Name: Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Reprogrammierung humaner peripherer T-Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Sendai-Virus in feeder-freien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht sichere Anwendungen in der regenerativen Medizin.

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Wir bedanken uns bei Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi und Rei Ohno von der Keio University School of Medicine, um technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen R &amp; D Systems Support-Programm, um die praktische Nutzung von Gesundheitsforschungsergebnissen zu beschleunigen, und die Autobahn-Programm für die Realisierung von regenerativen Medizin gefördert.

1. Bereiten Sie aktivierten humanen T-Zellen <ol><li> Sammeln Sie 10 ml heparinisiertes Vollblut von einem Spender durch Venenpunktion. <ol><li> Erhalten informierte Zustimmung der Spender vor der Venenpunktion. Venenpunktion müssen von qualifiziertem und geschultem Personal durchgeführt werden. </li><li> Griff Blutproben mit steriler Ausrüstung und nach entsprechender Biosicherheit Richtlinien. </li></ol></li><li> Verdünnen von 10 ml heparinisiertes Vollblut mit 10 ml D-PBS (-). </li><li> Setzen 15 ml Ficoll-Lösung (Ficoll-Paque PREMIUM) in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Schicht die 20-ml Blutlösung in Schritt 1.2 auf die Ficoll-Lösung in Schritt 1.3 vorbereitet. Mit einem elektrischen Pipette, lassen Sie Blutlösung in Schritt 1.2 laufen langsam entlang der Innenwand der Röhre hergestellt. Achten Sie darauf, das Blut-Lösung und Ficoll Lösung zu mischen. </li><li> Zentrifuge bei 400xg 30 min bei RT. Stellen Sie die Schleuderverzögerungsgeschwindigkeit auf &quot;langsam&quot;. Hinweis: Nach der Zentrifugation eine weiße dünneSchicht entsteht zwischen einer oberen milchig Plasmaschicht und eine untere klare Ficoll-Schicht. Dieser weiße dünne Schicht enthält mononuklearen Zellen. </li><li> Übertragung der mononuklearen Zellschicht in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit einer 1-ml-Pipette. Achten Sie darauf, Ficoll-Lösung enthalten. </li><li> Hinzufügen D-PBS (-) zu den mononuklearen Zellen auf ein Gesamtvolumen von 10 ml und Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen. 10 ml D-PBS (-) zu den mononuklearen Zellen und Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei RT. </li><li> Überstand verwerfen, 1 ml KBM502 Medium, um den gesammelten mononuklearen Zellen, und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Mehr als 5 x 10 6 mononuklearen Zellen aus 10 ml heparinisiertem Vollblut mit angemessene Trennung unter Verwendung von Ficoll gewonnen werden. </li><li> Vorbereitung eines Anti-Mensch CD3-Antikörper-Lösung mit einer Konzentration von 10 ug / ml in D-PBS (-). Fügen Sie den Anti-Mensch-CD3-Antikörper-Lösung zu einer 6-Well-Platte, genießen die BrandungAss jede Vertiefung und inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für mindestens 30 min. </li><li> Entfernen Sie den Anti-Mensch-CD3-Antikörper-Lösung aus jeder Vertiefung und einmal mit D-PBS waschen (-) unmittelbar vor der Aussaat der Zellen. </li><li> Samen mononukleären Zellen, die in Schritt 1,9 bei einer Dichte von 2,5 × 10 5 Zellen / cm 2 an den Anti-Human-CD3-Antikörper-beschichtete Platten mit 6 Vertiefungen in KBM502 Medium hergestellt wurden. Bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 3-7 Tage ohne Mediumwechsel, bis die T-Zellen Konfluenz erreichen. T-Zellen in dieser Zeit sind beide suspendiert und adhärenten Zellen. </li></ol> 2. Infect menschlichen T-Zellen mit SeV Vektoren <ol><li> Nach 3-7 Tagen Kultur, sammeln die aktivierten T-Zellen mit den bestehenden Medium durch Pipettieren. Übertragung auf einen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 1 ml frisches KBM502 Medium. Zählen Sie die Zellen und die Platte 1.5 × 10 6 Zellen (in 2 ml frisches Medium KBM502) in jede Vertiefung eines Anti-CD3-Antikörper-beschichteten 6-Well-Platte. </li><li> Auftauen SEV Lösungen OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF und c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF auf Eis. </li><li> Fügen Sie die SeV Lösungen, die OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF und c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF einzeln in die Vertiefungen, die jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) 10. