Name: Identifizierung von Protein-Komplexen in Escherichia coli Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Lernen Sie die sequentielle Peptid-Affinitätsreinigung mit Tandem-Massenspektrometrie zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung selbst niedrig abundanter Proteinkomplexe.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem kanadischen Stiftung für Innovation, Genome Canada, Ontario Genomics Institute, Ontario Ministerium für Innovation, und der kanadischen Institutes of Health Research Stipendium JG und AE The Red-exprimierenden E. unterstützt coli-Stamm DY330 war eine Art Geschenk von Donald L. Court (National Cancer Institute, Frederick, MD).

Ein. Bau von Gen-spezifische SPA-Tagging in E. coli DY330 Stamm <ol><li> Das Plasmid pJL148 umfassend den SPA-tag-DNA-Sequenz und die Kanamycin Antibiotikaresistenzmarker Kassette (Kan R) als Matrize in der Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation 7 verwendet. A 45 nt genspezifischen Vorwärtsprimer, unmittelbar stromaufwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5&#39;-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3 &#39;) tag spezifischen Vorwärtsprimer befindet, und eine 45 nt genspezifischen Rückwärtsprimer, der unmittelbar stromabwärts des Zielgens Stoppcodon im Leserahmen mit einem 27 bp (5&#39;-GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3 &#39;) tag spezifischen Rückwärtsprimer, werden verwendet, um den SPA-tag und Kan ® Kassette aus dem pJL148 mit nachfolgenden PCR amplifizieren Zyklusbedingungen: 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 94 ° C für 1 min, 55 ° C für 1 min, 68 ° C für 2 Min. 10 Sek., um 68 ° C für 10 min folgte. Diese verstärkten Sequenzen dienen as Substrate für die ektopisch eingeführt λ-Rot-Rekombination homologer Maschinen (siehe unten). </li><li> Das PCR-Produkt wird unter Verwendung einer QIAquick-PCR, um Salze, die mit der Elektroporation stören können, zu entfernen. Das gereinigte PCR-Produkt wird anschließend zur gezielten am 3&#39;-Ende (unmittelbar stromaufwärts des nativen Stopcodon) eines spezifischen Gens in DY330 Stamm, in dem der λ-Rot-Rekombination Maschinen 10 exprimiert wird integrieren. </li><li> Die DY330 λ-Red exprimierenden Stamm wird über Nacht in 2 ml Luria-Bertani (LB)-Medium bei 32 ° C gewachsen durch Schütteln bei 180 UpM. 1 ml der Übernacht-Kultur wird anschliessend in 70 ml frischem LB-Medium in 500 ml Erlenmeyerkolben inokuliert. Das Inokulum wird bei 32 ° C durch Schütteln bei 180 rpm, bis die OD 600 erreicht ~ 0,8 gewachsen. </li><li> Die Kultur wird in einem frischen 250 ml Erlenmeyerkolben, wo die Zellen durch Inkubation der Kolben im Wasserbad auf 42 ° C durch vorsichtiges Schütteln bei induziert übertragen180 rpm für 15 min. Unmittelbar nach der Induktion wird die Flasche in einem Eiswasser-Bad Aufschlämmung für mindestens 30 min unter Schütteln inkubiert. </li><li> Das eiskalte Kultur wird sofort in vorgekühlte 50 ml Polypropylen-Röhrchen transferiert und einer Zentrifugation bei 3993 × g für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet wird in 50 ml eiskaltem sterilen Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert bei 3993 xg für 6 Minuten bei 4 ° C. Das Zellpellet anschließend in 1 ml kaltem Wasser resuspendiert und in einem 1,5 ml Röhrchen Effendorf und zentrifugiert bei maximaler Geschwindigkeit für 20 sec bei 4 ° C. Nach zwei oder drei Waschschritten mit eiskaltem Wasser, wird das Zellpellet schließlich in 700 ul eiskaltem, sterilen Wasser resuspendiert, was in elektro-kompetenten Zellen. </li><li> Durch Elektroporation wird ein ul des gereinigten Amplikon in 40 ul der elektro-kompetenten Zellen eingeführt. 