2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Diese Methode kann nicht nur zur Beantwortung zentraler Fragen der Grundlagenforschung eingesetzt werden, sondern auch als Beitrag im medizinischen, pharmazeutischen und biotechnologischen Bereich dienen, indem neuartige kleinmolekulare Liganden essentieller Proteine abgegrenzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die parallele Analyse von Proteinen und Stoffwechselpartnern des Proteins der Wahl unter engmaschigen vivo-Bedingungen ermöglicht. Diese Methode hilft, interagierende Moleküle herauszufischen, ohne auf vorselektierte Liganden beschränkt zu sein.

Obwohl diese Methode für Pflanzen entwickelt wurde, kann sie auch für andere Systeme wie HeLa-Zellen, E. coli und S. Cerevisiae angewendet werden. Bereiten Sie zunächst MSMO-Medium vor und stellen Sie den pH-Wert mit einem molaren Kaliumhydroxid auf 5,7 ein. Dann autoklavieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius.

Geben Sie die Ergänzungsmittel kurz vor Beginn des Experiments in das Medium. Züchten Sie nun die transgene PSBL Arabidopsis thaliana-Zellkultur in 50 Millilitern MSMO-Medium in einem 100-Milliliter-Kolben. Stellen Sie dann den Kolben auf einen orbitalen Plattformschüttler und bewegen Sie die Zellen vorsichtig bei 130 U/min bei 20 Grad Celsius im Licht.

Alle sieben Tage werden die Zellen in frischem Medium bei einer Lösung von 1 bis 10 subkultiviert. Verwenden Sie anschließend einen Glastrichter mit einem Nylonnetz, das auf einem konischen Kolben befestigt ist und mit einer Vakuumpumpe verbunden ist, um die Zellen während der logarithmischen Wachstumsphase zu ernten. Wickeln Sie dann die getrockneten Zellen in Alufolie ein und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.

Mit einer vorgekühlten Rührmühle, die auf eine Schwingungsfrequenz von 20 Hertz eingestellt ist. Homogenisieren Sie das geerntete und gefrorene Pflanzenzellmaterial zwei Minuten lang zu einem feinen Pulver. Anschließend werden drei Gramm des gemahlenen Pulvers pro Probe mit flüssigem Stickstoff aliquotiert, um ein Auftauen zu verhindern.

Anschließend wird das gemahlene Pulver mit einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Mörtel mit drei Millilitern eiskaltem Lysepuffer verzerrt, bis es auftaut. Teilen Sie die aufgetaute Probe sofort in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.817 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zelltrümmer zu entfernen.

Während die Probe zentrifugiert wird, aliquotieren Sie 100 Mikroliter IgG-Sepharosekügelchen pro Probe. Fügen Sie einen Milliliter Lysepuffer hinzu und suspendieren Sie die Kügelchen durch Vortexen. Schleudern Sie drei Sekunden lang bei 2.000 g und verwerfen Sie den Lysepuffer.

Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in 400 Mikrolitern Lysepuffer. Nach der Zentrifugation werden drei Milliliter des klaren Pflanzenlysats in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie die voräquilibrierten Kügelchen in das Pflanzenlysat und inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad.

Füllen Sie die Mischung in eine Spritze, die mit einem Köder verbunden ist, der mit einem Köder verschlossen ist, an einer Spinsäule mit einem 35 Mikrometer großen Filter, der sich oben auf dem Vakuumverteiler befindet. Führen Sie das Lysat durch das Gerät, indem Sie die Vakuumpumpe mit leichtem Druck einschalten, um eine Beschädigung der Kügelchen zu vermeiden. Das ungebundene Lysat wird in die an der Basis im Verteiler befindliche Abfallstation abgelassen und die Proteinkomplexe, die an die Kügelchen gebunden sind, verbleiben auf dem Filter.

