Name: Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Lernen Sie die Analyse dynamischer Proteinkomplexe mit Biolayer-Interferometrie, Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Anthrax-Toxin-Assemblierung in verschiedenen pH-Umgebungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Madison und Lila selbst Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomedizinische Forschung Ausbildung Programm (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU-Bridging-Fonds und das Biomolekül Interaktion Technologien Center (BITC) Grant ( CT und MTF). Die Autoren möchten Barbara Fegley KUMC Elektronenmikroskopie Kern danken für Unterstützung mit TEM Bildaufnahme.

1. Montage der definierten makromolekulare Komplexe auf Biolayer Interferometrie (BLI) Biosensor Oberflächen
<ol><li>
Montage von prepore Milzbrand Toxin Komplex auf einer PDEA geändert Amine reaktive Biosensor Oberfläche
	<ol>
<li>Hydrat ein reaktives Amin zweiter Generation (AR2G) BLI Biosensor Tipp in 250 µL Wasser zehn Minuten lang.</li>
		<li>Programm Schritt Zeiten, auf die Software bedienen des Geräts BLI in Tabelle 1aufgeführt (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Starten Sie den BLI laufen durch Eintauchen der Biosensor-Spitze in 250 µL Wasser für 30 s, eine erste Grundlinie der Biosensor Dicke und Dichte zu messen.</li>
		<li>Aktivieren der Biosensor durch Eintauchen der Spitze in 250 µL 50 NHS (N-Hydroxysuccinimide) und 200 mM EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) für 7 Minuten.</li>
		<li>Tauchen Sie die aktivierte Biosensor in 50 mM PDEA (2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) in 0,1 M Borat Puffer (pH 8,5) für 5 Minuten, eine aktivierte Thiol-reaktiven Oberfläche erzeugen aufgelöst.</li>
		<li>Tauchen Sie die aktivierte Thiol-reaktive Biosensor in 250 µL Lösung mit 100 nM E126C LFN 10 mM Natrium Acetat pH 5,0, 100 mM NaCl, Puffer für 5 Minuten.</li>
		<li>Tauchen Sie die Spitze der LFN in 50 mM L-Cystein, 1 M NaCl, 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0, 4 Minuten, um alle verbleibenden freien Thiol-reaktive reaktivgruppen zu stillen.</li>
		<li>Tauchen Sie die abgeschreckt LFN Tipp in 50 mM Tris, 50 mM NaCl für 2 Minuten Puffer Grundlinie etablieren.</li>
		<li>Tauchen Sie abgeschreckt LFN Tipp in 0,5 µM schützendes Antigen Prepore (PAPrepore), 50 mM Tris, 50 mM NaCl 5 Minuten um die LFN-PAPrepore Komplex zu schaffen.</li>
		<li>PAPrepore verbunden ist, entfernen Sie die Spitze von der PA-Prepore -Lösung und Tauchen Sie die Spitze in 50 mM Tris, 50 mM NaCl für 30 Sekunden unspezifisch gebundenen PAPreporeabzuwaschen.</li>
		<li>Tauchen Sie den LFN-PA-Prepore Komplex in 0,5 µM CMG2 Rezeptor (ohne die transmembrane Domäne), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, für 5 Minuten.</li>
		<li>Tauchen Sie die LFN-PAPrepore -CMG2 Komplex in 50 mM Tris, 50 mM NaCl für 30 Sekunden um alle ungebundenen CMG2 Form Pre-Endosomal Komplex abzuwaschen.</li>
		<li>Release für EM-Analyse, die LFN-PA-Prepore-CMG2 Komplex von der Biosensor-Spitze durch Eintauchen der Spitze in 5 µL 50 mM DVB-t, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, in einem PCR-Rohr.</li>
		<li>Release für Tandem-MS-Analyse der Peptide aus dem Komplex, der LFN-PA-Prepore-CMG2 Komplex von der Biosensor-Spitze durch Eintauchen der Biosensor in 5 µL 50 mM DVB-t, 6 M GuHCl (Keratin-frei), 25 mM Ammonium Bicarbonat pH 8.0 innerhalb einer PCR tube . Dies erfolgt auf verschiedenen Biosensor als jene für die EM-Analyse verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage der Pore Milzbrand Toxin Komplex auf PDEA geändert Amine reaktive Biosensor Oberfläche
	<ol>
<li>Um die Anlage nach dem pH-Wert Übergang anzuzeigen, führen Sie Schritte 1.1.1-1.1.12 im vorherigen Abschnitt, um die LFN-PAPreporegenerieren-CMG2-Komplex.</li>
		<li>Tauchen der Biosensor-Spitze in einer 10 mM Acetat pH 5.0 für 5 Minuten, um den Übergang von der PAPrepore PApore Übergang zu initiieren. Dieser Übergang wird durch Erhöhung der Amplitude (ca. 0,2 nm) gefolgt von einem größeren Rückgang der Amplitude, die Hypothese ist zu erheblichen oder komplette Rezeptor Dissoziation Bindungsaffinität vermindert.</li>
		<li>Tauchen Sie LFN-PApore Tipp in 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0, für 30 Sekunden, um sauren Puffer abwaschen.</li>
		<li>Für die EM-Analyse-Probe Tauchen der Biosensor-Spitze in eine Lösung mit 1,25 mM Micellen (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-Cholate 162,5 mM POPC) für 5 Minuten, um zu verhindern, dass Aggregation in Lösung nach Disulfid-release.</li>
		<li>Für EM-Analyse release LFN-PAPore -Micelle Komplex von der Biosensor-Spitze durch Eintauchen der Spitze in 5 µL 50 mM DVB-t, 50 mM Tris, 50 mM NaCl in einem PCR-Rohr.</li>
		<li>Für Tandem-MS-Analyse der Peptide aus dem Komplex-release die LF TippN-PAPoore Komplex (keine Micelle) aus der Biosensor durch Eintauchen der Biosensor in 5 µL 50 mM DVB-t, 6 M GuHCl (Keratin-frei), 25 mM Ammonium Bicarbonat pH 8.0 innerhalb einer PCR Rohr. Dies erfolgt auf verschiedenen Biosensor als jene für die EM-Analyse verwendet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Visualisierung und Validierung veröffentlicht Makromolekulare Versammlungen von BLI Biosensoren durch Negative Fleck-Elektronen-Mikroskopie
<ol><li>Glow discharge ein Kohlenstoff-beschichtete Cu 300 Raster. Typische glühen Einregulierung Entlastung 0,38 mBar stabile Atmosphärendruck, negative 15 mAmps 20 Sekunden, dann mit Luft entlüften.</li>
	<li>Raster zwischen sauberen Pinzette zu sichern.</li>
	<li>Pipette 4 µL veröffentlichten komplexe Probe im PCR-Rohr auf das Gitter und Adsorption für 60 s zu ermöglichen.</li>
	<li>Docht entfernt verbleibende Flüssigkeit mit einem Filterpapier Keil.</li>
	<li>Färben Sie das Raster durch pipettieren 5 µL von 0,75 % 0,02 Mikron gefiltert Uranyl Formiat und Feuchtigkeitstransport Weg überschüssige Fleck nach 5 Sekunden. Lassen Sie Raster bei Raumtemperatur trocknen.</li>
	<li>Blick auf Probe Gitter mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop gebeizt.</li>
</ol>3. Identifizierung der komplette Pre-Endosomal Anthrax Toxin Komplex (LFN-Pa-Prepore-CMG2) und Transitioned Komplex (LFN-Papore ohne CMG2) mittels Massenspektrometrie.
<ol><li>Verdünnen Sie veröffentlichte Proben 20 µL und inkubieren Sie für 1 Stunde.</li>
	<li>Fügen Sie 2 µL 55 mM Iodoacetamide, 25 mM Ammonium Bicarbonat, pH 8.0 und inkubieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln (mit Alufolie abgedeckt).</li>
	<li>Verdünnen Sie die Probe mit 100 µL 25 mM Ammonium Bicarbonat, pH 8.0, Guanidin-Hydrochlorid-Konzentration unterhalb von 1 M zu reduzieren.</li>
	<li>5 µL der Sequenzierung Grade modifiziert Trypsin auf 20 ng/µL hinzufügen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Hinzufügen einer Endkonzentration von 5 % auf den pH-Wert zu senken, Eisessig < 3, dann reduzieren Sie die Lautstärke auf 10 µL im Vakuum Konzentrator.</li>
	<li>Übertragen Sie die peptidlösung auf den Autosampler nLC 1200 uHPLC auf Probenteller.</li>
	<li>Laden Sie 5 µL auf der Bühne der Ionisation der MS die peptidlösung auf einem uHPLC reversed-Phase Säule montiert.</li>
	<li>Waschen Sie Spalte mit 15 µL 0.1 % Ameisensäure mit einer maximalen Rate von 5 µL/min / max. Druck von 800 Psi.</li>
	<li>Eluieren Sie Peptide aus der rückgängig-Phase C18-Spalte mit einer Durchflussrate von 350 nL/min über einen Zeitraum von 90 min mit einem linearen Farbverlauf von 5 % bis 40 % des Lösungsmittels B in A + B (Lösungsmittel A: 0,1 % Ameisensäure; Lösungsmittel B: 95 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure).</li>
	<li>Medikamentenfreisetzende Peptide auf Linie mit Tandem MS zu analysieren.<ol>
<li>Legen Sie die Ionisierung Quelle 2500 Volt und Ionen-Transfer Temperatur bis 250 ° C.</li>
		<li>Arbeiten mit dem Massenspektrometer unter Automatische Steuerung kontinuierlich eine MS gefolgt von so vielen Tandem MSM möglichst innerhalb von 3 s, Scannen mit CID und eine normalisierte Aufprallenergie von 35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peptid und Protein-Komponenten mit Standardmethoden zu identifizieren. Für diese Arbeit wurden zwei Sätze von Peptid und Protein-Analyse durchgeführt.</li>
</ol>

