Steuern der Größe, Form und Stabilität der supramolekularen Polymeren in Wasser

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Größe, Form und Stabilität von supermolekularen dynamischen Nanopartikeln in Wasser zu kontrollieren. Dies wird durch das Design von selbstorganisierenden oder polymerisierenden dichotischen Amplifikationen erreicht, deren molekulare Struktur sowohl für anziehende als auch abstoßende Wechselwirkungen beschichtet ist. Dies führt zu einem frustrierten Wachstumsmechanismus, der zu selbstorganisierten Nanopartikeln in Wasser mit einer kontrollierten Kugelform führt.

In einem zweiten Schritt wird die Salzkonzentration der wässrigen Lösung erhöht, wodurch die abstoßenden Wechselwirkungen, die in der Molekularstruktur der Disco-Amphi kodiert sind, abgeschwächt werden. Dies führt zu einem Übergang von Kugel zu Stäbchen, temperaturabhängigem Zirkulardismus oder CD-spektroskopischen Untersuchungen oder zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen des Übergangs von Kugel zu Stäbchen. Darüber hinaus wird eine Kombination von Analysetechniken wie der kryogenen Transmissionselektronenmikroskopie und einer Kernspinresonanz verwendet, um den Übergang von einer Art von Aggregat zu den anderen zu messen und zu visualisieren. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass der Übergang von Kugel zu Stäbchen in einer verstärkten Kooperation in der supermolekularen Polymerisation zum Ausdruck kommt.

Dies entsteht in einem Übergang von einem antikooperativen Prozess in Nanopartikeln begrenzter Größe zu einem vollständig kooperativen Mechanismus zur Nukleationsverlängerung, der zu sehr großen supramolekularen Polymeren, in diesem Fall, dynamischen Nanostäbchen, führt. Der Hauptvorteil der Kombination von spektroskopischen Techniken wie CD-Spektroskopie, kleiner Anular-, Röntgenstreuung und MR mit mikroskopischen Techniken wie Kryo besteht darin, dass sie es ermöglicht, Übergänge von supermolekularen Polymeren in Wasser zu messen und sichtbar zu machen. Diese dynamischen Polymere können auf äußere Reize wie Änderungen der Temperatur, Änderungen der OnX-Stärke oder Änderungen des pH-Werts reagieren.

Die Kombination dieser Methoden ist breit anwendbar und kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Molekularchemie und selbstorganisierte Nanomaterialien zu beantworten. So kann beispielsweise der Zusammenhang zwischen den Dimensionen der Aggregate, die durch die Selbstorganisation kleiner molekularer Bausteine gebildet werden, und den zugrundeliegenden Bildungsmechanismen untersucht werden. Die Implikationen dieser Methodik erstrecken sich auf ein breites Spektrum bionanotechnologischer Anwendungen.

Wir haben uns besonders für den Bereich der biomedizinischen Bildgebung und die Entwicklung von selbstorganisierten nanopartikulären Kontrastmitteln interessiert, bei denen ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Aggregatstabilität, dem hohen Kontrast und der Fähigkeit, die selbstorganisierten Kontrastmittel auszuscheiden, von größter Bedeutung für ihren Erfolg im klinischen Einsatz ist. Wir kamen auf die Idee, Charakterisierungstechniken zu kombinieren, als wir erkannten, dass subtile Veränderungen in der molekularen Struktur der selbstorganisierenden Bausteine zu grundlegenden Unterschieden im Mechanismus der supermolekularen Polymerisation führen können. Das Verfahren wird von Paul Beaumont vorgeführt, der Experte und verantwortlich für die Kryo-10-Anlagen an der Technischen Universität Trovan.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Herstellung einer BTA-Gadolinium-DTPA-Lösung in 100 Millimolar-Citrat-Puffer, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Füllen Sie zu diesem Video einen einen Zentimeter großen UV Q Tierarzt mit der Lösung. Setzen Sie den Tierarzt in die qve-Halterung des kreisförmigen D-Crowismus-Spektrometers ein.

Messen Sie ein CD-Spektrum von 230 bis 350 Nanometern. Messen Sie dann eine CD-Kühlkurve im CD-Band mit der höchsten Intensität von 363 bis 283 Kelvin mit einer Rate von einem Kelvin pro Minute. Als nächstes wird das gleiche Volumen von zwei molaren Natriumchlorid-gepufferten Lösungen zu der Citrat-gepufferten Lösung von BTA Gadolinium DTPA hinzugefügt.

