Name: 2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Affinitätsreinigung zur parallelen Analyse von Protein-Protein- und Protein-Metabolit-Interaktionen in Arabidopsis thaliana-Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung interagierender Moleküle in vivo.

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Wir möchten bitte Prof. Dr. Lothar Willmitzer für sein Engagement im Projekt, produktive Diskussionen und tolle Betreuung anerkennen. Wir sind dankbar, Dr. Daniel Veyel für die Hilfe bei Proteomik-MS-Messungen. Wir schätzen Frau Änne Michaelis, die uns wertvolle technische Hilfe mit LC-MS-Messungen. Darüber hinaus möchten wir Dr. Monika Kosmacz und Dr. Ewelina Sokołowska für ihre Hilfe und Beteiligung an der Arbeit auf dem Originalmanuskript und Weronika Jasińska für technische Unterstützung zu danken.

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li>
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<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
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<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellte Protokoll ermöglicht parallele Identifikation von PP und PM-komplexe an ein Zielprotein. Von Klonen zur endgültigen Ergebnisse, kann das Experiment in weniger als 8 bis 12 Wochen abgeschlossen werden. Komplette AP dauert ca. 4-6 h für eine Gruppe von 12 bis 24 Proben, Rendern unser Protokoll für mittleren Durchsatz Analyse geeignet.
Das Protokoll, trotz insgesamt einfach, hat eine Reihe von kritischen Schritte. (i) ausreichende Menge an input Protein und Affinität Perlen ist entscheidend für einen dynamischen Bereich von Metaboliten Erkennung zu erreichen. Effiziente Zelle Lysis ist daher ein entscheidender Schritt im Verfahren. Armen Protein Erträge können eine Folge der unzureichenden Pulverisierung des Materials oder der suboptimalen Lyse-Puffer/Material-Verhältnis sein. (Ii) Vorsicht geboten, dass die verwendeten Reagenzien MS-freundlich sind. Starke Reinigungsmittel, Glycerin oder übermäßige Mengen von Salz sollte vermieden werden, da sie mit MS-Detektion stören. (Iii) Agarose Korne sollte nicht über getrocknete während Waschschritte, und bei Vakuum vielfältige Verwendung ist es wichtig, einen langsamen Durchfluss um nicht zu zerstören die Perlen oder beeinflussen Komplexstabilität anzuwenden.
Es gibt einige wichtigen möglichen Änderungen des vorliegenden Protokolls: (i) Wir verwenden die konstitutive CaMV35S Promotor Köder Eiweißmenge zu maximieren. Überexpression, kann zwar sehr nützlich, ernsthafte Auswirkungen auf Zelle Homöostase28 haben und führen zur Bildung von physiologisch irrelevant Interaktionen. Ausdruck der tagged Proteine mit native Promotoren und wo möglich in einem Verlust der Funktion zum Abrufen der wahre biologische Interaktoren überlegen ist. Für Proteine, die normalerweise nicht in pflanzlichen Zellkulturen ausgedrückt könnte ein Pflanze Hintergrund notwendig, um relevante Interaktoren identifizieren. (Ii) bei der Arbeit mit Membranproteine muss der Lyse Puffer mit einer MS-kompatible Reinigungsmittel ergänzt werden. (Iii) Einführung eines zweiten Affinitätsreinigung Schritts Fehlalarme wahr-positive Verhältnis verbessern und beseitigen die Notwendigkeit für EV Steuerelemente29. Ein neuartiger Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen stellt eine attraktive Alternative zu der Größe-Ausschluss Chromatographie Schritt hinzugefügt von Maeda Et Al. 201411, das ist mühsam und zeitaufwendig.