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<li>Naik, S., Kumru, O. S., Cullom, M., Telikepalli, S. N., Lindboe, E., Roop, T. L., Joshi, S. B., Amin, D., Gao, P., Middaugh, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+structurally+altered+and+aggregated+states+of+therapeutically+relevant+proteins+using+GroEL+coupled+to+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Probing structurally altered and aggregated states of therapeutically relevant proteins using GroEL coupled to bio-layer interferometry.</a> Protein Science. 23, 1461-1478 (2014).</li>
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<li>Grantham, J., Llorca, O., Valpuesta, J. M., Willison, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+occlusion+of+both+cavities+of+the+eukaryotic+chaperonin+with+antibody+has+no+effect+upon+the+rates+of+beta-actin+or+alpha-tubulin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Partial occlusion of both cavities of the eukaryotic chaperonin with antibody has no effect upon the rates of beta-actin or alpha-tubulin folding.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 4587-4591 (2000).</li>
<li>Ercius, P., Alaidi, O., Rames, M. J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Tomography%3A+A+Three-Dimensional+Analytic+Tool+for+Hard+and+Soft+Materials+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electron Tomography: A Three-Dimensional Analytic Tool for Hard and Soft Materials Research.</a> Advanced Materials. 27, 5638-5663 (2015).</li>
</ol>

Keine Angaben zu diesem Zeitpunkt.

