdaut, wurde zur Überprüfung des Methylierungsstatus des Plasmids eingesetzt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine angereicherte Population von Astrozyten mittels FACS isoliert sowie wie man die DNA-Methylierung eines Gens misst und Veränderungen in der DNA-Methylierung des Promotors entsprechend mit der transkriptionellen Aktivität korreliert, und zwar unter Verwendung der methylierungsempfindlichen Hochauflösungs-Schmelzanalyse bzw. des Luciferase-Assays.

correlating-gene-specific-dna-methylation-changes-with-expression

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Diese Studie beschreibt die Verfahren für die Einrichtung einer neuartigen neuronalen Axon und (astro) Glia Co-Kultur-Plattform. Auf diese Co-Kultur-System wird Manipulation direkte Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon (und einzigen Gliazelle) durchführbar ist, so dass mechanistischen Analyse des gegenseitigen Neuron zu glialen Signalisierung.

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die...

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Die Eigenschaften und Funktionen der intrazellulären Ca2+-Signale der Astrozyten im Striatum sind noch unvollständig erforscht. Wir beschreiben Methoden zur Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren in striatalen Astrozyten unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren des Serotyps 2/5 (AAV2/5) sowie Verfahren zur zuverlässigen Abbildung von Ca2+-Signalen in striatalen Astrozyten in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca 2+ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik zu verwenden, um bestimmte Arten von Nervenzellen für die anschließende Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, epigenetischen Markern und/oder Proteinexpression zu sortieren.

Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Astrozyten kacheln die Großhirnrinde gleichmäßig, was die Analyse ihrer komplexen Morphologie auf zellulärer Ebene schwierig macht. Das hier bereitgestellte Protokoll verwendet eine mehrfarbige Etikettierung basierend auf der in utero Elektroporation, um kortikale Astrozyten herauszuarbeiten und deren Volumen und Morphologie mit einer benutzerfreundlichen Bildanalyse-Pipeline zu analysieren.

In Utero Elektroporation von Multiadressierbaren Genom-integrierenden Farbe (MAGIC) Marker zur Individualisierung kortikaler Maus-Astrozyten

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Verwendung von DeepSpaceDB vorgestellt, einer dynamischen, interaktiven Datenbank für die räumliche Transkriptomik, die Analyse-Workflows und Beispiele zur Untersuchung der Gewebeorganisation und krankheitsbezogenen Genexpression bietet.

Mining von räumlichen Transkriptomik-Datensätzen mit DeepSpaceDB

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Beschreibung einer Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Kalziumsignalen von Neuronen und Astrozyten über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen hinweg und demonstriert deren Anwendung während eines Lern- und Gedächtnisverhaltensparadigmas.

Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

Lernen Sie die DNA-Methylierungsanalyse des KCNJ10-Gens in Astrozyten mittels MS.HRMA und Luciferase-Assay. Diese Methode ermöglicht die Korrelation epigenetischer Veränderungen mit der Transkriptionsaktivität.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre KCNJ10 (Kir4.1) (Video) | JoVE Journal

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre

Weitere Videos entdecken