Der schwerwiegendste Nachteil des AP ist die hohe Rate falsch positiver Ergebnisse. Die Gründe sind zahlreich. Konstitutive Überexpression wurde bereits erwähnt. Eine weitere Quelle für physiologisch irrelevant Interaktionen ist, wenn Arbeit mit isolierten Organellen, Vorbereitung der gesamten Zelle Lysates mit Mischungen von Proteinen und Metaboliten aus verschiedenen subzelluläre Kompartimente. Subzelluläre Lokalisation sollte für wahre Interaktoren Filtern verwendet werden. Dennoch ergeben sich die Mehrheit der Fehlalarme durch unspezifische Bindung zwischen Proteinen und Agarose Harze. Einführung einer zweiten Reinigungsstufe, wie oben beschrieben, bietet die beste Lösung für das Problem, geht jedoch auf Kosten der Zeit und Durchsatz. Darüber hinaus können schwächere Interaktion verloren gehen, da das Protokoll verlängert. Ein weiterer Nachteil von AP ist, dass trotz der umfassenden bereitgestellten Informationen über die Interaktom an ein Zielprotein, Unterscheidung zwischen direkten und indirekten Ziele des eifrigen Proteins unmöglich. Gezielte Bimolekulare Ansätze sind notwendig, um Interaktionen zu bestätigen.
AP in Verbindung mit MS-basierte Metabolomik wurde verwendet, um Proteinkomplexe in S. Cerevisiae12. zu studieren Dieser Arbeit, zusammen mit unseren früheren Beobachtung13 , dass ähnlich, Lipide, polar und semi-polare Verbindungen isoliert von zellulären Lysates Proteinkomplexe gebunden bleiben vorgesehen konzeptionelle Vorarbeit für die vorgestellten Protokoll. Unser Protokoll zeichnet sich durch drei einzigartige Punkte: (i) im Gegensatz zu der Hefe arbeiten12, es zeigt, dass AP geeignet für das Abrufen von nicht nur wasserabweisend, aber auch hydrophile Protein Liganden. (Ii) durch die Einführung eines drei-in-One-Extraktion-Protokolls, ist eine einzelne AP einsetzbar, Proteinen und Metaboliten Interaktoren des Proteins Köder zu studieren. (Iii) Wir haben das Protokoll zur Pflanzenzellen angepasst.
Zukünftige Bemühungen konzentrieren sich auf einen neuartige Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen erstellen. Wir würden auch gerne Eignung des Protokolls zu niedrig-Fülle kleine Moleküle wie pflanzlichen Hormonen zu erkunden.

Hier beschriebenen Methode zielt auf die Identifizierung von Metaboliten und Protein Partnern eines Proteins der Wahl in den zellulären lysate Bedingungen in der Nähe vonin-Vivo . Es wurde spekuliert, dass viele weitere Metaboliten als heute charakterisiert eine wichtige regulatorische Funktion1. Metaboliten fungieren als biologische Schalter, verändern die Aktivität, die Funktionalität sowie die Lokalisierung ihrer Rezeptor Proteine2,3,4. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere bahnbrechende Methoden, die Identifizierung des PMI in Vivo oder in nahe -in-Vivo -Bedingungen ermöglichen entwickelten5. Verfügbaren Ansätze können in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst Techniken, die mit einem bekannten-Metabolit Köder zu starten, um neues Protein Partner zu fangen. Methoden umfassen Affinität Chromatographie6, Medikament Affinität reagiert Ziel-Stabilität Assay7, Chemo-Proteomics8und thermische Proteom Profilerstellung9. Die zweite Gruppe besteht aus einer einzigen Methode, die mit einem bekannten Protein beginnt um kleine Molekül Liganden10,11zu identifizieren.
AP in Verbindung mit MS-basierte Lipidomics wurde zum Analysieren der Protein-Lipid-komplexe in Saccharomyces Cerevisiae12. Als Ausgangspunkt die Autoren verwendeten Hefestämme mit dem Ausdruck 21 Enzyme Ergosterin-Biosynthese beteiligt und 103 Kinasen verschmolzen zu einem Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) Tag. 70 % der Enzyme und 20 % von der Kinasen fanden sich verschiedene hydrophobe Liganden, Licht in das komplizierte Protein-Lipid-Interaktion-Netz zu binden.