Diese Demo wird veranschaulicht, wie makromolekularen Komplexbildung leicht überwacht werden kann, mit Biolayer Interferometrie mit EM visualisiert, und überprüft mit MS, alle mit Microvolumes in einer kurzen Zeitspanne. Strukturelle Montage und beobachteten komplexe die biologisch relevanten Vorhersagen, weitere Validierung dieser kombinierten Methode zu folgen. Wie im Abschnitt "Ergebnisse" erwähnt, erfordert das Schlüsselelement für den Erfolg der Versammlung rational konstruiert Cystein Mutagenese um sicherzustellen, dass die Protein-Protein-komplexe Schnittstellen von der Biosensor-Oberfläche richtig ausgerichtet sind.
Bisherige Systemen habe BLI und MS Techniken, um Proteinbindung von zwei und drei-Komponenten-Systeme sowie Integrität der Rezeptorbindung exprimierten Proteins zu bewerten, aber in beiden Fällen die Methoden wurden nicht entwickelt, um das Tandem EM/MS nutzen 8,9zu nähern. Die nur andere Interferometrie-System, das MS-Analyse helfen, Interaktionen prägen kombiniert wurde eine Dual-Polarisation Interferometrie10. Leider ist dieses System nicht mehr für den allgemeinen Gebrauch zur Verfügung. Wie in der Einleitung erwähnt, gab es eine Reihe von Studien abgeschlossen, wo Proben auf SPR-ähnliche Biosensor Oberflächen gebildet und MS-Analyse entnommen wurden. Keines dieser Beispiele führte in komplexen mit EM visualisiert.
Die Grenzen dieser sequenziellen Methode können zahlreiche sind aber lösbar. Für die anfängliche Ruhigstellung und daher Stiftung Schritt der Versammlung würde mangelnde Kenntnis der strukturellen Interaktion Oberflächen behindern sicherlich Fortschritte überwachen Erstmontage Phasen zugeordnet. Das Fehlen von Strukturinformationen angesprochen werden kann, indem Sie entwerfen ein veränderter Stiftung errichten wo Anlage Chemikalien (z. B. Sulfhydryl Glyko-Disulfid Verbindungen / His-Tag Positionierung) können in verschiedenen Regionen innerhalb des Kerns verschoben werden Montage-System. Im Falle der Milzbrand Giftstoff komplex war es ein Glück, dass die Struktur der LFN PAPrepore verpflichtet zur Verfügung11ist. Rationelle Platzierung von veränderter Cystein wurde in Regionen abseits der PAPrepore Bindung Gesicht lokalisiert. Mit Cystein Gestänge Chemikalien ist es vorzuziehen, dass keine andere reaktive Cysteine auf der Oberfläche Protein vorhanden sind.
Es gibt verschiedene Anlage-Chemikalien, die verwendet werden können, bestimmte Anlage Website auf ein Protein Oberflächen zu konstruieren. Eine der beliebtesten spezifische Anlagen beinhaltet Positionierung eine Biotin Glyko-an einer genau definierten Stelle auf der Oberfläche Protein-12. Leider, Biotin-Bindung zu einem Streptavidin oder Avidin beschichtete Oberflächen ist ziemlich eng. Umkehrung der Bindung Interaktion ist nicht einfach. Die Verwendung von ein veränderter His-Tag an der N - oder C-Terminus und die spätere einfache Befestigung an Ni-NTA-Oberflächen ist ein universeller Anwendung der Affinität Immobilisierung. Die Vorbehalte für Montage Befestigung technikstandorte mit seinem getaggt Systeme gehört natürlich die Anforderung, die die N - und C-Termini der Core-Montage-Protein bleiben ausgesetzt und getrennt, so dass die Anlage einfach ist. Als muss die Interaktion-Schnittstelle des Core-Montage-Protein mit allen Montageprozesse, im Laufe des komplexen Baugruppe verfügbar bleiben.
Vielleicht ist das häufigste Anliegen der Biosensor Oberfläche Chemikalien mit unspezifischen Bindung. Streptavidin-Tipps sind oft eine Quelle der erheblichen unspezifischen Bindung Effekte. Disulfid verknüpft Biotin kann verwendet werden, um ganz bestimmte komplexe hinterließ die reduzierten S-Biotin-Verknüpfung fest gebunden an immobilisierte Streptavidin Biosensoren13freizugeben. Es gibt andere reversiblen Chemikalien immer zur Verfügung, wie z. B. Iminoboronates und zu einem geringeren Ausmaß Ketoamide14. Dieses Feld ist derzeit unterentwickelt, aber es gibt großes Interesse an der Weiterentwicklung von reversible kovalente Protokolle, um off-Target Drogenwirkungen Toxizität zu vermeiden, die häufig den Einsatz von kovalenten zielgerichtete Medikamentenentwicklung begleiten.
Eine Einschränkung der Verwendung von EM, um komplexe zu visualisieren ist Interpretation, vor allem in Fällen, wo die Strukturen der montierten Anlagen zunächst nicht bekannt sind. Die räumliche Lage von Komponenten in einem undefinierten montierten Makromolekulare Komplex kann unter Verwendung monoklonaler Antikörper (mAb) als spezifische kinetische und strukturelle Marker identifiziert werden. Zum Beispiel, sobald ein Komplex gebildet wird, können monoklonale Antikörper hinzugefügt werden, auf bestimmte Komponenten binden. Diese Methode wird häufig in EM verwendet, um bestimmte Komponenten innerhalb von großen Baugruppen15zu identifizieren. Eine weitere Einschränkung bezieht sich auf die Größe der Anlage, zwar gab es Fälle wo definierte symmetrische Querschnitte so klein wie 70 kDa (GroES Heptamer) sind leicht gelöst mit negative Fleck EM. Montierte Anlagen, die durch EM analysiert werden sind in der Regel in der Größenordnung von ~ 100 Å Durchmesser oder höher. Vor kurzem jedoch so klein wie 20 kDa Proteine aufgelöst wurden und niedriger Auflösung Strukturen bei Superior Färbung Methoden16gewonnen wurden.
Für MS-Analyse kann die erhöhte Empfindlichkeit der aktuellen MS Instrumentierung bis auf die Ebene der femtomolare (Attomoles) in einigen Fällen die Nachweisempfindlichkeit BLI erhöhen. Es ist sehr denkbar, dass Protein-Signale, die einen minimale aber wiederholbaren Anstieg der Amplituden zeigen Identifikation des betreffenden Proteins führt. Darüber hinaus führt sondieren Proteinprotein Interaktionen mit einem der Partner auf der Biosensor und andererseits in einem zellulären Milieu angebracht in der Tat eine Reinigung und anschließend leichter Erkennung des neu gebildeten Komplexes. Eine Einschränkung, die mit den aktuellen hochempfindlichen MS-Systemen zu beachten ist, dass das Protein des Interesses möglicherweise nicht in der Datenbank, aber diese Beobachtung selten ist (z. B. Proteome von seltenen Arten). Wenn die Sequenzen der interessierenden Proteine bekannt sind, ist dieses Problem leicht gelöst, durch die Aufnahme der Aminosäure-Sequenz benutzt in einer Hintergrund-Protein-Datenbank (wie in dieser Arbeit im Protokoll Abschnitt beschrieben). Eine weitere mögliche Einschränkung der Methodik resultieren aus den Widerstand eines Proteins an Trypsinolysis. Trypsin-Verdauung ist in der Regel die Standardmethode für Bottom-up Proteinidentifikation. Proteine können jedoch resistent gegen Trypsin sein, wenn sie nicht Arg und Lys Rückstände oder Zugriff auf diese Rückstände werden durch die gefaltete Struktur begrenzt. Diese Einschränkungen werden jeweils durch Alternative oder eine Kombination von Proteasen oder auch einer sich entfaltenden Reagenz (Harnstoff oder Guanidin HCl, gemäß 1.1.14 und 1.2.6) vor enzymatischen Verdauung aufgelöst.
Mögliche Erweiterungen dieser Methodik sind erlaubt dem Benutzer, zu folgen und zelluläre Montage komplexe aus Rohöl zellulären Lysates zu identifizieren. Wie sich herausstellt, Tests für Baugruppenkomponenten in konzentrierter Zellextrakten ist einfach durchzuführen, unter Verwendung der Biolayer Interferometrie Verfahren. Im Gegensatz zu den häufiger verwendeten mikrofluidischen basierte Methoden sind anfällig für Verstopfung und sensible Aggregation, BLI-Ansatz lässt sich direkt Biolayer Sensor Tipps in groben Extrakte zusammenzubauen möglicherweise bestimmte komplexe direkt eintauchen aus diesen konzentrierten unreinen Proben. Einmal montiert, ist es durchaus möglich mit spezifischer Antikörper Sonden im Nachgang zu der BLI-System weiter zu identifizieren und sogar quantitate Verdacht Komponenten in Zellextrakten, die identifiziert wurden mit der Microvolume MS-Methode. Wieder ist hier der Schlüssel zu definierten, richtig ausgerichtet Kern Proteine verwenden Sie als spezifische Affinität Sonden.
Die Möglichkeit, die Prepore um Übergangsprozess kinetisch mit BLI pore anzeigen werden sehr nützlich bei der Identifizierung von potenziellen "Antitoxin" niedermolekularer Hemmer der Protein-Übergänge, die speziell unter späten Endosomal, niedrigen pH-Wert (5.0) Funktion Bedingungen. Dieser pH-Wert induzierte Prepore, Übergang pore gehemmt wird in Anwesenheit von Stabilisator (osmolyten) wie Glycerin oder Saccharose Falten und verleiht so starke Unterstützung für die Entwicklung von spezifischen gezielte klappbarer Stabilisatoren, die PA zu verhindernpore Formation. Diese spezifischen Ansatz vermeidet und ersetzt grobe Aggregation basierende Assays wo pH führen zu Eiweiß Niederschlag fällt. Diese letztere Methode führt zwar gut für die Vorsortierung Hauptmethoden, häufig zu falsch positiven Ergebnissen wo hemmen bestimmte Verbindungen, die Aggregation, anstatt die tatsächlichen molekularen Übergänge.
Die nachgeschaltete Beobachtungen der Struktur und Identifikation der montierten Einzelkomponenten in kleinen Microvolume Proben können auch bei der Validierung von potenziellen Bleiverbindungen nützlich sein. Dies kann in Fällen angewendet werden, wo bestimmte Baugruppe Stabilisierung oder Destabilisierung das Zielergebnis ist. Diese kinetische/Struktur/Identifikation parallelen Ansatz eignet sich für die Gültigkeit dieser Verdacht Blei zusammengesetzte Effektoren der Versammlung direkt bestätigen und dient als eine vernünftige sekundäre Screening Schritt oder mittleren Durchsatz Ansatz.
Cryo-EM ist eine nützliche Technik, um die atomare Details der Makromolekül-komplexe in verschiedenen Stadien der Versammlung zu studieren. Vor der Vorbereitung Cryo-EM-Proben, ist es wichtig, zunächst zu überprüfen, ob ein Präparat einigermaßen reinem homogenen komplexe mit negativen Fleck EM enthält. Hierin die vorliegende Arbeit zeigt Montage von Proteinkomplexen auf BLI Biosensor Oberflächen, Veröffentlichung dieser komplexe für EM-Visualisierung und Kennzeichnung dieser Bauteile mit MS. Diese besondere Methode der kontrollierten Versammlung und Freigabe ist nützlich bei der Erzeugung sehr spezifische Protokolle, die homogene sequentielle Probenvorbereitung für negative Fleck EM, ein notwendiger Schritt zu, die nachgewiesen werden muss verbessern, bevor voran zu Cryo-EM. Um niedrige Auflösung 3D Struktur zu erhalten, bräuchte nur 30-50 Partikel des Komplexes eine konische Tilt-Serie (70 verschiedenen 2D-Bild Ansichten pro Partikel) durchführen, vorausgesetzt, es gibt Orientierung Vielfalt (mehrere verschiedene Ansichten).
Im Hinblick auf die Verbesserung der MS Methoden, weiter Fortschritte in der Empfindlichkeit und Verringerung des Volumens der Probe zu verbessern. Nano-Flows und Ultra-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zusammen mit der Entwicklung von Massenspektrometern mit einem schnellen Duty Zyklus, erhöhte Empfindlichkeit und Auflösung. Kürzlich erfolgten Einführung der Orbitrap-Massenspektrometer, erleichtert insbesondere die neueste Version (Orbitrap Fusion Lumos und seine erwartete Nachfolger Orbitrap Fusion Lumos 1 M) als auch die Suchalgorithmen stark dabei.
Die aktuelle Methodik kinetische Montage und Demontage von Milzbrand-Toxin-Komponenten mithilfe von markierungsfreie BLI Methoden überwacht und bewertet die Struktur und die Identität dieser Komponenten mit EM und MS, bzw.. Die Verwendung von einem einfachen Einkanal BLI System gekoppelt mit Routine negative Färbung EM Analyse und elementare Techniken der MS sind mehr als ausreichend, um eine Montage zu charakterisieren.

