Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stamm- oder IPS-Zellen zu generieren und zu charakterisieren. Die IPS-Zellen können dann in vitro auf einem OP nine DL Ein-Kultur-System differenziert und dann in vivo in einer Rag-defizienten Maus gereift werden. Oder die Zellen können gentechnisch so verändert werden, dass sie OT einen TCR überexprimieren und dann adoptiv für die In-vivo-Entwicklung übertragen werden.

Nach sechswöchiger in vivo Differenzierung können die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit EEG sieben Tumorzellen herausgefordert und anschließend die Antigenspezifität der IPS-abgeleiteten T-Zellen bewertet werden. Letztendlich können sich die IPS-Zellen sowohl in konventionelle als auch in antigenspezifische T-Zellen differenzieren, von denen letztere in der Lage sind, Tiere vor Tumoren zu schützen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf eine individualisierte Krebsimmuntherapie.

Die Methode ermöglicht die Erzeugung einer großen Anzahl von tumorreaktiven T-Zellen, die aus einer minimalen Menge an Blut oder Hautgewebe des Patienten stammen. Am Tag Null werden fünfmal 10 IPS-Zellen auf eine 100-Millimeter-Kulturschale übertragen, die eine konfluente OP neun, DL eine Zell-Monoschicht in 20%FBS alpha MEM-Medien enthält. Trypsin-Augen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen, nachdem Sie sie auf einer frischen 100-Millimeter-Kulturschale für 30 Minuten und einer 37-Grad-Inkubatorplatte inkubiert haben, fünf mal 10 bis zum Fünftel der schwimmenden Zellen in 20%FBS alpha, MEM-Medien und Maus-Flach-Drei-Liganden auf einer neuen 100-Millimeter-Schale, die eine Monoschicht von OP neun enthält. DL one Zellen am achten Tag pipettieren Sie die lose anhaftenden Zellen vorsichtig nach unten, zentrifugieren Sie die Zellen und übertragen Sie die Zellen dann in eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte, die mit konfluenten OP neun DL one Zellen beschichtet ist, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für zwei weitere Wochen am Tag 22.

Inkubieren Sie abgelöste IPS-Zellen in frischem Medium auf einer neuen Kulturschale bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Entfernen Sie dann etwa die Hälfte der schwimmenden Zellen und passieren Sie sie durch ein 70-Mikron-Nylonsieb, um Zellklumpen auszuschließen, und waschen Sie die resultierende Einzelzellsuspension dreimal mit kaltem PBS. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in PBS mit dem 1,5-fachen Zehntel der siebten Zellen pro Milliliter und halten Sie die Zellen vor der IV-Injektion auf Eis.

Setzen Sie eine vier Wochen alte Maus mit Lumpenmangel unter Infrarotlicht, um die Schwanzvene zu erweitern. Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 26,5-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 200 Mikrolitern der Zellsuspension und übertragen Sie die Zellen adoptiv durch die erweiterte Schwanzvene. Drei Wochen später, nachdem die Euthanasation der adoptiv übertragenen Maus bestätigt wurde, entfernen Sie die Lymphknoten und die Milz, nachdem Sie das Gewebe mechanisch abgebaut haben.

Die Einzelzellsuspension wird mit einem CK-Lysepuffer lyciert und die resultierenden Mononukleozyten werden dann zweimal in kaltem PBS gewaschen. Dann, nach der Färbung auf Zelloberflächenmarker, bewerten Sie die Zellen durch durchflusszytometrische Analyse am Tag Null, verwenden Sie das Gen-JAMA-Transfektionsreagenz, um über Nacht plattierte Platte E-Verpackungszellen mit einem OT eins MIDR am ersten Tag zu transfizieren Seed eins mal 10 zu den sechs IPS-Zellen in eine Vertiefung einer 0,1%ige Gelatine vorkodierten 24-Well-Platte am zweiten Tag, Sammeln Sie das Pseudovirus, das S-Natin enthält, aus den Zellen der Plat-E-Zellen und leiten Sie es dann durch einen 0,4-Mikron-Filter, um potenzielle Verunreinigungen nach der Zentrifuge auszuschließen. Transduzieren der Zellen in Gegenwart eines Polyhirns für eine Stunde bei 330 mal G bei 32 Grad Celsius.