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator für weitere 24 hr. </li></ol> 3. Entfernen Sie SeV Vektoren von menschlichen T-Zellen <ol><li> 24 Stunden nach der Infektion, sammeln Sie die infizierten Zellen mit einer Pipette. Wenn es anhaftenden Zellen, können sie leicht abgenommen Pipettieren von ihnen mehrmals nach oben und unten ist. Übertragung auf einen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Überstand, der die SeV-Vektoren und 2 ml frischem KBM502 Medium. Ausstrich Zellen in each der Vertiefungen. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator für zusätzliche 24 Std. </li></ol> 4. Reseed Cells auf einem Matrigel Schicht <ol><li> Bereiten Basalmembranmatrix Lösung durch Auftauen Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) bei 4 ° C und Auflösen von 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12-Medium. Hinweis: Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) muss O / N bei 4 ° C aufgetaut, um vollständig aufgetaut werden. Halten Sie es auf Eis, bis kurz vor der Verwendung. </li><li> Platte 5 ml Basalmembranmatrix Lösung pro Schale in 100 mm-Schalen und lassen bei RT für mindestens 30 min vor der Aussaat Zellen. Mindestens zwei 100-mm-Schalen werden für ein Experiment benötigt wird. </li><li> Sammeln SeV-infizierten Zellen durch Pipettieren, Übertragung auf einen 15-ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 1 ml frisches KBM502 Medium. Zählen Sie die Anzahl der cells mit einer Zählkammer, entfernen Sie die Basalmembran-Matrix-Lösung von 100-mm-Schalen in Schritt 4.2 und platte 1 × 10 5 und 1 × 10 6 Zellen (in 10 ml frischem mTeSR mittel) auf einem 100-mm Basalmembranmatrix beschichtet Geschirr. Schließlich verwenden Sie die Platte, in der Kolonien werden leicht aufgenommen. </li><li> Inkubieren der Schale bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator O / N. </li><li> Ändern Sie das Medium auf 10 ml Medium mTeSR Fleisch jeden zweiten Tag. Hinweis: ca. 20-30 Tage nach der Infektion, Kolonien, die sehr ähnlich sind embryonale Stammzellen (ESC) wird angezeigt. </li></ol> 5. Erweitern Sie T-Zellen abgeleiteten iPSCs <ol><li> Bereiten Basalmembranmatrix Lösung durch Auftauen Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) bei 4 ° C und Auflösen von 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12-Medium. </li><li> Platte 1 ml der Basalmembran Matrixlösung pro Well in einer 6-Well-Platte und lassen bei RT für zuminmindestens 30 min vor Kommissionierung Kolonien. </li><li> Füllen Sie einen 96-Loch-Platte mit 20 ul mTeSR Medium pro Vertiefung. </li><li> Wählen Kolonien, die Wirtschafts- und Sozialräte unter dem Stereomikroskop mit einer 20 &amp; mgr; l-Pipette ähneln. Hinweis: Die Kolonien der WSR und iPSCs sind rund und flach, wie in 1B gezeigt. </li><li> Transfer ausgewählten Kolonien in die 96-Lochplatte mit mTeSR Medium in Schritt 5.3 gefüllt. </li><li> Fügen Sie 200 ul mTeSR Medium in jede Vertiefung pipettieren und vorsichtig nach oben und unten, um die Kolonie zu kleinen Klumpen unter dem Stereomikroskop mit einer 200 ul Pipetten brechen. Entfernen Sie die Basalmembran-Matrix-Lösung aus dem gut vorbereitet in 5.2 und legte jede Kolonie in eine Vertiefung der Basalmembran-Matrix beschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml mTeSR Medium pro Vertiefung. </li><li> Ändern Sie den mittleren bis 2 ml mTeSR Medium Fleisch jeden zweiten Tag. </li></ol> 6. Pflegen Sie T-Zellen abgeleiteten iPSCs Die T-Zellen abgeleiteten iPSCs aufrechterhalten werden kannund gespeichert mit den gleichen Techniken wie für den menschlichen iPS-Zellen und menschlichen WSR. Sobald iPSC Kolonien heranwachsen, erweitern sie in größere Gerichte Wiederholung des gleichen Verfahrens. <ol><li> Ändern Sie den mTeSR Medium alle 1-2 Tage. </li><li> Wenn die Kolonien konfluent werden alle 5-7 Tage, Durchgang die Zellen unter Verwendung Dissoziationslösung für den menschlichen iPS-Zellen und menschlichen Wirtschafts- und Sozialräte gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden oder widerstreitende Interessen offen zu legen.