Identifizieren und verstehen die Spezifität für Protein komplexen Baugruppe in Vivo ist extrem interessant für Biochemische Forscher. Großen heterogenen Protein Baugruppen sind eher die Regel als die Ausnahme. Dieser Begriff wird unterstützt durch spektroskopische Überwachung von in Vivo Montage, Isolierung mittels sanftere Zelle Störung Techniken, Produkte aus Affinität-basierte Reinigungsverfahren auswerten und visualisieren sie komplexe mit hoher Auflösung Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM). Um die Kontrolle der Montage Besonderheiten innerhalb der Zelle zu verstehen, müssen Forscher routinemäßig zu isolieren, zu identifizieren und letztlich charakterisieren diese dynamischen Montage/Demontage Strukturen. Die am stärksten genutzten Molekulare Werkzeug, um die Komponenten dieser Versammlungen häufig identifizieren erfordert Antikörper-basierten Immunopräzipitation, die auf komplexe Stabilität während Zellaufschluss beruht. Verschiedenen gekoppelte analytische Techniken wurden vor kurzem entwickelt, um komplexe aus Zellproben mit mikrofluidischen basierten Ansätzen, wie z. B. Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) zu erfassen. Nach Entnahme aus der SPR-Oberflächen wurden diese Proben von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Zeit des Fluges (MALDI-TOF)1,2analysiert. Weiterentwicklung dieser Methode unter Verwendung einfacher Protokolle erlauben Forschern zu visualisieren und zu validieren vorhergesagten komplexe, die in dem zellulären Milieu auftreten. Da SPR ein Mikrofluidik-basiertes System ist, ergeben sich Probleme oft aus Aggregatbildung. Umgehung dieses Problems erfordert Probenverdünnung, die wiederum die Integrität der Konzentration haftet biologische komplexe verringern kann.
Ein relativ neuer Fortschritt in markierungsfreie Technologien ist die Entwicklung der Biolayer Interferometrie (BLI) System3. Diese besondere Licht-basierte Reflexion, die Systeme replizieren, oder am besten zu emulieren, SPR Bindung und kinetische Ergebnisse zu einem Bruchteil der Kosten3,4 besonders wenn Einkanal-Einheiten verwendet werden. BLI misst Änderungen im reflektierten Licht Interferenzmuster zwischen einem Referenz-Layer (Kontrolle) und der Biolayer Oberfläche (experimentell). Die daraus resultierende Veränderung in Phase wird als kinetische und quantitative Ablesung5in Echtzeit gemessen. Die Biosensor-Oberfläche, mit spezifischen Immobilisierung Chemikalien, ist physisch zwischen Lösungen, im Gegensatz zu Puffer Änderungen von mikrofluidischen Ansätze in SPR, für Messungen über Wellenlänge Phase Durchbiegungen übertragen. Stoffaustausch Effekte werden durch Rühren der Lösung verhindert. Im Gegensatz zu SPR sind diese Systeme sehr nützlich bei der Bewertung von komplexen aus groben biologischen Proben. Die physikalische Parameter gemessen während BLI Experimente in erster Linie richtet sich nach einer Änderung der Masse oder Dicke an der Biosensor-Oberfläche, die aus Protein komplexe Montage bzw. Demontage ergibt.
Diese Faser faseroptische Biosensoren sind einfach zu bedienen und relativ preiswert. Einer der aufstrebenden nützliche Aspekte von BLI ist die einfache Entfernung der neu zusammengestellten Proteinkomplexe von der Oberfläche. Eine neuere Anwendung dieser Methode erlaubt unser Labor zu beobachten, die Real-Time-Kinetik der großen Skala pH induzierte Protein Struktur Neuordnung der Milzbrand Toxin schützendes Antigen (PA) Komponente, wie die Prepore (PAPrepore) umgestellt sein Pore (PA,pore) Form. Dieser Übergang an der Spitze der Biosensor wurde überprüft mittels Elektronenmikroskopie (EM)6. Entfernung von komplexen von Biosensor Oberflächen vermeidet größere Verdünnung Mengeneffekte häufig anzutreffen, wenn komplexe aus Chip Oberflächen freigibt, wenn Mikrofluidik-Systeme im Einsatz.
Bei den laufenden Arbeiten sind Milzbrand-Toxin-komplexe montiert und auf der Oberfläche der Biosensor zerlegt und dann in Mikroliter Bände veröffentlicht. Die daraus resultierenden komplexen Bauteile sind orthogonal mit EM und Massenspektrometrie (MS) validiert.