2,5 kV, 25 uF mit Puls: Die Zellen werden in einem Bio-Rad GenePulser II mit folgenden Einstellungen elektroporiertSteuerung von 200 Ω. Nach homologer Rekombination und Integration werden die Transformanten, die erfolgreich rekombiniert das Tag / Kassette in das Chromosom basierend auf Resistenz gegen Kan (Abbildung 1A) ausgewählt ist. Mehrere Transformanten werden für Western Blotting, um die korrekte Erzeugung (dh positive Signal) von SPA-markierte Fusionsproteine ​​mit anti-FLAG M2-Antikörper, die selektiv gegen die FLAG-Epitope des SPA-tag ist verifizieren ausgewählt. </li><li> Bestätigt carboxyterminalen SPA-tag-Fusion-Stamm in großem Maßstab zu löslichem Protein-Komplexen aus geernteten Zellen unter Verwendung des SPA Aufreinigungsprotokolls isolieren kultiviert. Der übersicht der Schritte in dem Reinigungsverfahren Affinitätsmarkierung involviert ist in 1B gezeigt. </li></ol> 2. Kultivierung und Beschallung <ol><li> Beimpfen 100 ul einer SPA-markierten E. coli Glycerin Lager in 50 ml Terrific Broth (TB) Flüssigmedium mit 50 ul von 25 ug / ml o ergänztf Kan Lösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Die Kultur über Nacht bei 32 ° C. Anmerkung: Da die Temperatur-induzierbare λ Red Kassette in Stamm DY330 steht unter der Kontrolle eines temperatursensitiven Repressors 10 wird die SPA-markierten E.coli-Stamm bei 32 ° C gezüchtet </li><li> Übertragen 10 ml der Übernacht-Kultur in 990 ml frischem TB mit 25 ug / ml Kan in einem 4-Liter-Kolben ergänzt. Die Kultur wird bei 32 ° C unter konstantem Schütteln bei 250 Upm für 5 bis 6 Stunden gezüchtet, bis die OD 600 erreicht auf ~ 2 bis 3 ist. </li><li> Übertragen Sie die 1 Liter E. coli SPA-tag Kultur einer Zentrifugierung Flaschen zu reinigen und Spin der Zellen bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge J6-HC @ 3993 × g für 15 min. </li><li> Der Überstand wird von den Flaschen entfernt Zentrifugation. Resuspendieren E. coli-Zellpellets mit 25 ml Beschallungspuffer. Stellen Sie sicher, um die Zentrifugation Flaschen auf Eis zu allen Zeiten zu halten. </li><li> Die resuspendierten Pelletübertragen zu 50 ml Falcon-Röhrchen aus Polypropylen und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die eingefrorenen Zellen werden bei -80 ° C für die langfristige Verwendung gelagert. </li><li> Vor Beschallung, tauen die gefrorenen Zellen vollständig, indem die Pellets auf Eis. Die aufgetauten Proben werden in ein steriles Edelstahlbecher auf Eis platziert Ultraschallbehandlung übertragen. Die Sonde wird in die Probe eingetaucht und für 3 min mit Ultraschall behandelt. Eine zusätzliche 2 Minuten läßt man die Probe vor Überhitzung zu kühlen. </li><li> Das beschallte Zellysat wird in die vorgekühlte sterile Zentrifugenröhrchen gegeben und einer Zentrifugation bei 4 ° C im Beckman Zentrifuge mit einem Rotor JA-17 @ 35.267 xg (16.000 UpM) 15 min zweimal. Hinweis: Im Falle der Membran Proteinreinigung, die beschallte Zelllysat nur einmal für 15 min zentrifugiert, weil man nicht weiß, in welcher Fraktion sich die Membranproteine ​​sind, das heißt, entweder im Pellet oder in der Überstandsfraktion. Um zu vermeiden, überschießende Verlust des memMembran-Proteine, drehen wir die Zellen für 15 min bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand wird anschließend zur Reinigung weiterverarbeitet (siehe nachstehend beschrieben), wenn 1% Detergens verwendet wird, um die Membranproteine ​​zu solubilisieren. </li><li> Der Überstand der Zentrifugation wird vorsichtig Röhre zu einem 50 ml Polypropylen-Falcon-Röhrchen überführt und mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Die