Dadurch wird die Ionenstärke auf ein molares Natriumchlorid erhöht und die Diskotheken auf die Hälfte der Konzentration verdünnt. Wirbeln Sie die Lösung mit erhöhter Ionenstärke 40 Sekunden lang nach der Erhöhung der Ionenstärke vor und messen Sie ein CD-Spektrum von 230 auf 350 Nanometer neu. Messen Sie dann eine CD-Kühlkurve im CD-Band mit der höchsten Intensität von 363 bis 283 Kelvin mit einer Rate von einem Kelvin pro Minute.

Exportieren Sie die CD-Rohdaten in Origin 8.5. Normalisieren Sie die Spektren, indem Sie den CD-Effekt bei der höchsten gemessenen Temperatur als gleich Null und den CD-Effekt bei der niedrigsten gemessenen Temperatur als gleich eins definieren. Da die Größe des CD-Effekts proportional zum Aggregationsgrad ist, sind die normierten CD-Kurven proportional zum Aggregationsgrad. Die normierten Daten werden mit einer Option zur nichtlinearen Kurvenanpassung in Origin Pro 8.5 mit einem temperaturabhängigen Selbstorganisationsmodell angepasst.

In diesem Modell werden ein Keimbildungs- und ein Elongationsregime unterschieden. Passen Sie zunächst den Aggregationsgrad an das Dehnungsregime an. In dieser Gleichung steht T für die Variable Temperatur.

PHI N ist die Netto-Helizität, die proportional zum Aggregationsgrad ist, und HE ist die molekulare Enthalpie der Elongation. T TE steht für die Dehnungstemperatur, d. h. die Temperatur, bei der die Selbstorganisation beginnt, thermodynamisch günstig zu werden. Der Normalisierungsfaktor Fiat wird eingeführt, um sicherzustellen, dass Phi N über Fiat die Eins nicht überschreitet, was aus der Einschränkung folgt, dass der Aggregationsgrad nicht überschreiten darf.

Die Einheitsanpassung ermöglicht die Extraktion der Enthalpie der Elongation in Steinen pro Mol und der Elongationstemperatur in Kelvin, die die Selbstorganisation der Moleküle für eine gegebene Konzentration charakterisiert. Bei der Anpassung ist die Vorgabe zu beachten, dass nur der Aggregationsgrad bei Temperaturen unterhalb von TE angepasst werden sollte, da die Gleichung erst nach Anpassung der ersten Gleichung im Dehnungsbereich gültig ist, ist der einzige unbekannte Parameter in der Gleichung des Keimbildungsregimes die Aktivierungskonstante ka, die die Kooperativität der supramolekularen Polymerisation beschreibt. Um die Anpassung der Aktivierungskonstante zu finden, wurde der experimentell ermittelte Aggregationsgrad für Temperaturen über TE im Nukleationsbereich ermittelt.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Lösungen für die Elektronenmikroskopie, wie im Text beschrieben. Bereiten Sie kurz zwei Puffer vor, einen 100 Millimolar Citrat Puffer und einen 100 Millimol Citrat Puffer, wobei fünf molare Natriumchlorid auflösen, BTA Gadolinium DTPA in 0,1 Millilitern von jedem der vorbereiteten Puffer, um eine Dekokonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Anschließend wird ein mit Quantenfolie beschichtetes Gitter mit einem C Resington 2 0 8 Kohlenstoff-Coer 40 Sekunden lang mit fünf Milliampere plasmabehandelt.

Das Vitrifikationsverfahren ist ein entscheidender Schritt der Kryotherapie, da es sicherstellt, dass eine dünne Schicht aus glänzendem ISIS, die bei hergestellt wird, für die TAM-Analyse geeignet ist. Die wässrige Lösung wird während der Vitrifikation auf einem automatisierten FEI-vitro-Bot auf das Gitter aufgetragen. Dies beinhaltet das Auftragen der Probe auf das Gitter, das Abtupfen von überschüssiger Flüssigkeit, um einen dünnen Film der wässrigen Lösung auf dem Gitter zu erzeugen, und die anschließende Vitrifizierung durch sehr schnelles Eintauchen des Gitters in flüssiges Ethan.