<table><tbody><tr><td>(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid)) (EDC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA)</td><td>GE Lifesciences</td><td>BR100058</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL schwarze Mikroröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688304-500EA</td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Anerkennung PepMap 50 &mu; m x 150mm, C18, 2 &mu; m, 100 & Aring;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164561</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure Gletscher</td><td>Fisher</td><td>A38SL-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Aminreaktive Spitzen der 2. Generation (AR2G)</td><td>Forte Bio</td><td>18-5092</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Fisher</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Anotop 10 Spritzenfilter, 0,02 um</td><td>GE Lifesciences</td><td>6809-1002</td><td></td></tr><tr><td>BLItz System</td><td>Pall Forte Bio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>Kapillares morphogenes Gen-2</td><td></td><td></td><td>Eigenproduziertes und gereinigtes</td></tr><tr><td>kohlenstoffbeschichtetes Cu 300 Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>CF300-CU-50</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>GoldBio</td><td>DTT25</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäuren</td><td>JT Baker</td><td>0129-01</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinhydrochlorid (GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505-100G</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>MP-BioMedicals,LLC</td><td>100-351</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cystienhydrochlorid-Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C121800-5G</td><td></td></tr><tr><td>Letaler Faktor N-terminale Domäne</td><td></td><td></td><td>Protein hergestellt und gereinigt in der hauseigenen MS-Software</td></tr><tr><td>Version 2.2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>090M14531V</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos</td><td>ThermoFisher PCR-Röhrchen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Pelco easiGlow Glow Discharge Reinigungssystem</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>Schützendes Antigen-Prepore</td><td></td><td></td><td>Eigenproduktion und -reinigung</td></tr><tr><td>Qualitative Filterpapierkreise</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-795C 5</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzierqualität modifiziertes Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Sequest HT Suchmaschine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1254-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Uranylformiat (UF)</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30487</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse dynamischer proteinkomplexe montiert auf und befreit biolayer interferometrie biosensor mit massenspektrometrie und elektronenmikroskopie

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In-vivo, Proteine sind häufig Teil der großen makromolekularen komplexe wo Bindung Spezifität und Dynamik letztlich funktionalen Ausgänge diktieren. In dieser Arbeit wird das Pre-Endosomal-Milzbrand-Toxin montiert und umgestellt in komplexen Endosomal. Erstens ist die N-terminale Domäne Cystein mutierte tödliche Faktor (LFN) ein Biolayer Interferometrie (BLI) Biosensor durch Disulfid Kupplung in eine optimale Orientierung, so dass schützendes Antigen (PA) Prepore (Kd 1 nM) binden beigefügt. Die optimal ausgerichteten LFN-PAPrepore komplexe dann bindet an löslichen Kapillare morphogenen Gen-2 (CMG2) Zelle Oberfläche Rezeptor (Kd 170 pM), was zu einem repräsentativen Milzbrand Pre-Endosomal Komplex, stabil bei pH 7,5. Montierten Anlage unterliegt dann Säuerung (pH 5,0) Vertreter der späten Endosom Umwelt PAPrepore in der Membran eingefügt Pore Zustand Übergang. Diese PApore Zustand führt in einer geschwächten Bindung zwischen den CMG2-Rezeptor und der LFN-PApore und eine erhebliche Dissoziation des CMG2 aus den Übergang Pore. Die Thio-Befestigung der LFN der Biosensor-Oberfläche ist leicht durch Dithiothreitol rückgängig gemacht. Reduktion auf der BLI Biosensor Oberfläche löst die LFN-PA-Prepore-CMG2 ternäre Komplex oder die Säure umgestellt LFN-PA-pore -komplexe in Mikroliter Volumen. Freigegebene Anlagen sind dann visualisiert und durch Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie identifiziert. Diese Experimente zeigen, wie die kinetische Montage/Demontage von bestimmten Proteinkomplexen markierungsfreie BLI Methoden zu überwachen und bewerten die Struktur und Identität der diese BLI komplexe durch Elektronenmikroskopie und Masse montiert Spektrometrie, bzw. einfach replizieren sequentielle Verfahren verwenden.

