Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen
11. November 2015
Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, induzierte pluripotente Stammzellen oder IPCs aus humanen peripheren T-Zellen unter feederfreien Bedingungen zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, unter anderem wie IPS-Zellen in der klinischen Anwendung eingesetzt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass IPS-Zellen ohne die Einbeziehung eines möglichen Harm Refactorings geheilt werden können, was das Risiko einer Pathogenität verringert.
Die Implikation dieser Technik erweitert die weltweit klinisch relevanten IPS-Zell-basierten Therapien, da diese invasive Zellprobenahme mit einem geringeren Risiko verbunden ist, die Entwicklungs-IPS-Zellen undefinierten Krankheitserregern auszusetzen. Diese Methode kann also einen Einblick in die klinische Therapie des IPS-Dienstes geben. Es kann auch auf andere Bereiche angewendet werden, z. B. auf die Modellierung von Krankheitsbedingungen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung aktivierter menschlicher T-Zellen, indem Sie 10 Milliliter heparinisiertes Vollblut mit 10 Millilitern DPBS-Pipette verdünnen. 15 Milliliter Fol-Lösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Pipettieren Sie das verdünnte Blut, das an der Innenwand des Röhrchens entlangläuft, langsam auf die Lösung.
Achten Sie darauf, die Benutzeroberfläche nicht zu stören. Das Röhrchen wird bei 400 mal G 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden drei Schichten beobachtet, darunter eine untere klare Schicht, eine dünne weiße Schicht mit mononukleären Zellen und eine obere milchige Plasmaschicht.
Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen, ohne eine passende Lochlösung zu übertragen. Fügen Sie als Nächstes DPBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter zu bringen. Das Röhrchen wird bei 200-facher G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern DPBS, zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 200-fachem G und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann einen Milliliter KBM 5 0 2 Medium zu den Zellen und zählen Sie mit einem Hämozytometer zur Vorbereitung der Zellkulturschale, beschichten Sie die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Anti-Human-CD-3-Antikörperlösung in PBS. Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Nach der Inkubation nehmen Sie die Antikörperlösung aus der achten Platte und waschen Sie die mononukleären Zellen einmal mit PBS-Seed bei einer Dichte von 2,5 mal 10 bis zu einem Fünftel Zellen pro Quadratzentimeter in einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern KBM 5 0 2 Medium in den beschichteten Sechs-Well-Platten, inkubieren Sie die Zellen drei bis sieben Tage lang, ohne das Medium zu wechseln, Zu diesem Zeitpunkt sollte die T-Zelle nach drei bis sieben Tagen die Konfluenz erreichen. Die aktivierten T-Zellen mit einem Medium in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführen und fünf Minuten lang bei 200-fachem G zentrifugieren. Entfernen Sie das SNAT und fügen Sie einen Milliliter frischen KBM 5 0 2 medium hinzu.
Zählen Sie die Zellen und die Platte 1,5 mal 10 zu den sechs Zellen in zwei Millilitern KBM 5 0 2 Medium in jede Vertiefung einer Anti-CD mit drei Antikörpern beschichteten Sechs-Well-Platte, dann tauen Sie die OC drei SOX zwei, KLF vier und C-M-Y-C-H, und L sendi Viruslösungen auf Eis bei jedem manipulierten Sendai-Virus einzeln zu jeder Vertiefung und eine Vielzahl von Infektionen von 10 auf. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Sammeln Sie dann die infizierten Zellen mit einer Pipette und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal G. Den Überstand entfernen und zwei Milliliter frisches KBM 5 0 2 medium hinzufügen. Setzen Sie die Zellen in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte ein und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator.