beschallte gefrorenen Zellextrakt wird höchstens für einen Zeitraum von 6 Monaten bei -80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. </li></ol> 3. Affinitätsreinigung <ol><li> Vor der Verwendung werden 100 ul Anti-Flag-M2-Kügelchen von 10 Volumen AFC-Puffer (30 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Detergenz und 0,1-0,5 mM TCEP [Tris (2-carboxyethyl) phosphin gewaschen - Salzsäure]) ohne Reinigungsmittel und das Reduktionsmittel TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphin). </li><li> Der gefrorene, beschallte Zellextrakt wird, indem das Röhrchen in kaltem Wasser aufgetaut. Die aufgetauten Zellen Extrakt wird mit 3 ul von Benzo inkubiertnase Nuklease 30 Minuten bei 4 ° C. Zu dieser Mischung hinzuzufügen nichtionischen Detergens Triton X-100 (Endkonzentration des Detergens 0,1% betragen sollte) und 200 ul Suspensionen von Anti-Flag-M2-Agarose-Kügelchen. Anmerkung: Für alle löslichen Proteins Reinigungen, 0,1% Triton X-100 wird verwendet, um nicht-spezifische Adsorption, zu minimieren, wo als zur Reinigung eines Membranproteins, verschiedenen milden nicht-ionischen Detergenzien, wie etwa C12E8 (Octaethylenglykol dodecylether), DDM ( n-Dodecyl β-D-maltosid) und Maltose-Neopentylglykol (MNG) können bei einer 1% Detergens Konzentration eingesetzt werden, um die Solubilisierung zu verbessern. Da verschiedene Wasch variierenden haben Solubilisierung Effizienz der Membranproteine, ist es empfehlenswert, unabhängige Reinigungen Protein mit mehr als einem Detergens durchzuführen. </li><li> Der Inhalt wird sanft durch Drehen des Rohres während 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt. Nach 3 Stunden der Drehung ist das Rohr bei 1.700 xg für 6 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann rsorgfältig emoved so viel wie möglich, ohne die lose Perlen Pellet. </li><li> Das Pellet wird in dem verbleibenden Überstand resuspendiert und anschließend in einem 0,8 x 4 cm Bio-Rad Polypropylen prep Spalte. Sicherzustellen, um den Bodenauslaß Stopfen aus der Säule zu entfernen, damit sich die Eluate durch Schwerkraft abfließen. Die Säule wird 5 mal mit TEV-Spaltung Schritt. </li><li> Nach dem Ablassen der gewaschenen Eluate wird der untere Auslass der Säule geschlossen. Um die gleiche Spalte wird die Spaltung durch Zugabe ~ 5 bis 10 ul (50 Einheiten) von TEV-Protease und 400 ul 1X AFC-Puffer auf die Säule durchgeführt. Sicherzustellen, um den Kopf der Kolonne mit einer Kappe zu schließen. Die Spalte mit den Perlen vorsichtig gedreht Nacht bei 4 ° C über Nacht mit einem LabQuake Shaker. </li><li> Entfernen der Kappe auf der Oberseite und dem Auslass Stopfen am unteren Ende der Säule, und die Eluate nach dem Drain-TEV-Spaltung in eine frische Säule mit 200 ul Suspensionen von Calmodulin-Sepharose-Kügelchen, die um 10 gewaschen wird zurückgewonnenVolumina von Calmodulin Bindungspuffer. </li><li> Sowohl die Ober-und die Unterseite der Säule dicht befestigt, und der Inhalt in der Kolonne werden sanft durch Drehen für 3 Stunden bei 4 ° C unter Verwendung eines LabQuake Schüttler gemischt. </li><li> Nach 3 Stunden der Drehung wird das Eluat durch Entfernen der oberen Kappe und der unteren Stopfen der Säule abgelassen. Die Spalte wird viermal mit 200 ul 1X Calmodulin Bindungspuffer durch ein stringentes Waschen mit 400 ul Calmodulin Waschpuffer gewaschen. </li><li> Das gebundene Protein wird in vier Fraktionen von 50 ul in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit 1X Calmodulin Elutionspuffer eluiert. Die eluierte Fraktion wird in zwei saubere Eppendorf-Röhrchen in gleichen Volumina verteilt. Sowohl die Rohre anschließend