Wir beschreiben ein Protokoll zur Generierung von iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen unter serum- und feederfreien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel, mTeSR-Medium und SeV-Vektoren. Für klinische Anwendungen von iPS-Zellen ist es wichtig, ein Protokoll zur stabilen Erzeugung von iPS-Zellen und eine weniger invasive Methode zur Zellprobenahme zu haben. Obwohl die Erzeugung von iPS-Zellen mit der Kombination von Matrigel und mTeSR-Medium eine geringere Reprogrammierungseffizienz aufwies als die mit Knockout-Serum-Ersatzmedium (KSR) und Feeder-Zellen, erreicht diese Kombination eine stabile Generierung von iPS-Zellen von Spendern16. Eine stabile iPS-Erzeugung und eine weniger invasive Zellprobenahme haben den Vorteil, dass die Anzahl der Spender für die iPS-Erzeugung erhöht werden kann. 
SeV-Vektoren, ein Minusstrang-RNA-Virus, ist nicht in das Wirtsgenom integriert. Daher können die Risiken der Tumorgenese im Schritt der Induktion des Reprogrammierungsfaktors20-24 vermieden werden. Darüber hinaus ermöglichen die feederfreien Bedingungen, bei denen eine Kombination aus definiertem Kulturmedium und Matrigel anstelle einer Feederschicht verwendet wird, die potenziellen Risiken einer Exposition gegenüber unbekannten exogenen Faktoren. Die Fusion dieser Techniken bietet eine weniger invasive und sicherere iPS-Technologie für die regenerative Medizin16.
Wichtige Schritte in diesem Protokoll sind der Schritt der Aktivierung menschlicher T-Zellen (Schritt 1) und der Infektion mit SeV-Vektoren (Schritt 2). Wenn zu einem optimalen Zeitpunkt nach der SeV-Infektion keine ESC-ähnliche Kolonie in der Kulturschale erhalten wird, sollte Folgendes in Betracht gezogen werden. Erstens ist die Konfluenz der mononukleären Zellen vor der T-Zell-Aktivierung möglicherweise nicht geeignet, da eine optimale Aktivierung der T-Zellen für die SeV-Infektion entscheidend ist25,26. Eine zu hohe Dichte an mononukleären Zellen führt zum Zelltod, was die ordnungsgemäße Aktivierung der T-Zellen beeinträchtigt. Eine zu geringe Dichte von mononukleären Zellen stört auch die ordnungsgemäße Aktivierung und Proliferation von T-Zellen. Daher sollte die Konfluenz von mononukleären Zellen überprüft und entsprechend angepasst werden. Zweitens ist die Dosierung von SeV-Vektoren möglicherweise nicht ausreichend. Die Induktionseffizienz von iPS-Kolonien hängt von der Dosierung des Virusab 6. Wenn nach SeV-Infektion keine ESC-ähnliche Kolonie beobachtet wird, sollte die Option einer Erhöhung der Virusdosis bis zu einem MOI von 15-20 in Betracht gezogen werden. Wenn Anzeichen einer Differenzierung der iPS-Kolonie beobachtet werden, kann die Häufigkeit, mit der das Medium gewechselt wird, bis zu jedem zweiten Tag oder auf jeden Tag, wenn die Kolonien größer sind, erhöht werden. 