Sobald die Spritze aus dem Zelllysat entleert ist, fügen Sie 10 Milliliter Waschpuffer hinzu, um die Kügelchen zu waschen. Fügen Sie dann Milliliter Elutionspuffer hinzu, um den zweiten Waschschritt durchzuführen. Entfernen Sie nun die Spritze und die Köderverschlusskappe.

Schließen Sie die untere Kappe an der Säule und geben Sie 400 Mikroliter des Elutionspuffers, der 50 Einheiten der verstärkten Form des Tabakätzvirus, der Protease, enthält, zu den Kügelchen. Stellen Sie die Säule auf einen Tischschüttler, der 30 Minuten lang bei 16 Grad Celsius auf 1.000 U/min eingestellt ist. Geben Sie dann weitere 50 Einheiten der Protease in die Säule und inkubieren Sie die Mischung auf dem Shaker wie im vorherigen Schritt.

Entfernen Sie als Nächstes die untere Kappe und setzen Sie die Säule in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein. Eine Minute lang bei 20.817 g zentrifugieren, um das Eluat zu sammeln und mit der Protein- und Metabolitenextraktion fortzufahren. Um die Extraktion zu beginnen, fügen Sie dem Eluat einen Milliliter drei bis eins bis eins MTBE Methanol-Wasserlösungsmittel hinzu.

Drehen Sie das Röhrchen um, um es mit der Probe zu mischen. Fügen Sie dann 0,4 Milliliter von ein bis drei Methanol-Wasserlösungen zu der Mischung hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um die Probe zu mischen. Anschließend wird die Probe bei 20.817 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um eine Phasentrennung zu ermöglichen.

Entfernen Sie mit einer manuellen Ein-Milliliter-Liquid-Handling-Pipette die obere Phase, die Lipide enthält. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter Methanol hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um die Probe zu mischen. Bei 20.817 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren und die polare Phase in einem neuen Röhrchen für Metabolitenmessungen auffangen.

Lassen Sie etwa 50 Mikroliter der polaren Phase am Boden des Röhrchens, um ein Verdrängen des Proteinpellets zu vermeiden. Trocknen Sie anschließend das Rohr mit der polaren Phase über Nacht in einem Zentrifugalverdampfer. Trocknen Sie die Tuben mit den Proteinpellets 30 bis 60 Minuten lang, um ein Übertrocknen zu vermeiden.

Mit Hilfe einer einstufigen Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie wurden Protein-Protein- und Protein-Metaboliten-Wechselwirkungen in transgenen Arabidopsis thaliana-Zellkulturen identifiziert. Zellkulturen, die NDPK1 exprimieren, zeigen eine signifikante Anreicherung von Valin-Leucin, Isoleucinglutamat, Leucin-Isoleucin und Isoleucin Phenylalanin im Vergleich zu Proben mit leeren Vektoren, NDPK2 und NDPK3. Um nach bekannten Protein-Protein- und Protein-Metaboliten-Wechselwirkungen zu suchen, werden 13 Proteine und vier Dipeptide, die mit NDPK1 ko-eluieren, mit der Stichdatenbank abgeglichen.

Die Hauptassoziationen bestehen zwischen dem APX1-Ortholog und der Aldehyddehydrogenase-Familie sowie dem Translationsinitiationsfaktor FBR12 und dem Alpha-Homolog des Translationsinitiationsfaktors zwei Untereinheiten. Die identifizierten Dipeptide zeigen keine berichteten Proteinpartner. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Proben, Geräte und Reagenzien während des gesamten Experiments kalt zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Thermophorese des Mikroskops oder der Aktivitätsassay, durchgeführt werden, um die direkte Wechselwirkung zwischen Molekülen oder die Inferenz ihres Liganden auf die Proteinaktivität zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie während des gesamten Verfahrens mit der Probe umgehen müssen, um vertrauenswürdige Ergebnisse zu erhalten und Liganden des von Ihnen gewählten Proteins zu identifizieren.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Methanol und MTBE-Lösung äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden, und es sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten unter dem Abzug.