Bisher konnten wir nachweisen, dass ähnlich wie Lipide, polar und semi-polare Verbindungen auch Proteinkomplexe isoliert von der zellulären Lysates13verpflichtet bleiben. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wir beschlossen, die AP optimieren Methode vorher10,11 für Pflanzenzellen und hydrophilen Verbindungen14veröffentlicht. Zu diesem Zweck haben wir TAP Vektoren von Van Leene Et Al. 2010, erfolgreich im Einsatz im Werk PPI Studien15beschrieben. Um den Zeitaufwand zu transgenen Linien zu verkürzen, haben wir uns entschieden auf Arabidopsis Zellkulturen. Wir Beschäftigten eine einstufige Methyl- Tert-Butyl-Ether, (MTBE) / Methanol/Wasser Extraktions-Verfahren, so dass die Charakterisierung von Proteinen (Pellet), Lipide (organische Phase) und hydrophilen Metaboliten (wässrige Phase)16 in einem einzigen Affinitätsreinigung Experiment. EV-Steuerleitungen wurden eingeführt, um Fehlalarme, z.B. Proteine binden an dem Tag allein auszuschließen. Als Proof of Concept wir markiert drei (von fünf) Nukleosid Diphosphat Kinasen präsentieren in Arabidopsis Genom (NDPK1-NDPK3). Unter anderem Erkenntnisse konnten wir nachweisen, dass NDPK1 mit Glutathion S interagiert-Transferase und Glutathion. Folglich konnten wir beweisen, dass Glutathionylation14NDPK1 ausgesetzt ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, die vorgestellte Protokoll ist ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktion Netze und stellt einen großen Fortschritt gegenüber bestehenden Methoden.

<table><tbody><tr><td>Murashige und Skoog Basalsalze mit minimalen organischen Bestandteilen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthymilchsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 Protease-Inhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV-Protease</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&nbsp; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag Antikörper (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C-Mix, Massenspektrometrie-Qualität</td><td>Promega&nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Thioharnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Jodacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>Methanol&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 Plattformschüttler</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh (Drahtdurchmesser 34 & Mikro; M, Dicke 55 & Mikro; M, offene Fläche 14%)</td><td>Prosepa</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Glastrichter, 47 mm, 300 ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>Filterflasche Top 500 mL 0,2 &micro; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Mill MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol ""Classic"" mit 2 verschiedenen Schraubverschlüssen ohne Filter</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>Filter (klein) 35 & Mikro; M Porengröße, für Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>Rohrrotator mit variabler Drehzahl SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>Drehteller für Rotatoren SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE Verteiler</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE Säulen 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&nbsp; Fläschchen</td><td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&ouml; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Säule</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 Flüssigkeitschromatograph</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupol-Orbitrap Massenspektrometer</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC System&nbsp;</td><td>Gewässer&nbsp;</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 Säule, 100A, 1,8 & Mikro; M, 2,1 mM x 100 mM, 1/kg</td><td>Wasser;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>Hochleistungs-Ultraschall-Reinigungsbäder für wässrige Reinigungslösungen</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata Expressionist</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 in 1: affinitätsreinigung für die parallele analyse von protein-protein und protein-metabolit komplexe in einem schritt

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Zelluläre Prozesse werden durch Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen wie Proteinen, Metaboliten und Nukleinsäuren geregelt. Während die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) keine Neuheit ist, bilden experimentelle Ansätze mit dem Ziel, endogene Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) charakterisieren eine relativ neue Entwicklung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das gleichzeitige Charakterisierung der PPI und PMI eines Proteins Wahl, bezeichnet als Köder erlaubt. Unser Protokoll wurde optimiert für Arabidopsis Zelle Kulturen und Affinitätsreinigung (AP) kombiniert mit der Massenspektrometrie (MS)-basierte Erkennung von Protein und Metaboliten. Kurz gesagt, sind transgene Arabidopsis-Linien, mit dem Ausdruck Köder Protein verschmolzen zu einem Affinität-Tag zunächst lysiert, um eine native zellulären Extrakt zu erhalten. Anti-Tag Antikörper werden verwendet, um die pull-down-Protein und Metabolit Partner des Proteins Köder. Die Affinität gereinigt-komplexe werden extrahiert, mit einer One-Step-Methyl- Tert-Butyl-Äther (MTBE) / Methanol/Wasser-Methode. Während Metaboliten in der polaren oder hydrophoben Phase zu trennen, können Proteine in das Pellet enthalten. Metaboliten und Proteine werden dann von Ultra-Performance liquid Chromatography-Massenspektrometrie (UPLC-MS oder UPLC-MS/MS) analysiert. Leer-Vektor (EV) Steuerleitungen werden verwendet, um Fehlalarme auszuschließen. Der große Vorteil unserer Protokoll ist, dass es ermöglicht die Identifizierung von Proteinen und Metaboliten Partnern ein Zielprotein parallel in der Nähe von physiologischen Bedingungen (Mobilfunk lysate). Die vorgestellte Methode ist einfach, schnell und leicht an biologische Systeme als Pflanze Zellkulturen angepasst werden kann.

