Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

Beginnen Sie mit einer fluoreszenzkompatiblen Multiwell-Platte, die eine Suspension von transgenen T-Lymphozyten aus der Maus enthält.

Diese Lymphozyten enthalten ein grün fluoreszierendes Protein oder eine GFP-Expressionskassette, die durch die Bindung von T-Zell-Rezeptoren oder TCRs an immunmodulatorische Verbindungen gesteuert wird.

Behandeln Sie jede Vertiefung mit einer Lösung, die immunmodulatorische Verbindungen mit unterschiedlichem Potenzial enthält.

Während der Inkubation interagieren immunmodulatorische Verbindungen mit TCRs auf T-Lymphozyten.

Die TCR-Interaktion mit einer stimulierenden Substanz löst die Aktivierung der Genkassette aus und erhöht die GFP-Expression.

Im Gegensatz dazu hemmt die TCR-Interaktion mit einer inhibitorischen Verbindung die Genkassette und reduziert die GFP-Expression.

Als nächstes überlagern Sie die Zellen mit Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff, um die Zellkerne zu färben.

Zentrifugieren Sie die Platte, um die Zellen für eine genaue Fluoreszenzmessung abzusetzen.

Unter dem Fluoreszenzmikroskop zeigen lebensfähige T-Lymphozyten zwei Fluoreszenzsignale, die Zellkernen und grün fluoreszierenden Proteinen entsprechen.

Die verstärkte grüne Fluoreszenz bedeutet eine erfolgreiche Stimulation der T-Lymphozyten, während ein schwaches intrazelluläres grünes Fluoreszenzsignal die hemmende Wirkung immunmodulatorischer Verbindungen auf T-Lymphozyten bestätigt.

Für das niedermolekulare Hochdurchsatz-Screening werden 40 Mikroliter Zellen pro Vertiefung in eine 384-Well-Platte eingefüllt und die entsprechenden Vertiefungen mit dem Medikament oder Vehikel der Wahl für die gewünschte Behandlungsdauer im Zellkultur-Inkubator behandelt.

30 Minuten vor der GFP-Analyse die Zellen mit der entsprechenden Konzentration der Hoechst-Lösung färben und den Fleck durch schonendes Pipettieren gründlich verteilen. Wenn alle Vertiefungen gefärbt sind, zentrifugieren Sie die Platten, um die Zellen am Boden der Vertiefungen zu sammeln, und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen.

Laden Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie dann das Ziel auf das 40-fache oder höher ein. Stellen Sie die Kameranummer 4 für die UV-Lampe und dann die Kameranummer 1 für den Laser 488 ein. Legen Sie die Platte in das High-Content-Siebsystem ein. Stellen Sie als Nächstes das automatisierte konfokale High-Content-Screening-System so ein, dass es 6 bis 10 Felder pro Vertiefung abliest, mit zwei sequenziellen Messwerten pro Feld bei 488 Nanometern und UV-Licht.