Die Fähigkeit zu überwachen und zu validieren, die Versammlung der großen makromolekularen komplexe ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Spezifität und Funktionalität des großen biomolekularen Baugruppen. Die Ergebnisse der hier vorgestellten Methoden zeigen die Leichtigkeit, mit welcher große Proteinkomplexe (&gt; 150 kDa Masse) mit Biolayer Interferometrie, alle während der Überwachung der Kinetik und der Amplitude der Baugruppe montiert werden kann. Die einzigartige Kompaktheit der Biosensor Oberfläche ermöglicht eine Montage Analyse erweitert werden, durch Freisetzung von montierten Anlagen in kleine Microvolumes. Diese Microvolumes kann verwendet werden, um die erste physikalische Struktur der komplexe mit EM zu visualisieren und die Identität des komplexen Komponenten mit MS. Abbildung 1zeigt ein schematischer Überblick über diesen Gesamtprozess.
Ein Schlüsselelement für die erfolgreiche Montage und Überprüfung der Makromolekulare Komplex auf der Biosensor-Oberfläche beinhaltet die richtige Ausrichtung des Proteins Startwert. Dies sorgt dafür, dass die Protein-Protein Interaktion Websites zugänglich, nicht sterisch blockiert und Weg von der Biosensor-Oberfläche optimal positioniert sind. Wie in Abbildung 2dargestellt, wird die korrekte Ausrichtung des komplexen Milzbrand-Toxins erreicht, indem ein speziell entwickelte N-terminale Fragment des tödlichen Faktor (LFN) sodass die LFN-PA-Prepore -Bindungsstelle immer positioniert wird Gegenteil der Biosensor kovalente Bindung Seite6,7. Der nachfolgende Aufbau des Komplexes mit Bindung von PA an der LFN BLI Biosensor gefolgt von löslichen CMG2 Bindung an PA schafft letztlich eine Translokation zuständigen Milzbrand Toxin Komplex.
BLI Sensogram Spur ist ein Echtzeit-Lesen aus der Amplitude Veränderungen durch bestimmte Zugabe der Milzbrand-Toxin-Komponenten auf der Biosensor hinzugefügt werden. Abbildung 3 zeigt ein Modell des Komplexes voraussichtlich Form bei diesem Schritt in diesem Prozess eine repräsentative Spur zugeordnet. Der erste Aufstieg ist LFN Verladung auf die Spitze. Nach dem abschrecken und Grundlinie, PAPrepore bindet dann an LFN gefolgt von dem Zusatz von löslichen CMG2 Rezeptor, was zu den versammelten Pre-Endosomal-Komplex der LFN-PAPrepore-CMG2. Fortschritt gegenüber der späten Endosom Umwelt, unterliegt der gesamte Komplex einen niedrigen pH-Wert Puls (pH 5,0), die den Rezeptor binden, so dass die Prepore für den Übergang zu seiner erweiterten Membran eingefügt Pore Konformation schwächt. 6 Sensogram Spuren von der Versauerung Schritt sind in Abbildung 4dargestellt. Die anfängliche Zunahme oder "Stachel" Amplitude ist wahrscheinlich die Pore Verlängerung6 , der vor der Abnahme in der CMG2-Rezeptor-Bindung erfolgen muss. Der größere Amplitude Rückgang ist wahrscheinlich erhebliche oder komplette Rezeptor Dissoziation aufgrund verminderter Bindungsaffinität. Frühere Arbeiten in diesem Labor angegeben, dass CMG2 Bindung an die voll ausgefahrenen PApore vernachlässigbar im Vergleich zu den CMG2-PAPrepore Interaktion6. Darüber hinaus beobachtet die kinetische Spur von Sensogram in allen Sensograms der LFN-PAPrepore-CMG2 Übergänge, LFN-PA mit einem pH-Tropfen,pore ist reproduzierbar über mehrere Durchläufe.
Vor und nach der Säuerung der Biosensor befestigt-komplexe leicht zur Visualisierung von negativen Fleck EM und Identifikation von MS (Abbildung 5) freigegeben. Repräsentative komplexe aus der EM-Ergebnisse sind in Abbildung 6dargestellt. Pre-Endosomal Probe Raster zeigen dichten Einklang mit intakten ternäre komplexe bestehend aus LFN-PA-Prepore-CMG2. Post-Versauerung komplexe Netze zeigen PA umgestellt um pore und solubilisiert durch Einbeziehung der Micelle mit keine offensichtliche CMG2 Dichte.
Die Identitäten von der Pre- und Post-Übersäuerung-komplexe wurden durch MS überprüft. Eine Datenbank wo die Sequenzen von PA, P13423; LFN, P15917; und CMG2, P58335 wurden in einem Hintergrund einer Maus-Proteine-Datenbank abgeleitet aus dem NCBInr-Repository aufgenommen. Nur der interessierenden Proteine stammen aus dieser ersten Datenbank-Suche, mit der folgenden Aminosäure-Abdeckung für die ternären und binären komplexe: 54 % und 22 % PA, 36 % und 6 % für LF und 43 % für CMG2, bzw. (CMG2 wurde auf die binäre Anlage nicht erkannt). Um die Protein-Aminosäure-Berichterstattung zu maximieren, erfolgte eine zweite Peptid/Proteinidentifizierung mittels einer Proteindatenbank enthält nur die drei Proteine des Interesses. Pre-Endosomal MS Proben enthalten Peptide aus allen drei Toxin-Komponenten mit 60,46 % und 67.97 % 54,15 % Abdeckung für LFN, PA und CMG2, bzw. (Abbildung 7). In Abbildung 8dargestellten Ergebnisse Post-Endosomal enthielt nur Peptide aus LFN und PA (57.41 % und 67,79 % Abdeckung, beziehungsweise). Der Mangel an CMG2 in den Post-Endosomal Proben stehen im Einklang mit der beobachteten BLI nm Abnahme während der Porenbildung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig1.jpg"> Abbildung 1. Schematische Übersicht zur Analyse von Proteinkomplexen auf montiert und isoliert von BLI Biosensor mit EM und MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig2.jpg"> Abbildung 2. Biosensor-Aktivierung: der erste Schritt in bestimmten Assembly Ausrichtung auf BLI Biosensor. E126C Lethal Faktor N-terminale Domäne, (LFN) ist durch eine Thio-Verknüpfung erstellen die richtig orientierte PAPrepore verbindliche Schnittstelle verbunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig3.jpg"> Abbildung 3. Überwachung von Milzbrand-Toxin-Montage und Demontage mit BLI: der Sensogram zeigt Veränderungen der Amplitude als Funktion der Zeit durch spezifische Ergänzung der Anthrax Toxin-Komponenten auf der Biosensor, beginnend mit dem LFN laden (Schritt 4 hinzugefügt werden ( Tabelle 1). PAPrepore wird dann auf der Oberfläche, gefolgt von dem Zusatz von löslichen CMG2 Rezeptor geladen. Der montierte Pre-Endosomal-Komplex besteht aus einem LF-PAPrepore- CMG2. Fortschritt gegenüber der späten Endosom Umwelt, montieren die gesamte funktionale Milzbrand Toxin unterliegt einem niedrigen pH-Wert Puls (pH 5,0), die den Rezeptor binden, so dass die Prepore für den Übergang zu seiner erweiterten Membran eingefügt Pore Konformation schwächt. Exposition der Membran überspannt Pore ist bestätigt und durch Zugabe von Micellen solubilisiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig4.jpg"> Abbildung 4. BLI Sensogram CMG2 Release: Spuren von der Versauerung Schritt zeigen eine erste Erhöhung oder "spike" in der Amplitude gefolgt von einem größeren Rückgang der Amplitude, die dürften pore Formation und Rezeptor Dissoziation. Vertikale gepunktete rote Linien bezeichnen Start eines neuen Schrittes. Sensograms sind in den fettgedruckten gepunktete rote Linie ausgerichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig5.jpg"> Abbildung 5. Analyse von Protein-komplexe auf montiert und isoliert von BLI Biosensor mit EM und MS: Biosensor beigefügte Anlagen leicht in 5 µL Puffer mit DVB-t erscheinen für die Visualisierung von negativen Fleck EM und Identifikation von Frau <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig5large.jpg" target="_blank">, klicken Sie bitte hier eine größere Version dieser Figur sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig6.jpg"> Abbildung 6. Visualisierung von Proteinkomplexen mit EM: Pre-Endosomal Probe Raster zeigen dichten Einklang mit intakten ternäre komplexe bestehend aus LFN-PA-Prepore-CMG2. Post-Endosomal komplexe Netze zeigen PA umgestellt um pore und solubilisiert von Micelle mit keine offensichtliche CMG2 Dichte. Modelle der vorhergesagten komplexe (linke Seite) sind in der gleichen Größenordnung wie einzelne Partikel angezeigt. Partikel mit prognostizierten Protein (basierend auf Größe des EM-Dichte) eingefärbt werden unterhalb jedes Partikel angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig7.jpg"> Abbildung 7. Überprüfung der Proteinkomplexe mit MS: Pre-Endosomal MS Proben enthalten Peptide aus allen drei Toxin-Komponenten mit 60,46 % und 67.97 % 54,15 % Abdeckung für LFN, PA und CMG2, beziehungsweise. Peptide mit einer false Discovery Rate (FDR) gleich oder größer als 5 % in gelb angezeigt, FDR gleich oder größer als 1 % in grüner Schrift angezeigt erkannt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57902/57902fig8.jpg"> Abbildung 8. Überprüfung der Proteinkomplexe mit MS: Post-Endosomal Proben enthalten Peptide aus LFN und PA (57.41 % und 67,79 % Abdeckung, beziehungsweise), aber nicht CMG2. FDR gleich oder größer als 5 % in gelb angezeigt, FDR gleich oder größer als 1 % in grüner Schrift angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57902/57902fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Zeit (s)</td>
			<td>Beschreibung</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>30</td>
			<td>Anfängliche Basislinie</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>420</td>
			<td>Aktivierung</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>300</td>
			<td>Aktivierung</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>300</td>
			<td>LFN be-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>240</td>
			<td>Cystein quench</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>120</td>
			<td>Basislinie</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>300</td>
			<td>PAPrepore Verein</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>30</td>
			<td>Basislinie</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>300</td>