In der ursprünglichen Studie wurden drei A. Thaliana NDPK Gene in Zellkulturen Aussetzung PSB-L unter der Kontrolle der konstitutiven 35 s-Promoter14 (Abbildung 1) überexprimiert. Tandem-Affinität-Tag war an entweder Carboxy oder amino-terminalen Ende eines Köder-Proteins fusioniert. Die komplexe Affinität gereinigt wurden MTBE/Methanol/Wasser-Extraktion16unterzogen. Affinität zog Proteinen und kleinen Molekülen wurden mit MS (Tabellen S2 und S3) identifiziert.
Um Fehlalarme zu beheben, wurden leere Proben verwendet, um kleine Molekül Verunreinigungen aus der Chemie- und Labor-Verbrauchsmaterialien auszuschließen. Darüber hinaus wurden Metaboliten und Proteine, die entweder einen Affinität Tag binden oder Harz allein entfielen mit EV Steuerleitungen. Zum Abrufen von wahren positiven, zweiseitige nicht gepaart Schülers t-Test und Benjamini &amp; Hochberg false Discovery Rate wurde Korrektur angewandt, um Metaboliten (Tabelle S4) und Proteine (Tabelle S5) wesentlich bereichert, in der NDPKs AP zu identifizieren Experimente (N - und C-Terminal NDPKs markiert) im Vergleich zu den EV-Steuerleitungen (FDR &lt; 0,1). Beachten Sie, dass in den früheren arbeiten wir Abwesenheit/Präsenz Kriterien, Protein und kleine Molekül Interaktoren abzugrenzen.
Repräsentative Ergebnisse erhalten für NDPK1, während auf Dipeptide, einer neuartigen Klasse der kleinen Molekül Regulierungsbehörden studierte in unserer Gruppe Metabolit Daten konzentrieren. Proteomic Analyse ergab 26 vermeintliche Protein-Partner des NDPK1. Durch weitere Filterung für Proteine, die gemeinsam im selben subzelluläre Raum als NDPK1 lokalisiert (Zytosol), die Liste verengt sich auf 13 mutmaßliche Protein Interaktoren. Unter den identifizierten Proteine waren Glutathion S-Transferase, zwei Dehnung Einleitung Faktoren, Tubulin und aconitate Hydratase. Metabolomic Analyse ergab vier Dipeptide Val-Leu, Ile-Glu Leu-Ile und Ile-Phe, die speziell Co eluiert mit NDPK1 (Abbildung 2). Beachten Sie, dass alle vier Dipeptide einen hydrophoben Rest in ihrem N-Terminus, was auf gemeinsame verbindliche Spezifität teilen.
