Identifizierung von Protein-Komplexen in Escherichia coli Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Ziel dieses Experiments ist es, Proteine, Proteininteraktionen und die Zusammensetzung der Untereinheiten von nativen MultiPro-Komplexen aus E-coli zu identifizieren. Dies wird durch die Amplifikation der sequenzspezifischen linearen PCR-Produkte erreicht, wobei der SPA-Tag und ein selektierbarer Marker kodiert werden, die integriert und im Rahmen als Carboxy-terminale Fusionen in einem ddy 3, 3 0-Hintergrund unter Verwendung von Bakterien exprimiert werden. Das Fage-Lambda-Rekombinationssystem als zweiter Schritt wird eine zweistufige Aufreinigung unter Verwendung von Kuh-Modlin und Anti-Flag-Affinitätskügelchen durchgeführt, um Proteinkomplexe mit geringer Abundanz effizient zu gewinnen. Als nächstes werden die gebundenen Proteine, die mit Kuhmodlin, Elutionspuffer oder CEB angedeutet sind, mit Trypsin verdaut und mit Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung verarbeitet.

Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die verschiedenen Untereinheiten des Kern-RNA-Polymerase-Enzyms, einschließlich der Transkriptionsterminierung, Anti-Determinationsfaktoren, effizient mit dem getaggten RNA-Polymerase-Untereinheit D-Protein gereinigt werden, was darauf hindeutet, dass die neu assoziierten Komponenten mit diesem Ansatz effizient aufgedeckt werden können. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit zwei runden Affinitätsreinigungen haben, bei denen eine sorgfältige Verarbeitung der Zelllysate mit geeigneten Pufferlösungen absolut notwendig ist, um den Erfolg bei der effizienten Rückgewinnung von Komplexen mit niedriger und hoher Abundanz aus Großkulturen zu gewährleisten. Die Affinitätsreinigungs- und Massenspektrometrieverfahren werden von Olga Kagan und HBO guo, zwei Technikern in meinem Labor, demonstriert. Dieses Protokoll beginnt mit der Ausrichtung spezifischer amplifizierter Sequenzen auf den DDY-Stamm drei 30, in dem die Lambda-Rot-Rekombinationsmaschinerie exprimiert wird, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Als nächstes, wo die Bakterien das Lambda-Rekombinationssystem fargen, indem sie den Stamm über Nacht in zwei Millilitern Luria bati oder LB-Medium bei 32 Grad Celsius exprimieren und am folgenden Tag bei 180 U/min schütteln, inokulieren sie einen Milliliter der Übernachtkultur in 70 Milliliter frisches LB-Medium in einem 500-Milliliter-Konuskolben. Züchten Sie das Inokulum bei 32 Grad Celsius, indem Sie es bei 180 U/min schütteln, bis der OD 600 etwa 0,8 erreicht. Induzieren Sie die Zellen, indem Sie den Kolben in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius inkubieren, indem Sie ihn 15 Minuten lang bei 180 U/min leicht schütteln.

Unmittelbar nach der Induktion den Kolben in einem Eiswasser-Schlammbad für mindestens 30 Minuten unter Schütteln inkubieren. Nach der Ernte und dem Waschen der Zellen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben, suspendiert Reese das Zellpellet in 700 Mikrolitern Eis, kaltem, sterilem Wasser, was durch Elektroporation zu elektrokompetenten Zellen führt. Geben Sie einen Mikroliter des gereinigten Amplikons in 40 Mikroliter der elektrokompetenten Zellen.

Die Zellen werden nach homologen Rekombination und Integration elektroporiert. Die Transformanten, die die Tag-Slash-Kassette erfolgreich in das Chromosom rekombiniert haben, werden auf der Grundlage der Resistenz gegen kann Mycin mehrere Transformatoren für Western Blotting auswählen, um die korrekte Erzeugung der SPA-markierten Fusionsproteine mit Anti-Flag M zwei Antikörpern zu überprüfen, die selektiv gegen die Flaggen-Epitope des SPA-Tags sind. Übertragen Sie 10 Milliliter der Nachtkultur in 990 Milliliter frische TB. Ergänzt mit 25 Mikrogramm pro Milliliter Dose Mycin in einem Vier-Liter-Kolben.

Züchten Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 250 U/min für fünf bis sechs Stunden, bis der OD 600 zwischen zwei und drei erreicht. Übertragen Sie die Ein-Liter-E-Coli-SPA-Tag-Kultur auf saubere Zentrifugationsflaschen und drehen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 3.993 Mal G. Nach der Reanimation Suspendieren der Zellen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Übertragen Sie die Proben zur Beschallung in einen sterilen Edelstahlbecher, der auf Eis gestellt wird. Tauchen Sie die Sonde in die Probe ein und beschallen Sie sie drei Minuten lang. Lassen Sie die Probe nach der Beschallung weitere zwei Minuten vor Überhitzung nach der Zentrifugation des Ultraschalllysats abkühlen.