Die Einschränkung in diesem Protokoll besteht darin, dass diese Methode nicht virenfrei ist. Obwohl SeV für die Zellreprogrammierung problemlos im Handel erhältlich ist, müssen die Benutzer die Geräte entsprechend dem entsprechenden Biosicherheitsniveau vorbereiten. Als weitere Methode zur Erzeugung integrationsfreier iPSCs wurden bisher episomale Vektoren verwendet27-29. Obwohl episomale Vektoren mit Geräten mit einem geringeren Maß an biologischer Sicherheit verwendet werden können, können episomale Vektoren mit extrem geringen Raten in das Wirtsgenom eindringen. Daher sind zusätzliche Kontrollen erforderlich, um das Verschwinden von Transgenen zu bestätigen, wie bei der Anwendung von SeV.
Es gibt eine weitere Einschränkung darin, dass diese Technik nicht völlig frei von tierischen Produkten ist. Einige Substrate, wie z. B. Matrigel, Anti-CD3-mAb, Dissoziationslösung und SeV-Lösung, werden aus tierischen Produkten gewonnen und sind daher mit einem Risiko der Übertragung xenogener Krankheitserreger verbunden. Die Reduktion von tierischen Substraten im Kultursystem ist jedoch aufgrund des geringeren Risikos für die klinische Anwendung der iPSC-Technologie sinnvoll.

iPSCs haben beträchtliche Aufmerksamkeit als eine bahnbrechende Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1-3 angezogen. Bisher wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung iPSCs wurde berichtet 4,5. Unter diesen haben iPSCs von menschlichen T-Zellen erzeugt von besonderem Interesse wegen der weniger invasiven Verfahren des Zellprobenahme 6-8 gewesen. Zusätzlich iPSCs von T-Zellen abgeleitet sind Neuanordnungen der T-Zell-Rezeptor (TCR) Gen und sind daher eine Quelle von Antigen-spezifischen T-Zellen 9,10. Daher Erzeugung T-Zell-abgeleiteten iPSCs sicher ist nützlich zur fortschreitenden regenerativen Medizin. Dieses Verfahren basiert auf dem Konzept der Verringerung der Gefahr von unvorhersehbaren Pathogenität basiert. Zum sicheren klinischen Anwendung iPSCs ist es wichtig, um das Risiko der Exposition gegenüber Pathogenen 11 zu reduzieren. Zuvor in vielen Kultursystemen pluripotenter Stammzellen haben fötalem Rinderserum und Feeder-Zellen als wesentliche Reagenzien verwendetS12. Jedoch ist die Entfernung dieser beiden Reagenzien aus dem Kultursystem bevorzugt iPSC Generation, das Risiko von unvorhersehbaren Pathogenität zu reduzieren. Zusätzlich hat dieses Verfahren den Vorteil, daß eine invasive Zellprobenahme von Patienten und mühsame Herstellung von feeder-Zellen. Da T-Zell-abgeleiteten iPSCs wurden bereits erfolgreich in Forschungs 13,14 verwendet wurde, ist dieses Verfahren ebenfalls anwendbar und nützlich für die Erzeugung krankheitsspezifische iPSCs von Patienten. Unter T Reprogrammierung Verfahren unter Verwendung des Sendai-Virus (SeV) Vektor als ein Gen Fahrzeug ist ein Verfahren, das mit hoher Effizienz iPSCs 7,16 generieren kann. Darüber hinaus, da SeV ist ein Einzelstrang-RNA-Virus und keine DNA-Phase für die Replikation benötigen, die Nutzung im iPSC Generation vermeidet das Brechen des Wirtsgenom 17-19. Daher haben wir Protokolle zur Erzeugung iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in serum fr festee und Feeder-freien Bedingungen mit einer Kombination von Matrigel mTeSR Medium und SeV Vektoren.