Suchen Sie nach bekannten Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe wir identifiziert abgefragten 13 Proteine und vier Dipeptide gegen den Stich Datenbank25 (Abbildung 3). Mehrere Beobachtungen gemacht werden könnte: (i) keines der interagierenden wurde zuvor für NDPK1 gemeldet. (Ii) APX1 Ortholog wurde berichtet, dass Aldehyde Dehydrogenase Familienmitglied ALDH7B4, während der Einleitung Übersetzungsfaktor FBR12 mit einer anderen Übersetzung Einleitung Faktor kodiert durch das Gen AT2G40290 interagieren. (Iii) die identifizierten Dipeptide haben kein Protein Partner berichtet. Co eluierten Dipeptide wurden früher als alle abgerufenen pflanzlichem Eiweiß verbunden nicht gemeldet. Allerdings spielen sie eine wichtige Rolle in anderen Organismen: Leu-Ile, z. B.hat eine Neurotrophin-aktivierende Wirkung in einer menschlichen Zelle Zeile26. Beachten Sie, dass das Experiment nicht erlaubt die genaue Topologie des Systems zu identifizieren. Zum Beispiel ein Dipeptid kann direkt mit NDPK1 interagieren aber kann auch im Zusammenhang mit einem der Co gereinigter Proteine.
Zusammen genommen, unsere Ergebnisse zeigen, dass das festgelegte Verfahren, Einsatz von AP zusammen mit Massenspektrometrie, erleichtert die Identifizierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktoren und hilft umfassende Informationen über generieren die Interaktom des Zielproteins.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Abbildung 1: Schema des AP-MS-Workflow. (A) Vorbereitung einer native lösliche Fraktion aus pflanzlichen Zellkultur. (B) die nächsten Schritte in der AP-Prozedur. Nach dem Laden der Probe auf die Säule, bindet das Protein von Interesse (POI) verschmolzen zu einem TAP-Tag an der IgG-Antikörper auf die Agarose-Perlen immobilisiert. Waschen der Spalte erleichtert die Entfernung von ungebundenen Proteinen und Metaboliten. Nach der Durchführung entwicklelt Spaltung, sind POI Protein-Metabolit komplexe eluiert. (C) Trennung von komplexen in Protein und Metabolit Fraktion gefolgt von semi-quantitativen MS-Analyse. Teil dieser Figur wird von Luzarowski Et Al. 201714wiedergegeben. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Abbildung 2: Dipeptide speziell Co eluierenden mit NDPK1. Durchschnittliche Intensität von vier Dipeptide Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)und Ile-Phe (D) in AP Experiment gemessen wurden aufgetragen. Alle vier Dipeptide zeigen deutliche Bereicherung in NDPK1 Proben im Vergleich zur Kontrolle der EV (Sternchen darstellen FDR &lt; 0,1). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler für 6 Messungen (3 Wiederholungen von N- und C-Terminal 3 markiert Proteine). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Abbildung 3. Interaktion-Netzwerk aller Moleküle zusammen mit NDPK1, eluierenden abgefragt gegen Stich-Datenbank unter Berücksichtigung nur frühere experimentelle und Datenbank Beweise (Vertrauen &gt; 0,2). Mehr Zuversicht zeigt höhere Chancen von Interaktion und errechnet sich anhand der hinterlegten Daten. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Tabelle S1. MaxQuant output-Tabelle "parameters.txt". Tabelle enthält Grenzwerte für die Identifizierung und Quantifizierung sowie Informationen über die verwendeten Datenbanken. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S2. Ausgabe von Informationen aus MaxQuant Tabelle "proteinGroups.txt". Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Protein Gruppen, Intensitäten und zusätzliche Informationen wie Anzahl der einzigartigen Peptide und Partitur. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S3. Ausgabedatei, die Analyse der polaren Metaboliten. Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Masse Features zeichnet sich durch spezifische m/Z, RT und Intensität. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S4. Dipeptide in AP Proben gefunden, in denen NDPK1, NDPK2 oder NDPK3 als Köder verwendet wurden. Dipeptide im leeren Proben wurden aus der Liste ausgeschlossen. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK wurden in dreifacher Ausführung ausgeführt. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini &amp; Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR &lt; 0,1). ΔRT errechnet sich in Bezug auf die Referenzverbindungen und Δppm in Bezug auf die Monoisotopic Masse in Metlin27gegeben gegeben. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S5. Proteine, die gemeinsam mit NDPK1 gereinigt. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK in dreifacher Ausfertigung ausgeführt wurden. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini &amp; Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR &lt; 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Diese Methode kann nicht nur zur Beantwortung zentraler Fragen der Grundlagenforschung eingesetzt werden, sondern auch als Beitrag im medizinischen, pharmazeutischen und biotechnologischen Bereich dienen, indem neuartige kleinmolekulare Liganden essentieller Proteine abgegrenzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die parallele Analyse von Proteinen und Stoffwechselpartnern des Proteins der Wahl unter engmaschigen vivo-Bedingungen ermöglicht. Diese Methode hilft, interagierende Moleküle herauszufischen, ohne auf vorselektierte Liganden beschränkt zu sein.Obwohl diese Methode für Pflanzen entwickelt wurde, kann sie auch für andere Systeme wie HeLa-Zellen, E. coli und S. Cerevisiae angewendet werden. Bereiten Sie zunächst MSMO-Medium vor und stellen Sie den pH-Wert mit einem molaren Kaliumhydroxid auf 5,7 ein. Dann autoklavieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius.Geben Sie die Ergänzungsmittel kurz vor Beginn des Experiments in das Medium. Züchten Sie nun die transgene PSBL Arabidopsis thaliana-Zellkultur in 50 Millilitern MSMO-Medium in einem 100-Milliliter-Kolben. Stellen Sie dann den Kolben auf einen orbitalen Plattformschüttler und bewegen Sie die Zellen vorsichtig bei 130 U/min bei 20 Grad Celsius im Licht.Alle sieben Tage werden die Zellen in frischem Medium bei einer Lösung von 1 bis 10 subkultiviert. Verwenden Sie anschließend einen Glastrichter mit einem Nylonnetz, das auf einem konischen Kolben befestigt ist und mit einer Vakuumpumpe verbunden ist, um die Zellen während der logarithmischen Wachstumsphase zu ernten. Wickeln Sie dann die getrockneten Zellen in Alufolie ein und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.Mit einer vorgekühlten Rührmühle, die auf eine Schwingungsfrequenz von 20 Hertz eingestellt ist. Homogenisieren Sie das geerntete und gefrorene Pflanzenzellmaterial zwei Minuten lang zu einem feinen Pulver. Anschließend werden drei Gramm des gemahlenen Pulvers pro Probe mit flüssigem Stickstoff aliquotiert, um ein Auftauen zu verhindern.Anschließend wird das gemahlene Pulver mit einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Mörtel mit drei Millilitern eiskaltem Lysepuffer verzerrt, bis es auftaut. Teilen Sie die aufgetaute Probe sofort in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.817 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zelltrümmer zu entfernen.Während die Probe zentrifugiert wird, aliquotieren Sie 100 Mikroliter IgG-Sepharosekügelchen pro Probe. Fügen Sie einen Milliliter Lysepuffer hinzu und suspendieren Sie die Kügelchen durch Vortexen. Schleudern Sie drei Sekunden lang bei 2.000 g und verwerfen Sie den Lysepuffer.Zum Schluss resuspendieren Sie die Kügelchen in 400 Mikrolitern Lysepuffer. Nach der Zentrifugation werden drei Milliliter des klaren Pflanzenlysats in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie die voräquilibrierten Kügelchen in das Pflanzenlysat und inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad.Füllen Sie die Mischung in eine Spritze, die mit einem Köder verbunden ist, der mit einem Köder verschlossen ist, an einer Spinsäule mit einem 35 Mikrometer großen Filter, der sich oben auf dem Vakuumverteiler befindet. Führen Sie das Lysat durch das Gerät, indem Sie die Vakuumpumpe mit leichtem Druck einschalten, um eine Beschädigung der Kügelchen zu vermeiden. Das ungebundene Lysat wird in die an der Basis im Verteiler befindliche Abfallstation abgelassen und die Proteinkomplexe, die an die Kügelchen gebunden