getrocknet unter Verwendung einer Geschwindigkeit Vakuum. </li><li> Das getrocknete Eluat von einem Rohr für den Betrieb eines Silberfärbung Gel verwendet, während die andere in -80 ° C gelagert wird, vor der Verwendung der Massenspektrometrie. </li></ol> 4. Silberfärbung <ol><li> Für Silber staining, wird die Hälfte des Volumens von 3X SDS (Natriumdodecylsulfat) Probenpuffer auf 50 ul des getrockneten Eluat gegeben. Nach Kochen der Mischung für 5 min werden die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. </li><li> Nachdem das Gel ausgeführt wurde, wird es vorsichtig in Fixierlösung gelegt (50% Methanol und 10% Essigsäure) und vorsichtig auf einem Schüttler für 20 min gerührt. Das Gel wird dann in 20% Ethanol für 10 min gespült. </li><li> Die feste Gel wird zweimal gründlich mit 500 ml doppelt destilliertem Wasser für 10 Minuten gewaschen, um niedrige einheitlichen Hintergrund zu gewährleisten. </li><li> Das Gel wird dann vorsichtig in 500 ml Natrium-Thiosulfat für 1 min, gefolgt von zwei Waschschritten mit destilliertem Wasser für 20 Sekunden gefolgt gerührt. </li><li> Das Wasser wird verworfen, und das Gel wird in 200 ml 0,1% Silbernitratlösung für 30 min inkubiert. Nach dieser Zeit wird die Silbernitratlösung entfernt und das Gel mit destilliertem Wasser für 20 sec. gewaschen, um den Überschuss an Silbernitrat entfernen. </li><li> Das Gel wird schließlich in 75 ml Hand geschütteltder Entwicklungslösung. Wenn die gewünschte Intensität erreicht ist, wird die Entwicklungslösung verworfen und 80 ml Essigsäure wird zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Sicherzustellen, um das Gel in Essigsäure für mindestens 20 min für die richtige Darstellung der Gelbanden inkubieren. </li></ol> 5. Proteolyse und Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie <ol><li> Um der getrockneten Probe werden 50 ul der Verdauung Puffer und 0,9 ul 100 mM TCEP-HCl (Tris (2-Carboxyethyl) phosphin - Salzsäure) und inkubieren Sie die Mischung für 45 min bei Raumtemperatur für den Reduktionsschritt. Anschließend wird 1 ul 500 mM Iodacetamid zugegeben und in dunklen weitere 40 min zur Probe Alkylierung ermöglichen. </li><li> Nach der zweiten Runde der Inkubation geben 1 ug immobilisiertem Trypsin zu dem Gemisch und inkubieren entweder bei 37 ° C für 5 Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, um die Reaktion durch Zugabe von 1 ul Essigsäure stoppen. </li><li> Vornässen Millipore Zip-Tip Pipettenspitze durch Absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung. Verzichten die Lösung zu verschwenden. Anschließend absaugen 10 ul der Waschlösung und verzichten die Lösung zu verschwenden. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Für eine effiziente Bindung des Peptids Mischung bis zur Spitze, mischen Pipette die Peptidmischung 20 mal. Das Peptidgemisch, dass zur Spitze geklebt wird durch Ansaugen und Abgeben der Waschlösung gewaschen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für eine effiziente Bindung des Peptid-Gemisch an der Spitze. </li><li> Mit der Spitze mit dem gebundenen Peptid absaugen 10 ul der Benetzung und Äquilibrierungslösung und verzichten in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Nach dem Trocknen der eluierten Proben in der Geschwindigkeit Vakuum kann die Proben sofort durch Massenspektrometrie analysiert oder bei -80 ° C vor der Verwendung. </li></ol> 6. Protein Identifizierung durch LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer The Polypeptid Komponenten der isolierten Komplexe werden anhand eines LTQ Orbitrap Velos Hybrid-Tandem-Massenspektrometer. Die Orbitrap hat außergewöhnliche Auflösungsvermögen (&gt; 60.000 Full Width Half Maximum oder FWHM) und Masse Genauigkeit (&lt;2 ppm), die MS / MS Probenahme von irrelevanten unspezifischen Hintergrund Verunreinigungen unter Kontrolle Reinigungen erkannt minimiert, während die High-Speed-Velos Ionenfalle Komponente erkennt und Fragment niedriger Häufigkeit Peptide unter Verwendung sowohl Elektronentransfer-Dissoziation und Kollisions-induzierte Dissoziation Modi. Hohes Vertrauen Spiele unter resultierenden MS / MS-Spektren mit Referenz E. kartiert coli Protein-Sequenzen mit Datenbank-Suchalgorithmus wie SEQUEST und jeder passenden Sequenz während einer Wahrscheinlichkeit Algorithmus wie STATQUEST 11 ausgewertet. Die gesamte Spektren Zahl Peptidsequenz Einzigartigkeit und gemeinsamen Hintergrund Kontaminanten in negative Kontrolle (dh. Mock) Reinigungen erkannt werden als eine geringe empirische falsch-dis zu erreichenErholung bewerten. Die folgenden Schritte sind für die Protein-Identifizierung durchgeführt: <ol><li> Die Mikro-Säulen sind mit ~ 10 cm von 3 um Luna-C 18-Harz gepackt sind und eine Schnittstelle mit einem Proxeon Nanoelektrospray Ionenquelle, die in Übereinstimmung mit dem Instrument Orbitrap platziert wird. </li><li> Eine nano Proxeon Strömung binäre HPLC-Pumpe wird verwendet, um eine stabile Spitze Flussrate von ~ 300 nl min -1 während der Peptidtrennungen liefern. </li><li> Um Peptid-Elution zu erreichen, wird eine organische Puffergradienten bis nach dem Muster der Komplexität gesetzt. Zum Beispiel wird die folgende Gradienten in der Regel bis zum E. eingestellt coli SPA Proben: Lösungsmittel B wird von 2% bis 6% in 1 min erhöht, um 24% in 38 min, bis 100% in den nächsten 4 min, bei 100% für 1 min gehalten, dann sank auf 2% in 1 min, und abschließende Halten bei 2% für 15 min. Die mobile Phase Lösungsmittel A hat 95% HPLC Gradient Wasser und 5% ACN mit 0,1% Ameisensäure, während Lösungsmittel B hat 5% HPLC Gradient Wasser und 95% ACN mit 0,1% Ameisensäure acid. Die Strömungsgeschwindigkeit an der Spitze der Nadel auf 300 nl min -1 für 60 min eingestellt. </li><li> Da die Massenspektrometer Zyklen durch einen vollen Scan Masse bei 60.000 Auflösungen ausführen, werden 10 gleichzeitige Tandem-Massenspektrum Abtastungen für die intensivsten Prekursorionen gesammelt. Dynamische Ausgrenzung, monoisotopische Masse Auswahl und Echtzeit-Daten-abhängigen Akquise-Instrument sind aktiviert. </li><li> Die Spektren werden mit Hilfe einer Datenbank gesucht Suchalgorithmus wie SEQUEST gegen eine Datenbank von E. coli-Protein-Sequenzen, und das Ergebnis wird statistisch filtriert unter Verwendung eines Wahrscheinlichkeitsmodells Algorithmus wie STAQUEST 11, um eine niedrige False Fündigkeitsquote gewährleisten. Nur hohes Vertrauen (99% Wahrscheinlichkeit) Kandidaten ausgewählt, während Spiele zeigen mehr als 10 ppm Masse Fehler im Vergleich zu den theoretischen peptide mass von der weiteren Betrachtung ausgeschlossen. </li></ol>

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<li>Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS Biol. 7, e1000096(2009).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Ein wichtiger Aspekt des SPA-basierte APMS hier beschriebene Ansatz ist, dass Tagging innerhalb der natürlichen chromosomalen Kontext durchgeführt wird, wodurch eine normale Genregulation wird beibehalten (dh Muttersprache. Köder Promoter erhalten, damit Expression nicht gestört wird) und native stabil-assoziierten Protein-Komplexe werden bei nahezu endogenen zurückgewonnen. Operon Polarität Probleme werden ebenfalls durch Einschließen eines nach außen gerichteten Promotor in der Selektionsmarker vermieden. Die...