Den S-Überstand vorsichtig aus dem Zentrifugationsröhrchen in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen aus Polypropylen umfüllen. Frieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie den beschallten gefrorenen Zellextrakt für einen Zeitraum von maximal sechs Monaten bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Um mit der Affinitätsreinigung für den gefrorenen beschallten Zellextrakt zu beginnen, indem Sie das Röhrchen in kaltes Wasser legen, inkubieren Sie den TH-Zellextrakt mit drei Mikrolitern Benzo, einer Nuklease für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Zu dieser Mischung fügen Sie das nichtionische Reinigungsmittel Triton X 100 und 200 Mikroliter Suspensionen von Anti-Flag M zwei Agro-Kügelchen hinzu. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie das Röhrchen nach dreistündiger Drehung drei Stunden lang bei vier Grad Celsius drehen und das Röhrchen sechs Minuten lang bei 1.700 G zentrifugieren. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig so viel wie möglich vom Fett, ohne das Granulat mit loser Geschwindigkeit zu stören.

Suspendieren Sie das Pellet erneut in der verbleibenden SNA und geben Sie es dann in eine Polypropylen-Vorbereitungssäule. Entfernen Sie die unteren Auslassstopfen der Säule, damit das Eluat durch die Schwerkraft abfließen kann. Fluss. Als nächstes waschen Sie die Säule fünfmal mit 200 Mikrolitern eines mal FC-Puffers und fahren Sie mit Cleve mit TEV fort, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Das Dekolleté sowohl am oberen als auch am unteren Rand der Säule schnell anrichten. Mischen Sie den Inhalt in der Säule vorsichtig, indem Sie ihn nach der Drehung über Nacht über Nacht bei vier Grad Celsius drehen. Lassen Sie das Eluat ab, indem Sie die obere Kappe und den unteren Stopfen in die neue Säule entfernen.

Waschen Sie die alte Säule mit 400 Mikrolitern eines x cal Modlin Bindepuffers und 150 Mikroliter Suspension Cal Modlin Bindeperlen. Eluieren Sie das gebundene Protein in vier Fraktionen zu je 50 Mikrolitern in einem frischen Eend-Orph-Röhrchen. Mit einem x cal Modlin Elutionspuffer.

Verteilen Sie die eluierte Fraktion auf zwei saubere Eend-Orph-Röhrchen in gleichen Volumina. Trocknen Sie dann den Inhalt beider Röhrchen mit einem Geschwindigkeitsvakuum ab. Das getrocknete Eluat aus einem Röhrchen wird zum Laufen eines Silberfärbegels verwendet, wie im Text beschrieben, während das andere bei minus 80 Grad Celsius gelagert wird.

Für die zukünftige Verwendung in der Massenspektrometrie geben Sie 50 Mikroliter des Aufschlusspuffers und 0,9 Mikroliter 100 Millimolare Trisphosphin-Salzsäure hinzu Inkubieren Sie die Mischung für den Reduktionsschritt 45 Minuten lang bei Raumtemperatur Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter des 500 Millimolar IDO-Acetamid hinzu und inkubieren Sie weitere 40 Minuten im Dunkeln. Um eine Alkylierung der Probe zu ermöglichen: Nach der zweiten Inkubationsrunde wird ein Mikrogramm Trips in die Mischung gegeben. Inkubieren Sie die Probe entweder fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius oder nach der Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.

Achten Sie darauf, die Reaktion zu stoppen, indem Sie einen Mikroliter Essigsäure hinzufügen. Bereiten Sie dann die Millipore-Zip-Spitze vor, die Pipettenspitze wie im Text beschrieben, um eine effiziente Bindung des Peptids an die Spitze des Rohrpeps zu gewährleisten. Mischen Sie die Peptidmischung 20 Mal, waschen Sie die Peptidmischung, die sie bis zur Spitze gemacht hat, ab, indem Sie die Waschlösung ansaugen und abgeben.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um eine effiziente Bindung des Peptidgemisches an die Spitze mit der Spitze mit dem gebundenen Peptid zu erzielen. 10 Mikroliter der Benetzungs- und Äquilibrierungslösung aspirieren und in ein sauberes Eend-Orph-Röhrchen geben. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

Nach dem Trocknen der eluierten Proben im Schnellvakuum können die Proben sofort massenspektrometrisch analysiert oder vor der Verwendung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Die in diesem Verfahren verwendeten Mikrosäulen sind mit etwa 10 Zentimetern drei Mikrometer Mond-C18-Harz gefüllt und mit einer Pro-Zion-Nano-Elektrospray-Ionenquelle verbunden, die in einer Linie mit dem Orbitrap-Instrument platziert ist. Eine pro Zion Nano-Flow-Binär-HPLC-Pumpe wird verwendet, um während der Peptidtrennungen eine stabile Spitzenflussrate von ca. 300 Nanolitern pro Minute zu liefern, um eine Peptidverdünnung zu erreichen und einen organischen Puffergradienten entsprechend der Probenkomplexität einzurichten.