			<td>CMG2 Verein</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>30</td>
			<td>Basislinie</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>300</td>
			<td>Saure Übergang</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>30</td>
			<td>Basislinie</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>300</td>
			<td>Micelle Verband</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Schritt mal für Single BLI ausführen Montage Milzbrand-Toxin-Komplex. Beachten Sie, dass Basispläne verwendet werden, um wegspülen ungebundenen Protein aus vorherigen Schritt bzw. eine neue Puffer Basislinie einzurichten.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Montage und Demontage der Biolayer Interferometrie (BLI) mit Milzbrand-Toxin zu überwachen. Nach Montage/Demontage auf der Biosensor-Oberfläche sind von der Oberfläche zur Visualisierung und Identifikation von Komponenten der komplexe mit Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie, bzw. die große Proteinkomplexe veröffentlicht.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den dynamischen Aufbau von Proteinkomplexen in verschiedenen pH-Umgebungen mittels Biolayer-Interferometrie zu beobachten und die Komponenten mittels Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie zu bestätigen. Die Identifizierung und das Verständnis der Spezifität, die die Bildung und Assemblierung von Proteinkomplexen steuert, ist für biochemische Forscher von großem Interesse. Die Methodik, über die wir heute sprechen, ermöglicht es Forschern, vorhergesagte makromolekulare Komplexe zusammenzustellen, zu visualisieren und zu validieren.Die komplexe Beschaffenheit der Oberfläche des Biosensors ermöglicht es den Forschern dann, zusammengesetzte Komplexe in kleine Mikrovolumina für die Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie freizusetzen. In dieser Demonstration verfolgten wir die Kinetik von pH-induzierten strukturellen Umlagerungen des Milzbrandtoxin-Komplexes und verifizierten diese Umlagerungen mit elektronenmikroskopischen und massenspektrometrischen Methoden, ohne dass eine Aggregation vermieden wurde. Alexandra Machen und Pierce O'Neil, Doktoranden aus meinem Labor, werden die Assemblierung von Milzbrandtoxinen auf der Oberfläche des BLI-Biosensors, die Freigabe von Makroproben und EM-negative Färbeverfahren demonstrieren.Dr. Antonio Artigues ist maßgeblich an der Analyse und Identifizierung der BLI-freigesetzten Mikroproben mit dem Orbitrap Fusion Lumos Massenspektrometer beteiligt. Hydratisieren Sie zunächst eine aminreaktive BLI-Biosensorspitze der zweiten Generation, indem Sie sie in 250 Mikroliter Wasser tauchen und 10 Minuten lang inkubieren. Programmieren Sie in der Blitz-Software die Schrittzeiten, wie in dieser Tabelle aufgeführt.Beginnen Sie den BLI-Lauf, indem Sie die Biosensorspitze 30 Sekunden lang in 250 Mikroliter Wasser tauchen, um eine anfängliche Basislinie der Biosensordicke und -dichte zu messen. Aktivieren Sie als Nächstes den Biosensor, indem Sie die Spitze sieben Minuten lang in 250 Milliliter 50 Millimolar NHS und 200 Millimolar EDC eintauchen. Tauchen Sie dann den aktivierten Biosensor fünf Minuten lang in 50 Millimolare PDEA, gelöst in 0,1 molaren Boratpuffer, pH 8,5, um eine aktivierte bioreaktive Oberfläche zu erzeugen.Tauchen Sie nun den aktivierten bioreaktiven Biosensor fünf Minuten lang in 250 Mikroliter einer Lösung, die 100 nanomolare E126C LFn in 10 Millimolare Natriumacetat pH fünf und 100 Millimolare Natriumchloridpuffer enthält. Tauchen Sie die LFn-Spitze vier Minuten lang in 50 millimolares L-Cystein, 1 molares Natriumchlorid, 0,1 molare Natriumacetat pH fünf, um alle verbleibenden freien Thiol-reaktiven Gruppen zu löschen. Nach dem Eintauchen der abgeschreckten LFn-Spitze in 50 millimolare Tris, 50 millimolare Natriumchlorid, um die Pufferbasis zu etablieren, tauchen Sie die Spitze fünf Minuten lang in 0,5 mikromolare schützende Antigen-Prepore, 50 millimolare Tris, 50 millimolare Natriumchlorid, um den LFn-PA-Prepore-Komplex zu erzeugen.Sobald PA-Prepore assoziiert ist, entfernen Sie die Spitze aus der PA-Prepore-Lösung und tauchen Sie die Spitze 30 Sekunden lang in 50 millimolare Tris, 50 Millimolare Natriumchlorid, um unspezifisch gebundenes PA-Prepore wegzuspülen. Tauchen Sie den LFn PA-Prepore-Komplex fünf Minuten lang in 0,5 mikromolare CMG2 in 50 millimolare Tris und 50 millimolare Natriumchlorid ein. Tauchen Sie den LFn PA-prepore CMG2-Komplex 30 Sekunden lang in 50 Millimolare Tris und 50 Millimolare Natriumchloride, um ungebundenes CMG2 wegzuspülen und einen präendosomalen Komplex zu bilden.Für die EM-Analyse wird der LFn-PA-Prepore-CMG2-Komplex aus der Biosensorspitze freigesetzt, indem die Spitze in ein PCR-Röhrchen getaucht wird, das fünf Mikroliter 50 millimolares DTT, 50 millimolares Tris und 50 millimolares Natriumchlorid enthält. Für die Tandem-MS-Analyse der Peptide aus dem Komplex lösen Sie den LFn-PA-prepore CMG2-Komplex von der Biosensorspitze, indem Sie den Biosensor in ein PCR-Röhrchen eintauchen, das fünf Mikroliter 50 millimolares DTT, sechs molare keratinfreie Guanidinhydrochlorid und 25 millimolare Ammoniumbicarbonat, pH acht, enthält. Um den Komplex nach dem pH-Übergang zu betrachten, montieren Sie den LFn PA-prepore CMG2-Komplex auf dem Biosensor, wie gerade gezeigt.Tauchen Sie die Biosensorspitze fünf Minuten lang in einen pH-Wert von 10 Millimolaracetat, um den Übergang der PA-Präpore in die PA-Pore zu initiieren. Dieser Übergang wird durch eine zunehmende Amplitude angezeigt, gefolgt von einem größeren Amplitudenabfall, von dem angenommen wird, dass er aufgrund einer verminderten Bindungsaffinität für die vollständige Rezeptordissoziation erheblich ist. Für die EM-Analyse tauchen Sie die Biosensorspitze fünf Minuten lang in eine Lösung mit 1,25 millimolaren Mizellen, um eine Aggregation in der Lösung nach der Disulfidfreisetzung zu verhindern.Um eine negative Fleckenelektronenmikroskopie durchzuführen, beginnen Sie mit dem Glühen eines kohlenstoffbeschichteten Kupfergitters 300 bei 0,38 Millibar stabilem Atmosphärendruck und minus 15 Milliampere für 20 Sekunden und entlüften Sie dann das Gerät mit Luft. Befestigen Sie das Gitter zwischen einer sauberen Pinzette. Pipettieren Sie dann vier Mikroliter der freigesetzten komplexen Probe auf das Gitter und lassen Sie die Adsorption 60 Sekunden lang zu.Mit einem Filterpapierkeil die restliche Flüssigkeit ableiten. Färben Sie dann das Gitter, indem Sie fünf Mikroliter mit einem Nullpunkt von zwei Mikron gefiltertem Uranylformiat auf das Gitter pipettieren und nach fünf Sekunden den überschüssigen Fleck entfernen. Lassen Sie den Rost abgedeckt bei Raumtemperatur trocknen.Verwenden Sie dann das Transmissionselektronenmikroskop, um die Probe zu betrachten. Nachdem Sie die Proben für die Massenspektrometrie gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, betreiben Sie das Massenspektrometer unter Verwendung von CID und einer normierten Kollisionsenergie von 35 unter automatischer Steuerung, um kontinuierlich einen MS-Scan durchzuführen, gefolgt von so vielen Tandem-MS-MS-Scans wie möglich in einem Zeitraum von drei Sekunden. Die BLI-Sensogramm-Spur ist eine Echtzeit-Auslesung der Amplitudenänderungen aufgrund der spezifischen Zugabe der Milzbrandtoxin-Komponenten.Die erste Erhöhung erfolgt durch LFn-Aufladung auf die Spitze. Nach dem Abschrecken und zu Studienbeginn bindet PA-Präpore an LFn, gefolgt von der Zugabe von löslichem CMG2, was zu dem assemblierten präendosomalen Komplex führt. Der Komplex wird dann einem niedrigen pH-Wert ausgesetzt, der die Rezeptorbindung schwächt und dazu führt, dass die Präpore in ihre erweiterte Porenbestätigung übergeht, die durch die Zugabe von Mizellen bestätigt wird.Hier sind negative Färbungs-EM-Bilder von Komplexen nach der Freisetzung aus dem Biosensor zu sehen. Präendosomale Probengitter zeigten Dichten, die mit intakten ternären Komplexen aus LFn PA-Präpore CMG2 übereinstimmen. Komplexe Gitter nach der Ansäuerung zeigen, dass PA in Poren übergegangen und durch Mizelleneinschluss ohne offensichtliche CMG2-Dichte gelöst wurde.Wie bei MS zu sehen war, die die Proteinkomplexe bestätigte, enthielten präendosomale MS-Proben Peptide aus allen drei Toxinkomponenten mit einer Abdeckung von 60,46, 67,97 bzw. 54,15 % für LFn, PA und CMG2. Postendosomale Proben enthielten nur Peptide aus LFn und PA. Das Fehlen von CMG2 stimmt mit der beobachteten Abnahme des BLI-Nanometers während der Porenbildung überein. Die Fähigkeit, den Zusammenbau großer Makromolekülkomplexe zu überwachen und zu validieren, ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Spezifität und Funktionalität großer biomolekularer Anordnungen.Unsere Fähigkeit, vormontierte makromolekulare Komplexe von Biosensoren in Mikrovolumina für die elektronenmikroskopische Visualisierung freizusetzen, wird für die Strukturanalyse äußerst nützlich sein. Bei unserer Analyse der Zusammensetzung der Biosensor-Assemblierungskomplexe wurden nur 0,04 Femtomol des Freisetzungskomplexes verwendet, um seine Bestandteile vor und nach der assimilierten endosomalen Ansäuerung zu identifizieren. Das Freigabeprotokoll der Biosensor-Assemblierung kann angepasst werden, um natürlichen, aber schwer fassbaren pH-induzierten endosomalen Übergängen anderer bakterieller Toxine in viralen Proteinstrukturen zu folgen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass eine Proteinaggregation vermieden wird.