Nach der Vitrifikation überführen Sie das behandelte Gitter in flüssigen Stickstoff, um es zu konservieren, und übertragen Sie das Probengitter dann manuell auf eine Autoloader-Kassette, die ebenfalls mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Der nächste Schritt besteht darin, die Kassette in den TUE cryo Titan, TEM auto Loader einzusetzen. Der TUE Cryo Titan ist mit einer Feldemissionskanone ausgestattet, die mit 300 Kilovolt arbeitet.

Das Aufzeichnen der TAM-Bilder erfordert Erfahrung und eine schnelle Handhabung. Dies liegt daran, dass der hochenergetische Elektronenstrahl die Probe während der Bildgebung beschädigt Nehmen Sie Bilder mit einer CCD-Kamera auf, die mit einem Gattin-Energiefilter für die Nachsäule ausgestattet ist. Da Gadolinium hochgradig paramagnetisch ist und die Protonensignale dadurch erheblich verbreitert würden, wurde eine andere Disco verwendet, in der Gadolinium durch diamagnetisches Yttrium und eine Lösung aus BT-Atrium substituiert wurde.

DTPA ist vorbereitet. Es ist zu berechnen, wie viele Milligramm BT atrium DTPA bei einem Molekulargewicht von 2.979 Gramm pro mol notwendig sind, um eine Zielkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Fahren Sie fort, die ermittelte Menge an BT atrium DTPA in 50 Millimolar derated Succinatpuffer in D zwei O aufzulösen, nachdem Sie 0,6 Milliliter der resultierenden Lösung in ein Wilm, ein LABAs NMR-Röhrchen, pipettiert haben.

Setzen Sie die Probe in ein Spektrometer Nova 500 ein, das mit einer Fünf-Millimeter-I-D-P-F-G-Sonde von Varian ausgestattet ist. Führen Sie die DOI-Experimente, wie im Text beschrieben, nach der Aufnahme eines Standard-Protonen-NMR durch, passen Sie den 90-Grad-Puls an und optimieren Sie die Mischzeiten entsprechend. Die DOI-One-Shot-Pulssequenz von wird nach Bestimmung der Selbstdiffusion von HDO in der ovariellen Referenzsonde verwendet, und in der Probe wird der Diffusionskoeffizient der Aggregate bestimmt, aus dem der hydrodynamische Radius berechnet werden kann.

Berechnen Sie abschließend die hydrodynamischen Radien RH der Aggregate unter Verwendung der Stokes-Einstein-Beziehung für die Diffusion eines kugelförmigen Partikels. Der ionische Charakter der peripheren Gadolinium-DTPA-Komplexe führt zu Frustration im eindimensionalen Wachstum der Disco-Monomere, deren Kern darauf ausgelegt ist, zu länglichen, stäbchenartigen Aggregaten zu polymerisieren. Das Gleichgewicht zwischen anziehenden und abstoßenden Wechselwirkungen steuert die Größe und die Form der Aggregate.

Eine leistungsfähige Technik zur Bestimmung der Größe und Form von Partikeln und Lösung ist die Synchrotronquelle. Röntgenstreuung mit kleinem Winkel oder Sauger. BTA Gadolinium DTPA wurde in Citratpufferlösung gelöst und die Saugprofile wurden in zwei verschiedenen Konzentrationen aufgezeichnet.

Eine Steigung, die sich Null nähert, im niedrigen Q-Bereich deutet auf einen Mangel an Form und Isotropie im Aggregat hin, was auf das Vorhandensein von kugelförmigen Objekten hindeutet. Die bei unterschiedlichen Konzentrationen gemessenen Daten wurden unter Verwendung eines homogenen monodispersen sphärischen Formfaktors angepasst, was zu einem berechneten Radius von 3,2 Nanometern führte. Der berechnete geometrische Radius von monomerer Disco, BTA Gadolinium DTPA beträgt 3,0 Nanometer, den das Vorhandensein von Aggregaten mit einem Aspektverhältnis von nahe eins aggregiert, um einen weiteren Nachweis für die Kugelform und Nanometergröße der selbstorganisierten Objekte zu liefern.