sind, verbleiben auf dem Filter.Sobald die Spritze aus dem Zelllysat entleert ist, fügen Sie 10 Milliliter Waschpuffer hinzu, um die Kügelchen zu waschen. Fügen Sie dann Milliliter Elutionspuffer hinzu, um den zweiten Waschschritt durchzuführen. Entfernen Sie nun die Spritze und die Köderverschlusskappe.Schließen Sie die untere Kappe an der Säule und geben Sie 400 Mikroliter des Elutionspuffers, der 50 Einheiten der verstärkten Form des Tabakätzvirus, der Protease, enthält, zu den Kügelchen. Stellen Sie die Säule auf einen Tischschüttler, der 30 Minuten lang bei 16 Grad Celsius auf 1.000 U/min eingestellt ist. Geben Sie dann weitere 50 Einheiten der Protease in die Säule und inkubieren Sie die Mischung auf dem Shaker wie im vorherigen Schritt.Entfernen Sie als Nächstes die untere Kappe und setzen Sie die Säule in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein. Eine Minute lang bei 20.817 g zentrifugieren, um das Eluat zu sammeln und mit der Protein- und Metabolitenextraktion fortzufahren. Um die Extraktion zu beginnen, fügen Sie dem Eluat einen Milliliter drei bis eins bis eins MTBE Methanol-Wasserlösungsmittel hinzu.Drehen Sie das Röhrchen um, um es mit der Probe zu mischen. Fügen Sie dann 0,4 Milliliter von ein bis drei Methanol-Wasserlösungen zu der Mischung hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um die Probe zu mischen. Anschließend wird die Probe bei 20.817 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um eine Phasentrennung zu ermöglichen.Entfernen Sie mit einer manuellen Ein-Milliliter-Liquid-Handling-Pipette die obere Phase, die Lipide enthält. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter Methanol hinzu und drehen Sie das Röhrchen um, um die Probe zu mischen. Bei 20.817 g zwei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren und die polare Phase in einem neuen Röhrchen für Metabolitenmessungen auffangen.Lassen Sie etwa 50 Mikroliter der polaren Phase am Boden des Röhrchens, um ein Verdrängen des Proteinpellets zu vermeiden. Trocknen Sie anschließend das Rohr mit der polaren Phase über Nacht in einem Zentrifugalverdampfer. Trocknen Sie die Tuben mit den Proteinpellets 30 bis 60 Minuten lang, um ein Übertrocknen zu vermeiden.Mit Hilfe einer einstufigen Affinitätsreinigung und Massenspektrometrie wurden Protein-Protein- und Protein-Metaboliten-Wechselwirkungen in transgenen Arabidopsis thaliana-Zellkulturen identifiziert. Zellkulturen, die NDPK1 exprimieren, zeigen eine signifikante Anreicherung von Valin-Leucin, Isoleucinglutamat, Leucin-Isoleucin und Isoleucin Phenylalanin im Vergleich zu Proben mit leeren Vektoren, NDPK2 und NDPK3. Um nach bekannten Protein-Protein- und Protein-Metaboliten-Wechselwirkungen zu suchen, werden 13 Proteine und vier Dipeptide, die mit NDPK1 ko-eluieren, mit der Stichdatenbank abgeglichen.Die Hauptassoziationen bestehen zwischen dem APX1-Ortholog und der Aldehyddehydrogenase-Familie sowie dem Translationsinitiationsfaktor FBR12 und dem Alpha-Homolog des Translationsinitiationsfaktors zwei Untereinheiten. Die identifizierten Dipeptide zeigen keine berichteten Proteinpartner. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Proben, Geräte und Reagenzien während des gesamten Experiments kalt zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die Thermophorese des Mikroskops oder der Aktivitätsassay, durchgeführt werden, um die direkte Wechselwirkung zwischen Molekülen oder die Inferenz ihres Liganden auf die Proteinaktivität zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie während des gesamten Verfahrens mit der Probe umgehen müssen, um vertrauenswürdige Ergebnisse zu erhalten und Liganden des von Ihnen gewählten Proteins zu identifizieren.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Methanol und MTBE-Lösung äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden, und es sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Arbeiten unter dem Abzug.

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Forschung

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Biochemistry

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