<table><tbody><tr><td colspan="4">I. Antibiotika</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>#KAN201</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>#AMP201</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Terrific-Bouillon mittel</stark></td></tr><tr><td>Bio-Trypton</td><td>Bioshop</td><td>#TRP 402</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Bioshop</td><td>#YEX 555</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Bioshop</td><td>#GLY 002</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 302</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Bioshop</td><td>#PPM 303<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">3. Bakterienstamm und Plasmid</td></tr><tr><td>DY330</td><td></td><td>Yu et al. (2000)10</td><td></td></tr><tr><td>pJL148</td><td></td><td>Zeghouf et al. (2004)7</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. PCR- und Elektrophorese-Reagenzien</td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 x PCR-Puffer</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTPs</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>25 mM MgCl2</td><td>Fermentas</td><td># EP0281</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td># AGA002</td><td></td></tr><tr><td>Beladung Farbstoff</td><td>NEB</td><td>#B7021S</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Bioshop</td><td># ETB444</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE Puffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28355</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Bioshop</td><td>#TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Bioshop</td><td>#BOR001</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma</td><td># E6768</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Leiter</td><td>NEB</td><td>#N3232L</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Plasmid-Isolations- und Clean-up-Kits</td></tr><tr><td>Plasmid Midi-Kit</td><td>Qiagen</td><td>#12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>#28104<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">6. PCR- und Transformationsgeräte</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>iCycler</td><td></td></tr><tr><td>Agarose-Gelelektrophorese</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>GenePulser II</td><td></td></tr><tr><td>0,2 cm Elektroporationsküvette</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>42 &deg; C Wasserbadschüttler</td><td></td><td>Innova 3100</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter TJ-25 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>TS-5.1-500</td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C large Shaker</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>32 &deg; C-Platten-Inkubator</td><td>Fisher Scientific<</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">7. Elektrophorese und Western Blotting</td></tr><tr><td>Acrylamid Monomer, N,N'- Methylenbis-acrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0125</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bioshop</td><td># AMP001</td><td></td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>Sigma</td><td># B7906</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bioshop</td><td>#TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman No. 1 Filterpapier</td><td>Fischer Scientific</td><td>#09-806A</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean 3 Zellen</td><td>Bio-Rad</td><td>#165-3301</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Geltransfergerät</td><td>Invitrogen</td><td>#IB1001</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembranen</td><td>Bio-Rad</td><td>#162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-Flag M2 Antikörper</td><td>Sigma</td><td>#F3165</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase</td><td>Amersham</td><td>#NA931V</td><td></td></tr><tr><td>Vorgefärbt Protein-Molekulargewichtsstandards</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0363</td><td></td></tr><tr><td>Chemilumineszenz-Reagenz</td><td>PIERCE</td><td>#1856136</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiographie-Film</td><td>Clonex Corp</td><td>#CLEC810</td><td></td></tr><tr><td>Quick Draw Löschpapier</td><td>Sigma</td><td>#P7796</td><td></td></tr><tr><td>C2 Plattform Schaukelschüttler</td><td>New Brunswick Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4"><stark>8. Beschallungsgeräte und Reagenzien</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>#23395</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>#SOD001</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitoren</td><td>Roche</td><td>#800-363-5887</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mM TCEP-HCl</td><td>Thermo Scientific</td><td>#20490<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">9. Reagenzien und Ausrüstung für die Affinitätsreinigung</stark>0,8</td></tr> <tr><td>x 4 cm Bio-Rad Polypropylen-Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>#732-6008</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase-Nuklease</td><td>Novagen</td><td>#70746</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Agarose-Kügelchen</td><td>Sigma</td><td>#A2220</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin-Sepharose-Kügelchen</td><td>GE Healthcare</td><td>#17-0529-01</td><td></td></tr><tr><td>TEV-Protease</td><td>Invitrogen</td><td>#12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#C2661</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>LabQuake Shaker</td><td>Thermolyne</td><td>#59558<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">10. Silberfärbereagenzien</stark>Methanol</td></tr> <tr><td></td><td>Bioshop</td><td>#MET302</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Bioshop</td><td>t#ACE222</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat</td><td>Sigma</td><td>#S-7143</td><td></td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>Fischer Scientific</td><td>#S181-100</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Bioshop</td><td>#FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Bioshop</td><td>#SOC512</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">11. Reagenzien und Geräte für die Proteinidentifizierung </td></tr><tr><td>Trypsin Gold, Massenspektrometrie Qualität</td><td>Promega</td><td># V5280</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NH4HCO3</td><td>Bioshop</td><td>#AMC555</td><td></td></tr><tr><td>1 