Um sich zurückzuziehen, tauen die Zellen zunächst die Basalmembran-Matrix-Lösung bei vier Grad Celsius über Nacht auf, lösen 0,2 Milliliter der gedachten Lösung in 10 Millilitern DMM F 12 Medium Plate und fünf Milliliter der Basalmembran-Matrix-Lösung in 100-Millimeter-Schalen auf. Lassen Sie die Platten mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Matrize die Schale beschichten kann, bevor Sie die Zellen aussäen. In der Zwischenzeit werden die mit dem SAI-Virus infizierten T-Zellen in einem konischen 15-Liter-Röhrchen gesammelt und fünf Minuten lang bei 200-fachem G zentrifugiert.
Dann wird der Gaumen in einem Milliliter frischem KBM 5 0 2 Medium resuspendiert und die Zellen nach der 30-minütigen Inkubationszeit mit einem Hämozytometer gezählt. Entfernen Sie die Basalmembran-Matrixlösung von den beiden Platten, dann resuspendieren Sie eins mal 10 in die fünften Zellen und separat einmal 10 in die sechs Zellen in 10 Milliliter frisches M-T-E-S-R-Medium, ein Feeder-Zell-freies Kulturmedium für IPSC. Pipettieren Sie jede Zellsuspension auf eine separate 100-Millimeter-Platte.
Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag nach 20 bis 30 Tagen. Es sollten Kolonien entstehen, die embryonalen Stammzellkolonien ähneln.
Bereiten Sie sechs Wandplatten für die IPSC-Expansion vor, indem Sie in jeder Vertiefung 30 Minuten lang einen Milliliter Basalmembranmatrixlösung bei Raumtemperatur inkubieren. Betrachten Sie in der Zwischenzeit Kulturplatten mit IPSC-Kolonien unter einem Stereomikroskop und isolieren Sie einzelne Kolonien, indem Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette abkratzen. Jede Kolonie wird in eine Vertiefung und eine 96-Wandplatte mit 20 Mikrolitern M-T-E-S-R-Medium umgefüllt.
Geben Sie nach dem Übertragen der Kolonien 200 Mikroliter M-T-E-S-R-Medium in jede Vertiefung und pipettieren Sie auf und ab, um die Kolonie zu stören. Nach dem Entfernen der Basalmembranmatrixlösung aus den sechs Well-Platten übertragen Sie Zellen von einer einzelnen Kolonie in jede Vertiefung, fügen dann zwei Milliliter M-T-E-S-R-Medium hinzu, inkubieren die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator und wechseln das Medium jeden zweiten Tag unter Verwendung von Feeder-freien Kultur- und serumfreien Medien ipsc, die aus menschlichen peripheren T-Zellen erzeugt wurden. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte die Expression typischer pluripotenter Zellmarker, darunter nano T drei vier SSEA vier, TRA one 60 und TRA 180 1.
In diesen abgeleiteten IPSE-Linien. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Schritte unter Berücksichtigung aller wichtigen Überlegungen zur Sterilität und biologischen Sicherheit durchzuführen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter konservenfreien Bedingungen unter Verwendung von Matrigel und Sendai-Virus-Vektoren. Dieses Verfahren zielt darauf ab, die Sicherheit und Wirksamkeit von iPSC-Anwendungen in der regenerativen Medizin zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Regenerativen Medizin
- Stammzellbiologie
- Zellreprogrammierung
Hintergrund
- Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) können aus verschiedenen somatischen Zellen gewonnen werden.
- Diese Methode minimiert das Risiko einer Pathogenität, das mit herkömmlichen Umprogrammierungstechniken verbunden ist.
- iPSCs besitzen ein erhebliches Potenzial für klinische Anwendungen und die Modellierung von Krankheiten.
- Kulturbedingungen ohne Futterzellen verbessern das Sicherheitsprofil der iPSC-Erzeugung.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Generierung von iPSCs aus humanen T-Zellen.
- Untersuchung der Bedeutung von iPSCs für klinische Therapien.
- Erlangung von Erkenntnissen zur Anwendung von iPSCs in der Krankheitsmodellierung.
Verwendete Methoden
- Isolierung mononuklearer Zellen aus menschlichem peripherem Blut.
- Aktivierung von T-Zellen mittels anti-humaner CD3-Antikörper.