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>Aufgereinigte NA/LE-Maus Anti-Human-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>555336</td><td></td></tr><tr><td>Rinderalbuminfraktion V-Lösung</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Medium Kit</td><td>STEM CELL</td><td>5850</td><td>Vor Gebrauch bei Raumtemperatur erwärmen</td></tr><tr><td>Dissoziationslösung</td><td>ReproCELL</td><td>RCHETP002</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(&ndash;)</td><td>Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>SeV-Vektorkit CytoTune-iPS ver.1.0</td><td>DNAVEC</td><td>DV-0303c</td><td>Vor Gebrauch auf Eis auftauen</td></tr><tr><td>100-mm-Gewebekulturschale Falcon</td><td></td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>15&#160; ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50&#160; ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von induzierten pluripotenten stammzellen aus menschlichen peripheren t-zellen mit sendai virus in feeder-freien bedingungen

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Vor kurzem haben iPSCs Aufmerksamkeit als neue Quelle von Zellen für regenerative Therapien angezogen. Obwohl die ursprüngliche Verfahren zum Erzeugen iPSCs angeführten dermalen Fibroblasten durch invasive Biopsie und retrovirale genomische Insertion von Transgenen erhalten wird, hat es viele Bemühungen, diese Nachteile zu vermeiden. Menschliche periphere T-Zellen sind eine einzigartige Zellquelle zur Erzeugung von iPS-Zellen. iPSCs aus T-Zellen abgeleitet sind Neuanordnungen der T-Zell-Rezeptor (TCR) Gene und sind eine Quelle von Antigen-spezifischen T-Zellen. Zusätzlich haben die T-Zell-Rezeptor-Umlagerung in das Genom hat das Potential, einzelnen Zelllinien zu markieren und eine Unterscheidung zwischen transplantierten und Spenderzellen. Zum sicheren klinischen Anwendung iPSCs, ist es wichtig, um die Gefahr des Freilegens neu erzeugten iPSCs schädliche Mittel zu minimieren. Obwohl fötalem Rinderserum und Feeder-Zellen wurden wesentlich für pluripotente Stammzellen in Kultur ist es bevorzugt, sie aus dem Kultursystem zu entfernen, um das Risiko zu verringernunvorhersehbarer Pathogenität. Zur Lösung dieses Problems haben wir ein Protokoll zur Erzeugung iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus, um das Risiko der Freigabe iPSCs undefinierte Pathogene reduzieren etabliert. Obwohl Umgang mit Sendai-Virus erfordert Geräte mit der entsprechenden Sicherheitsstufe, aktiviert Sendai Virus infiziert T-Zellen ohne Genom Insertion, noch mit hohem Wirkungsgrad. In diesem Protokoll zeigen wir die Erzeugung von iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in Feeder freien Bedingungen mit einer Kombination von aktivierten T-Zellkultur und Sendai-Virus.