mM CaCl2</td><td>Bioshop</td><td>#CCL302</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma</td><td>#A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure Säure</td><td>Sigma</td><td>#F0507</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Sigma</td><td>#95304</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma</td><td>#16125</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Zip-Tip</td><td>Millipore</td><td># ZTC18M960</td><td></td></tr><tr><td>~10 cm von 3 &mu; m Luna-C18 Harz</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proxeon Nano HPLC Pumpe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Massenspektrometer</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific<td</td><td></td></tr> <tr>colspan="4">12. Laborbedarf</starke></td></tr><tr><td>4-Liter-Konuskolben</td><td>VWR</td><td>#89000-372</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polypropylen-Falcon-Röhrchen</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml konische Flocken</td><td>VWR</td><td>#29140-045</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterile Kulturröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>#366052</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Fläschchen</td><td>VWR</td><td>#479-3221-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Gefrierschrank</td><td>Fisher Scientific</td><td>#13-990-14</td><td></td></tr><tr><td>Speed vacuum system</td><td>Thermo Scientific<</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4"> Puffer und Lösungen 1. 1 Liter Terrific Broth (TB) media 11 g Bio-Trypton 22 g Hefeextrakt 2% Glycerin 50 ml Kaliumsalzbrühe solution 2. Kaliumsalz-Stammlösung 1,5 M K2HPO4 0,35 M KH2PO4 3. Beschallungspuffer 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10 % Glycerin Vor Gebrauch Proteaseinhibitor (PI) und 0,1-0,5 mM TCEP 4 hinzufügen. AFC-Puffer 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1 % Waschmittel Vor Gebrauch PI und 0,1-0,5 mM TCEP 5. TEV-Spaltpuffer 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1 % Waschmittel Vor Gebrauch PI und 0,1-0,5 mM TCEP 6 hinzufügen. Calmodulin-Bindungspuffer 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1 % Waschmittel Vor Gebrauch PI und 0,1-0,5 mM TCEP 7. Calmodulin-Waschpuffer 30 mM Tris-HCl pH 7,9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0,1-0,5 mM TCEP 8. Calmodulin-Elutionspuffer 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0,1-0,5 mM TCEP 9. Entwicklungslösung (1L) 37% Formaldehyd 30 g Natriumcarbonat 1000 ml destilliertes Wasser 10. Aufschlusspuffer 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Netz- und Äquilibrierungslösung 70% Acetonitril (ACN) in 0,1% Ameisensäure 12. Waschlösung 100% H2O in 0,1% Ameisensäure</td></tr></tbody></table>

identifizierung von protein-komplexen in<em&gt; escherichia coli</em&gt; mit sequential peptide affinity purification in kombination mit tandem-massenspektrometrie

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Da die meisten zellulären Prozesse werden von makromolekularen Anordnungen, die systematische Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) und die Identifizierung der Untereinheitzusammensetzung von Multi-Protein-Komplexen Einblick in Genfunktion Verfügung stellen können und besseren Verständnis der biologischen Systeme 1, 2 vermittelt wird. Physikalische Wechselwirkungen können mit hoher Konfidenz vialarge angelegte Isolierung und Charakterisierung von endogenen Proteinkomplexe unter nahezu physiologischen Bedingungen auf Affinitätsreinigung chromosomal-markierte Proteine ​​in Kombination mit Massenspektrometrie (APMS) basierend abgebildet werden. Dieser Ansatz ist erfolgreich in evolutionär diversen Organismen, einschließlich Hefe, Fliegen, Würmern, Säugetierzellen, Bakterien und 1-6 aufgebracht. Insbesondere haben wir eine Carboxy-terminale Peptid Sequentielle Affinity (SPA) dualen Markierungssystem für Affinitäts-Reinigungskatalysator native Protein-Komplexen aus kultivierten gramnegativen Escherichia coli erzeugt wird, unter Verwendung genetically Spann Gastlabor Stämme, die für genomweite Untersuchungen der grundlegenden Biologie und konservierte Prozesse der Prokaryoten 1, 2, 7 gut geeignet. Unsere SPA-Kennzeichnungssystem ist analog zu dem Tandem Affinitätsreinigung Methode ursprünglich für Hefe 8, 9 entwickelt, und besteht aus einem Calmodulin-Bindungspeptid (CBP) durch die Spaltstelle für die hochspezifische Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease gefolgt und drei Kopien des FLAG-Epitop (3X FLAG), so dass für zwei aufeinanderfolgende Runden von Affinitätsanreicherung. Nach Kassette Amplifikation werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte Codieren des SPA-tag und einen selektierbaren Marker integriert und ausgedrückt in Rahmen als carboxyterminale Fusionen in einem Hintergrund, der DY330 veranlaßt transient exprimieren ein hocheffizientes heterologe Bakteriophagen Lambda Rekombinationssystem 10 ist. Nachfolgende Dual-Schritt-Reinigung mit Calmodulin und anti-FLAG Affinitätsbeads ermöglicht die hochselektiveund effizienten Beitreibung sogar geringer Menge Protein-Komplexe von großen Kulturen. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um die stabil co-reinigenden Proteine ​​mit hoher Empfindlichkeit (niedrige Nachweisgrenzen Nanogramm) zu identifizieren. Hier beschreiben wir detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren, die wir üblicherweise für die systematische Protein-Tagging, Reinigung und Massenspektrometrie-basierte Analyse von löslichem Protein-Komplexen aus E. verwenden coli, die bis skaliert werden und kann potenziell auf andere Bakterienarten, einschließlich bestimmter opportunistischer Krankheitserreger, die zugänglich Recombineering zugeschnitten sind. Die resultierenden physikalischen Wechselwirkungen zeigen oft interessante unerwartete Komponenten und Verbindungen hindeutet neuartige mechanistische Links. Integration der PPI-Daten mit alternativen molekulare Assoziation Daten wie genetische (Gen-Gen-) Wechselwirkungen und genomische-Kontext (GC) Prognosen Aufklärung der globalen molekulare Organisation von Multi-Protein-Komplexe in bi erleichtern kanngische Wege. Die Netzwerke für E. erzeugten coli können verwendet werden, um einen Einblick in die funktionelle Architektur von orthologen Genprodukte in anderen Mikroben für die funktionelle Annotationen derzeit fehlen gewinnen.