Inkubieren Sie sie über Nacht bei der gleichen Temperatur, nachdem Sie den Transduktionsvorgang wiederholt haben. Trypsin beäugt die transduzierten IPS-Zellen am vierten Tag und nach der Pelletierung reanimieren die Zellen die Zellen in frischem Medium und säen sie auf vorkodierten, bestrahlten snl 7 6 7 Feeder-Zellen aus. Sobald die transduzierten Zellen die Konfluenz erreicht haben, sortieren die GFP- und DS-roten doppelt positiven Zellen durch Durchflusszytometrie.

Sechs Wochen nach dem adoptiven Transfer der IPS-Zellen injizieren am 50. Tag der Tumorprovokation 50 Mikroliter EEG sieben Thomazellen in die Bauchhöhle derselben Maus. Verwenden Sie ein Mil E biotech CD acht positive T-Zell-Isolationskit, um CD acht positive T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten des adoptiv übertragenen Tieres zu sortieren. Mischen Sie die isolierten CD acht positive T-Zellen mit bestrahlter SPOC-Größe von einer naiven C 57 schwarzen sechs J-Maus im Verhältnis eins zu 10 und pulsieren Sie die Co-Kultur mit 0,5 Mikromol pro Mil Eizellen für 40 Stunden.

Geben Sie danach Felden A für weitere vier Stunden in die Zellen. Bewerten Sie schließlich die Zellpopulationen durch durchflusszytometrische Analyse Nach der Isolierung von SP-Zyten aus einer naiven C 57 Black Six J-Maus. Teilen Sie die Zellsuspension in zwei Gruppen auf.

Markieren Sie die CFSE-High-Gruppe mit fünf Mikromol pro Mil CFSE und pulsieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit 10 Mikrogramm pro Mil Eizellenpeptid, die Markierung A-C-F-S-E Niedriggruppe mit 0,5 MICROMOL pro Mil CFSE und pulsieren Sie nicht. Mischen Sie 2,5 mal 10 bis zur sechsten, die CFSE-High-Zellen mit 2,5 mal 10 bis zur sechsten, die CFSE-Low-Zellen in PBS. Analysieren Sie dann die Zyten mittels Durchflusszytometrie auf CFSE-Expression.

16 Stunden nach dem adoptiven Transfer in die Maus von Interesse Zur Zählung intraperitonealer Tumorzellen am Tag 20 der Tumorprovokation. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-einhalb-Gauge-Nadel und kaltem PBS ausgestattet ist, um die Bauchhöhle zu spülen. Zählen Sie die geborgenen Tumorzellen, um tumorinfiltrierende Zellen zu identifizieren.

Entfernen Sie den Tumor in einem späten Stadium der Tumorprovokation und schneiden Sie den Tumor dann in drei Stücke. Legen Sie das erste Tumorstück in ein Kryo-Fläschchen und stellen Sie das Fläschchen auf Trockeneis. Fixieren Sie sofort das zweite Stück Formaldehyd.

Bewahren Sie das dritte Stück in konditioniertem RPMI 1640-Medium auf, nachdem Sie die kryokonservierten Gewebeschnitte an der Luft getrocknet haben. Fixieren Sie sie 15 Minuten lang in kaltem Aceton, nachdem Sie die fixierten Abschnitte weitere 15 Minuten an der Luft getrocknet haben. Waschen Sie die Objektträger nach dem Waschen fünf Minuten lang in PBS.

Legen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und bedecken Sie die Gewebeschnitte 30 Minuten lang mit 30 Mikrolitern 3%B, SA und PBS, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. Tupfen Sie dann den Blockierungspuffer ab und inkubieren Sie die Gewebeschnitte mit einer 50-Mikroliter-Mischung aus pe anti TCR RV alpha zwei Antikörper und fitzy anti ova Antikörper, verdünnt in 3 % PSA in PBS in der feuchten Kammer für zwei Stunden am Ende der Inkubation. Waschen Sie die Objektträger dreimal in kaltem PBS, montieren Sie die Schnitte schließlich mit einem wasserbasierten Einbettmedium, bevor Sie die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung für die durchflusszytometrische Analyse von tumorinfiltrierenden T-Zellen durchführen.

Zerquetschen Sie den Tumor in eine einzellige Suspension. Analysieren Sie dann die Zellen auf spezifische Oberflächenmarker. C, CD, 3 und TCR beta werden als Marker von T-Zellen verwendet, um zu bestimmen, ob die Stimulation von IPS-Zellen mit dem Notch-Liganden DL eins zur Oberflächenexpression der T-Zellen CD vier und CD acht auf CD drei positiven TCR r beta-positiven IPS-Zellen beitragen könnte.