Es wurde eine geordnete NMR-Spektroskopie mit Protonendiffusion durchgeführt. Die DOI-NMR ermöglicht die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten der supermolekularen Aggregate, aus denen ihr hydrodynamischer Radius berechnet werden kann. Der Diffusionskoeffizient des aggregierten diamagnetischen dichotischen Amplifizierens in einem deuterierten Succinatpuffer wurde über die Stokes-Einstein-Beziehung mit 0,69 mal 10 hoch minus 10 Quadratmetern pro Sekunde bestimmt.

Für die diskreten Objekte von kugelförmiger Größe wurde ein hydrodynamischer Radius von 2,9 Nanometern berechnet. Diese Größe ist eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit dem Wert, der aus den SOX-Daten für BTA Gadolinium DTPA erhalten wurde. Ein weiterer Beweis für eine erfolgreiche Kontrolle über die eindimensionale Stapellänge wurde durch Kryo-TEM-Mikroskopaufnahmen gewonnen.

Das BTA-Gadolinium DTPA erzeugt die erwarteten sphärischen Objekte mit Durchmessern nahe sechs Nanometern bei einer Konzentration von einem Millimolar, was die Ergebnisse von SO- und DOI-Messungen bestätigt. Die Bildung von Stäbchen mit hohem Aspektverhältnis, wie supramolekulare Polymere, ist in Kryo-Mikroskopaufnahmen bei hoher Ionenstärke deutlich zu beobachten. Elektrostatisches Screening ist die wahrscheinlichste Erklärung für diesen Befund.

Die Form ändert sich von einem kugelförmigen Aggregat mit einem Durchmesser von etwa sechs Nanometern zu länglichen Stäben mit einem Durchmesser von sechs Nanometern und einer Länge von bis zu mehreren hundert Nanometern. Hier sind die Raumtemperatur-CD-Spektren von BTA Gadolinium DTPA mit zunehmender Salzkonzentration dargestellt. Die BTA-Gadolinium-DTPA-Konzentration beträgt acht mal 10 hoch minus drei Millimolar bei niedriger Ionenstärke und viermal 10 hoch minus drei Millimolar bei hoher Ionenstärke.

Obwohl für die CD-Messungen eine deutlich niedrigere Konzentration angewendet wird, deutet der klare Baumwolleffekt auf das Vorhandensein intakter Aggregate auch bei mikromolaren Konzentrationen hin. Die Form des CD-Spektrums ändert sich mit zunehmender Salzkonzentration, was ein guter Hinweis auf reduzierte abstoßende Wechselwirkungen an der Peripherie der Stapel und eine verbesserte Packung der Dekos ist. Darüber hinaus zeigen die CD-Kühlkurven der gleichen Lösungen deutliche Unterschiede in der Form.

Die Temperatur, bei der die Aggregation beginnt, verschiebt sich zu höheren Temperaturen bei höherer Salzkonzentration. Es wird auch ein zunehmend kooperativer Mechanismus deutlich, der durch einen abrupteren Anstieg des CD-Effekts gekennzeichnet ist, während die Abkühlungskurve bei null molarem Natriumchlorid am besten durch ein ISO-smisches Selbstorganisationsmodell beschrieben wird, das auf einen antikooperativen Prozess hinweist. Die Abkühlkurve bei 1,0 molaren Natriumchlorid ist typisch für einen kooperativen Selbstorganisationsprozess und kann durch ein Keimbildungsdehnungsmodell beschrieben werden, das die thermodynamischen Parameter der Selbstorganisation von BTA gadolinium DTPA bei null und einem molaren Natriumchlorid quantifiziert

Die Verwendung eines kooperativen Modells zeigt deutlich die Abnahme von ka, d. h. die dimensionslose Aktivierung. Konstante. Niedrigere Werte für KA deuten auf einen höheren Grad an Kooperation im Selbstorganisationsprozess hin, der sich in der Bildung von hochlänglichen supramolekularen Polymeren äußert. Wie bei der Kryo-TEM zu beobachten ist, ist es wichtig, sich beim Ausprobieren der demonstrierten experimentellen Techniken daran zu erinnern, dass nur eine Kombination von experimentellen Methoden zu einer aussagekräftigen Gesamtbeschreibung der zu untersuchenden dynamischen Nanomaterialien führen kann.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie breit anwendbar unser kombinierter experimenteller Ansatz ist und wie er dazu beitragen kann, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der selbstorganisierten Nanomaterialien und Supergedichte zu beantworten.