<html> Unter Verwendung dieses Protokolls können Benutzer iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in stabiler Weise zu erzeugen. iPSC Erzeugung von T-Zellen mit SeV und Matrigel zeigte etwa 0,002%. - 0,005% der Effizienz der Reprogrammierung zwischen mehreren Geber Fälle und SeV wurden nach mehreren Passagen nicht erkannt 16 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll zur Erzeugung von T-Zellen abgeleiteten iPSCs in Feeder freien Bedingungen unter Verwendung von Matrigel und mTeSR Medium. Ca. 20-30 Tage nach Infektion mit SeV werden iPSC Kolonien von ihren ESC-Kolonie-Morphologie (Abbildung 1B) anerkannt. Immunfluoreszenzfärbung zeigte die Expression von typischen pluripotenten Zellmarker (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81) in T-Zell-abgeleitete iPSCs erzeugt unter Zuführung freien Bedingungen (Abbildung 1c). &quot;Breite =&quot; 700 &quot;/&gt; Figur 1 (A): Ein Schema des Protokolls für eine Neuprogrammierung T-Zellen unter Zuführung freien Bedingungen in dieser Studie. (B): Eine typische ESC-ähnliche iPSC Kolonie an Tag 27 nach der Blutentnahme unter Zuführung freien Bedingungen. (C): ALP-Färbung und Immunfluoreszenzfärbung für Pluripotenz und Oberflächenmarker (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81) in T-Zell-abgeleitete iPSCs erzeugt unter Zuführung freien Bedingungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53225/53225fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, induzierte pluripotente Stammzellen oder IPCs aus menschlichen peripheren T-Zellen unter konservierungsfreien Bedingungen zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise wie IPS-Zellen klinisch eingesetzt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass IPS-Zellen hergestellt werden können, ohne möglicherweise schädliche Faktoren einzubeziehen, wodurch das Risiko einer Pathogenität verringert wird.Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich weltweit auf klinisch relevante, auf IPS-Zellen basierende Therapien, da diese invasive Zellentnahme das Risiko verringert, die entstehenden IPS-Zellen undefinierten Krankheitserregern auszusetzen. Diese Methode kann daher Einblicke in die klinische Therapie mit IPS-Zellen ermöglichen. Zudem kann sie auf andere Bereiche wie die Modellierung von Krankheitszuständen angewendet werden.Beginnen Sie mit der Herstellung aktivierter humaner T-Zellen, indem Sie 10 Milliliter heparinisiertes Vollblut mit 10 Milliliter DPBS verdünnen. Pipettieren Sie 15 Milliliter Folsäurelösung in ein 50-Milliliter-Konischglas. Pipettieren Sie die verdünnte Blutprobe langsam entlang der Innenwand des Gefäßes, um sie vorsichtig auf die Lösung aufzuschichten.Stören Sie vorsichtig nicht die Grenzfläche. Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 400 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation beobachten Sie drei Schichten, darunter eine untere klare Schicht, eine dünne weiße Schicht, die mononukleäre Zellen enthält, und eine obere milchige Plasmaschicht. Überführen Sie die mononukleäre Zellschicht in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen, ohne Lösung mit Sediment zu übertragen. Geben Sie anschließend DPBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter aufzufüllen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter DPBS, zentrifugieren Sie das Gefäß bei 200 × g für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie anschließend ein Milliliter KBM 5 0 2 Medium zu den Zellen und zählen Sie diese mithilfe eines Hämozytometers, um die Zellkulturplatte vorzubereiten. Beschichten Sie die Vertiefungen einer sechs-well-Platte mit einer Lösung aus 10 Mikrogramm pro Milliliter anti-humanem CD3-Antikörper in PBS. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für mindestens 30 Minuten.Nach der Inkubation die Antikörperlösung von der Platte entfernen, achtmal mit PBS waschen und die mononukleären Zellen mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Quadratzentimeter in einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern KBM 502-Medium in die beschichteten Sechs-Well-Platten aussäen. Die Zellen drei bis sieben Tage lang ohne Mediumwechsel inkubieren, wobei die T-Zellen nach drei bis sieben Tagen konfluent sein sollten. Die aktivierten T-Zellen zusammen mit dem Medium in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen und fünf Minuten bei 200 × g zentrifugieren. Das Überstand (SNAT) entfernen und ein Milliliter frisches KBM 502-Medium hinzufügen.Zählen Sie die Zellen und geben Sie 1,5 × 10⁶ Zellen in zwei Milliliter KBM 502-Medium je Vertiefung einer