- Transduktion von T-Zellen mit Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren tragen.
- Kultivierung der Zellen unter futterzellfreien Bedingungen mit geeignetem Kulturmedium.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Generierung von iPSCs aus menschlichen peripheren T-Zellen.
- Expression von pluripotenten Markern wie NANOG, SSEA-4 und TRA-1-60 in den gewonnenen iPSC-Linien.
- Nachweis der Machbarkeit der Anwendung dieser Methode für klinische Anwendungen.
- Erkenntnisse über das Potenzial der Krankheitsmodellierung mittels iPSCs.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine sichere und effektive Methode zur Erzeugung von iPSCs.
- Der Ansatz verringert das Risiko einer Pathogenität, die mit herkömmlichen Methoden verbunden ist.
- Die erzeugten iPSCs können für verschiedene Anwendungen in der regenerativen Medizin genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Erzeugung von iPSCs aus menschlichen peripheren T-Zellen mithilfe von Sendai-Virus unter kulturbedingten Bedingungen ohne Fütterungszellen behebt zentrale Sicherheits- und Skalierbarkeitsprobleme in der regenerativen Medizin und der Forschung und Entwicklung von Zelltherapien. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung antigenspezifischer, genetisch nachverfolgbarer iPSC-Linien und minimiert gleichzeitig die Exposition gegenüber undefinierten Krankheitserregern und tierischen Bestandteilen. Die Methode unterstützt die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Entwicklung, indem sie eine klinisch relevante, reproduzierbare Zellquelle bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Erzeugung von iPSC-Linien mit einzigartigen TCR-Umlagerungen für Linienverfolgungs- und Antigen-Spezifitätsstudien.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung der Reprogrammierung und Pluripotenz in aus humanen Immunzellen abgeleiteten Systemen.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem störende Variablen durch Fütterungszellen und Serum verringert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht standardisierte, zellfreie iPSC-Kulturen, die für die nachgeschaltete Differenzierung und Substanzscreenings geeignet sind.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays, indem undefinierte, tierisch stammende Bestandteile eliminiert werden.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der Expression von Pluripotenzmarkern zur Qualitätskontrolle.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Erstellung patienten- oder spenderspezifischer iPSC-Linien und unterstützt damit die Krankheitsmodellierung und die Entwicklung von Zelltherapien.
- Unterstützt eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem pathogenitätsbedingte Risiken in präklinischen Modellen minimiert werden.
- Erleichtert translationsorientierte Biomarker-Studien unter Verwendung genetisch markierter iPSC-Ableitungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie eine sichere und skalierbare Generierung von iPSCs aus leicht zugänglichen Blutproben ermöglicht und sowohl mechanistische Untersuchungen als auch translationale Anwendungen unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Reprogrammierungseffizienz und Plastizität von Immunzellen.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare, fütterzellenfreie iPSC-Linien für die Assay-Entwicklung und Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Liefert quantitative Daten zu Pluripotenzmarkern für den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Probenentnahme des Spenders bis hin zur präklinischen Krankheitsmodellierung und Therapieentwicklung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren, standardisierten Protokollablauf zur Erzeugung nachvollziehbarer iPSC-Linien aus peripherem Blut.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in iPSC-basierten Studien.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von iPSC-Generierungsworkflows.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz, indem biologische Risiken in späteren Phasen reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von aus iPSCs abgeleiteten Modellen und Therapien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der T-Zell-Isolierung, -Aktivierung und sterilen Zellkulturtechniken.
- Benötigt Zugang zu Sicherheitsausrüstung der Biosicherheitsstufe für den Umgang mit Sendai-Virusvektoren.
- Verlangt eine standardisierte, auf Teams abgestimmte Kultur unter serumfreien und zellfreien Bedingungen.
- Kann eine Anpassung an verschiedene Spenderquellen oder Krankheitskontexte erfordern.
- Ist abhängig von quantitativer Immunfluoreszenz und Analyse molekularer Marker zur Qualitätskontrolle.