Sobald markierte Bait-Proteine, die auf endogenen Spiegeln exprimiert werden, aus Kulturen in der logarithmischen Wachstumsphase affinitätsreinigten wurden, wurden die Proben auf einem Silberfärbegel elektrophoretisch getrennt, um die einzelnen Polypeptidbestandteile der isolierten stabilen Komplexe sichtbar zu machen. Einen zweiten Teil der affinitätsreinigten Proteinproben unterwarfen wir einer gelfreien Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), um die entsprechenden Polypeptidsequenzen zu identifizieren. Die Wirksamkeit ...

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium entwickelt<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Das verwendet werden kann, zu isolieren und zu charakterisieren stabilen Multi-Protein-Komplexen zur Homogenität, auch ausgehend von einer geringen Kopienzahl pro Zelle ist.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, Proteine, Proteinwechselwirkungen und die Untereinheitenzusammensetzung nativer MultiPro-Komplexe aus E. coli zu identifizieren. Dazu werden sequenzspezifische lineare PCR-Produkte amplifiziert, die den SPA-Tag und einen selektierbaren Marker kodieren und in einem ddy 3, 3 0 Hintergrund als carboxyterminale Fusionen mithilfe des bakteriellen Fage-Lambda-Rekombinationssystems integriert und exprimiert werden. Anschließend erfolgt eine zweistufige Reinigung unter Verwendung von Cow-Modlin- und Anti-Flag-Affinitätskügelchen, um proteinreiche Komplexe mit geringer Häufigkeit effizient anzureichern. Danach werden die gebundenen Proteine, die mit Cow-Modlin-Puffer oder CEB eluiert wurden, mit Trypsin verdaut und mittels Massenspektrometrie zur Proteinidentifizierung analysiert.Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass mehrere Untereinheiten des kernartigen RNA-Polymerase-Enzyms, einschließlich der Transkriptionsbeendigungs- und Anti-Determinationsfaktoren, effizient mit dem markierten RNA-Polymerase-Untereinheiten-D-Protein mitgereinigt wurden, was darauf hindeutet, dass neu assoziierte Komponenten mithilfe dieses Ansatzes effizient identifiziert w

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Dieses Video demonstriert die Tandem-Affinitätsreinigung — eine Technik zur Reinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen. Der Komplex enthält zwei Proteine, die mit unterschiedlichen Epitop-Tags markiert sind. Nach der Reinigung des Komplexes unter Verwendung von zwei Harzen mit einer Affinität für die beiden verschiedenen Tags in einer sequentiellen Weise bestätigt das Vorhandensein beider Proteine in der Eluierung die...

Tandem-Affinitätsreinigungsassay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Wir beschreiben hier eine neuartige, robuste und effiziente Methode zur Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) zur Expression, Isolierung und Charakterisierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. Dieses Protokoll könnte sowohl für die biochemische Charakterisierung diskreter Komplexe als auch für die Identifizierung neuartiger Interaktoren und posttranslationaler Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Lernen Sie die sequentielle Peptid-Affinitätsreinigung mit Tandem-Massenspektrometrie zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht die effiziente Isolierung selbst niedrig abundanter Proteinkomplexe.

Identifizierung von Protein-Komplexen in Escherichia coli Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von Protein-Komplexen in

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