anti-CD3-Antikörper-beschichteten 6-Loch-Platte an. Danach tauen Sie die OC3-SOX2-, KLF4- und c-MYC- sowie L-sendi-virale Lösung jeweils auf Eis auf und geben jeden modifizierten Sendai-Virus einzeln mit einer Multiplikation der Infektion von 10 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie für 24 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Sammeln Sie anschließend die infizierten Zellen mit einer Pipette und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Konikalröhrchen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie zwei Milliliter frisches KBM 5 0 2 Medium hinzu. Bringen Sie die Zellen in die Vertiefungen einer Sechs-Vertiefungs-Platte zurück und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator.Um die Zellen zurückzubringen, zunächst die Basalmembran-Matrixlösung bei vier Grad Celsius über Nacht auftauen lassen, 0,2 Milliliter der gedachten Lösung in 10 Milliliter DMM F 12 Medium auflösen und fünf Milliliter der Basalmembran-Matrixlösung in 100-Millimeter-Schalen pipettieren. Die Schalen mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit die Matrix die Schale beschichten kann, bevor die Zellen ausgesät werden. In der Zwischenzeit die mit SAI-Virus infizierten T-Zellen in einem 15-Milliliter-Kegelrohr sammeln und bei 200 × g fünf Minuten lang zentrifugieren.Suspenderen Sie anschließend das Gewebe in einem Milliliter frischem KBM 5 0 2 Medium und zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers nach der 30-minütigen Inkubationsphase. Entfernen Sie die Lösung der Basalmembran-Matrix von den beiden Platten und suspendieren Sie jeweils eine mal 10 hoch 5 Zellen sowie separat eine mal 10 hoch 6 Zellen in 10 Milliliter frischem M-T-E-S-R Medium, einem kulturbedingten Medium ohne Fütterungszellen für ipsc. Pipettieren Sie jede Zellsuspension auf eine separate 100-Millimeter-Platte.Die Platte im Zellkulturtrockenschrank inkubieren. Das Medium alle zwei Tage wechseln, nach 20 bis 30 Tagen sollten Kolonien erscheinen, die embryonalen Stammzellkolonien ähneln.Bereiten Sie sechs Wandplatten für die IPSC-Expansion vor, indem Sie je ein Milliliter Lösung der Basalmembran-Matrix pro Vertiefung 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit betrachten Sie Kulturplatten mit IPSC-Kolonien unter einem Stereomikroskop und isolieren einzelne Kolonien, indem Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette abstreifen. Überführen Sie jede Kolonie in eine Vertiefung einer 96-Wand-Platte, die 20 Mikroliter M-T-E-S-R-Medium enthält.Nach dem Übertragen der Kolonien 200 Mikroliter M-T-E-S-R-Medium in jede Vertiefung geben und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Kolonie zu lösen. Nach dem Entfernen der Basalmembran-Matrix-Lösung aus den Sechs-Well-Platten die Zellen einer einzelnen Kolonie in jede Vertiefung überführen, dann zwei Milliliter M-T-E-S-R-Medium hinzufügen, die Zellen in einem Zellkulturinkubator inkubieren und das Medium im Wechsel alle zwei Tage wechseln. Die Kultur erfolgte ohne Futterzellen und in serumfreiem Medium. ips-Zellen wurden aus humanen peripheren T-Zellen erzeugt. Die immunfluoreszenzgefärbte Analyse zeigte die Expression typischer pluripotenter Zellmarker, darunter Nanog, T, Sox2, SSEA-4, TRA-1-60 und TRA-1-81.In diesen abgeleiteten IPSE-Linien. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Schritte unter Berücksichtigung der entscheidenden Sterilitäts- und Biosicherheitsaspekte durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Dieses Video zeigt die Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) in induzierte neurale Stammzellen (iNSCs) unter Verwendung des Sendai-Virus. Das Sendai-Virus ist ein nicht-integrierendes Virus, das ein effizientes und sicheres Vehikel für die Reprogrammierung von Zellen bietet.

Generierung von induzierten neuralen Stammzellen (iNSCs) aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs): Ein auf dem Sendai-Virus basierendes Verfahren zur Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Protokoll für die Reprogrammierung von Melanomtumor-infiltrierenden Lymphozyten in induzierte pluripotente Stammzellen zu zeigen.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Erfahren Sie die Reprogrammierung humaner peripherer T-Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels Sendai-Virus in feeder-freien Bedingungen. Diese Methode ermöglicht sichere Anwendungen in der regenerativen Medizin.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen (Video) | JoVE Journal

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

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