Für diese E-coli-SPA-Probe enthält das Lösungsmittel A der mobilen Phase 95 % HPLC-Gradientenwasser und 5 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure, während Lösungsmittel B 5 % HPLC-Gradientenwasser und 95 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure enthält, nachdem die Massenspektrometrie die Spektren mit einem Datenbanksuchalgorithmus wie Seaquest gegen eine Datenbank mit E-Coli-Proteinsequenzen durchsucht hat. Statistisches Filtern des Ergebnisses unter Verwendung eines Wahrscheinlichkeitsalgorithmus wie Star Quest, um eine niedrige Falschentdeckungsrate zu gewährleisten, wobei sowohl der SPA-getaggte RNA-Polymerase-Sigma-Faktor als auch das Yak-LA-Protein unbekannter Funktion spezifisch mit dem Kern-RNA-Polymerase-Enzym einschließlich Alpha-Beta- und Beta-Prime-Untereinheiten sowie dem RNA-Polymerase-Recyclingfaktor gereinigt werden. Im Gegensatz zur getaggten RNA-Polymerase bindet der Sigma-Faktor Yak L zusätzlich an einen essentiellen Anti-Determinationsfaktor, was auf eine spezialisierte Funktion in der Transkription hindeutet.

Mehrere andere kleinere co-reinigende Proteine wurden ebenfalls durch LCMS nachgewiesen, die auf dem Gel nicht sichtbar waren, einschließlich der RNA-Polymerase-Omega-Untereinheit und der Transkriptions-, Terminations- und Bestimmungsfaktoren sowie USA und NUSD. Umgekehrt wurden in einem unabhängigen Experiment mit dem Titel Mobilisierung von Schwefelmaschinen S-U-F-B-S-U-F-C und SUFD miteinander gereinigt, was auf eine gemeinsame Beteiligung an der Eisen-Schwefel-Cluster-Biosynthese als einzelner Gerüstkomplex hinweist. Dieses repräsentative Beispiel unterstreicht die Tatsache, dass bisher gut untersuchte, hoch annotierte bakterielle MultiPro-Komplexe, die an essentiellen biologischen Prozessen beteiligt sind, oft neuartige assoziierte Komponenten aufweisen, die effizient identifiziert werden können.

Bei diesem Ansatz könnte die niedrige Kopienzahl des SUFB-Proteins zu einer schwachen Signalintensität im Vergleich zu der starken Intensität geführt haben, die in den SUFC- und SUFD-Pulldown-Experimenten zur Definition der Zusammensetzung stabiler Multi-Unit-Proteinkomplexe beobachtet wurde. Beziehungen zwischen Köderködern und Beute. Anschließend werden Graph-Clustering-Verfahren wie der Markoff-Clustering-Algorithmus verwendet. Diskrete Proteincluster werden aus dem partitionierten probabilistischen PPI-Netzwerk identifiziert.

Mutmaßliche Interaktionsnetzwerke können mit Cyto Scape visualisiert werden. Die Kombination von Proteomik-Daten mit zusätzlichen funktionellen Assoziationsbeweisen, die durch genomische Methoden abgeleitet werden, kann verwendet werden, um neue mechanistische Rollen von zuvor annotierten E-Coli-Proteinen zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden Subnetze von Proteinkomplexen und funktionellen Modulen definiert, die als breitere funktionelle Nachbarschaften in e coli beteiligt sind.

Der hierarchische Hauptcluster Graham zeigt die Muster der funktionellen Vorhersagen und vorhandenen Annotationen für die funktionell verwaisten und charakterisierten Gene von e coli, wobei die gelben und blauen Farben bestehende bzw. abgeleitete Funktionen repräsentieren, während die Schattierungsintensitäten die Konfidenzwerte widerspiegeln. Biologische Prozesse, die mit verschiedenen Nachbarschaften verbunden sind, sind auf der rechten Seite angedeutet: Einschübe zeigen die einzelnen Komponenten einer repräsentativen Nachbarschaft basierend auf den Ähnlichkeitswerten des integrierten physikalischen und funktionellen Interaktionsnetzwerks. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie stabile Proteinkomplexe aus estia Coli mit Hilfe der Affinitätsreinigung in Verbindung mit dem massenspektrometrischen Ansatz isoliert werden können.

Prinzipiell kann diese Technik angewendet werden, um Membranproteinkomplexe oder Proteinkomplexe von anderen Spezies zu charakterisieren, damit sie so gut wie möglich rekombinieren können.