Beachten Sie das Punktdiagramm auf der rechten Seite, das Tag 22 zeigt: CD drei positive TCR, R, Beta-positive CD vier negative CD und acht positive einzelne positive T-Zellen, die in vitro aus IPS-Zellen erzeugt wurden. Darüber hinaus produzierten die aus der IPS-Zelle abgeleiteten einzelnen positiven Zellen aus der vorherigen Abbildung Interleukin zwei und Interferon gamma, wenn sie in vitro durch plattenbeschichtete Anti-CD 3- und lösliche anti CD 28-Antikörper stimuliert wurden, was bestätigt, dass die von IPS-Zellen abgeleiteten T-Zellen nach adoptivem Transfer in Empfängermäuse funktionsfähig sind. Die Mehrzahl der im TCR-Gen transduzierten IPS-Zellen durchlief eine Differenzierung in CD 8-positive CTLs, die in vitro auf die Peptidstimulation reagierten, indem sie Interleukin zwei und Interferon gamma in diesen Dot-Plots aus gepoolten Lymphknoten- und Milzzellen sezernierten.

CD acht positive V beta fünf positive T-Zellen wurden in Mäusen erzeugt, die adoptiv mit TCR-transduzierten, aber nicht kontrolltransduzierten IPS-Zellen übertragen wurden. Die acht positiven V-Beta- und 5-positiven Populationen waren positiv für die intrazelluläre Zytokinfärbung für die Interleukin-2- und Interferon-Gamma-Produktion, die in diesen Histogrammen durch die dunklen Linien dargestellt werden, im Vergleich zu den schattierten Isotyp-Kontrollhistogrammen, die darauf hinweisen, dass die IPS-abgeleiteten CTLs funktionsfähig waren. Diese Daten zeigen, dass CFSE-Hochzellen mit Eptid pulsierten, dargestellt durch die Peaks rechts in jedem Diagramm, und CFSE-Zellen mit niedriger Kontrolle, dargestellt durch die Peaks auf der linken Seite, die Mäusen 10 Wochen nach dem IPS-Zelltransfer oder einen Tag nach dem O OT One CTL-Transfer injiziert wurden.

Die antigenspezifischen IPS-abgeleiteten CTLs reagierten auf die Antigenstimulation und wiesen eine zytotoxische Aktivität auf, was hier durch das Fehlen von CFSE-Hochzellen angezeigt wird. OT ein TCR-Gen transduzierte IPS-Zellen wurden adoptiv in C 57 schwarze sechs Mäuse übertragen, und dann wurden die Mäuse einer EEG-Herausforderung unterzogen: Am Tag 20 wurden sieben Tumorzellen in der Bauchhöhle aufgezählt. Beachten Sie die signifikante Verringerung der Tumorzellzahlen bei Mäusen, die TCR TRANSDUCED IPS erhielten, im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Am wichtigsten ist, dass der adoptive Transfer von TCR-TRANSDUZIERTEN IPS-Zellen die Infiltration von überreaktiven CTLs in Tumorgewebe auslöste und die Tiere vor Tumorprovokation schützte, wie in dieser h und e Färbung von Tumorgeweben zu sehen ist, die Tage 30 bis 35 nach Tumorprovokationstumoren von Mäusen adoptiv mit TCR-transduzierten Zellen oder OT one CTLs übertragen wurden, aber nicht mit Mock injiziert oder kontrolliert wurden. Transduzierte Zellen wurden von Entzündungszellen infiltriert, wie hier durch die roten Pfeile angedeutet. Es wurde festgestellt, dass Ova-spezifische V alpha zwei positive CTLs in rot in Eizellen infiltrieren, die Tumorgewebe in grün exprimieren.

Während Tumore in Mäusen aus den Kontrollgruppen in dieser Abbildung weniger oder keine tumorinfiltrierenden Zellen aufwiesen, wurden Einzelzellsuspensionen aus Tumorgeweben mittels Durchflusszytometrie auf Expression von V alpha zwei Positivität und V beta fünf Positivität analysiert, nachdem sie an der CD 8 positiven Population gated hatten. Es ist zu beachten, dass Tumorgewebe von Mäusen, die adoptiv mit TCR-transduzierten IPS-Zellen übertragen wurden, den höchsten Anteil an tumorinfiltrierenden Zellen aufwiesen, während Tumoren von Mäusen, die Kontrolle erhielten, aufwiesen. Transduzierte IPS zeigten keine Infiltration durch ovaspezifische CD 8-positive T-Zellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man antigenspezifische T-Zellen aus IPS-Zellen generiert und wie man die Funktionen der von IPS abgeleiteten T-Zellen bewertet.