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Massenspektrometrie hat sich als wertvolles Tool für die Analyse großer Proteinkomplexe werden. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Zusammensetzung, Stöchiometrie und Gesamtarchitektur des Multi-Untereinheit Baugruppen. Hier beschreiben wir, Schritt-für-Schritt, wie man ein strukturelles Massenspektrometrie-Analyse durchzuführen, und Charakterisierung makromolekularen Strukturen.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Die Architektur von Proteinkomplexen ist essentiell für ihre Funktion. Kombination von verschiedenen massenspektrometrischen Techniken erwies sich als leistungsstarke, deren Montage zu studieren. Wir bieten Protokolle für chemische Vernetzung und native Massenspektrometrie und zeigen, wie diese komplementären Techniken helfen, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen aufzuklären.

Kombination von chemische Vernetzung und Massenspektrometrie intakt Proteinkomplexe, die Architektur des Multi-Untereinheit Protein Baugruppen zu studieren

Massenspektrometrie (MS) hat als ein wichtiges Instrument für die Untersuchung der Struktur und Dynamik der makromolekularen Versammlungen entstanden. Hier integrieren wir MS-basierte Ansätze, um komplexe Proteinbildung und Liganden Bindung zu befragen.

Analyse von Protein-Architekturen und Protein-Ligand-komplexen durch Integrative strukturelle Massenspektrometrie

Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Dieses Protokoll kombiniert Massenphotometrie mit einem neuartigen Mikrofluidik-System, um Protein-Protein-Wechselwirkungen mit geringer Affinität zu untersuchen. Dieser Ansatz basiert auf der schnellen Verdünnung hochkonzentrierter Komplexe in Lösung, was Messungen mit geringer Affinität ermöglicht und die Anwendbarkeit der Massenphotometrie erweitert.

Analyse der Proteinkomplexbildung bei mikromolaren Konzentrationen durch Kopplung von Mikrofluidik und Massenphotometrie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines Streptavidin-basierten Biolayer-Interferometrie-Systems (BLI). Es werden die wesentlichen Schritte und Überlegungen zur Verwendung grundlegender oder fortgeschrittener Bindungskinetik zur Bestimmung der Gleichgewichtsbindungsaffinität (KD) der Wechselwirkung beschrieben.

Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen mit Streptavidin-basierter Biolayer-Interferometrie

Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Verarbeitung von Kryo-EM-Bildern mit der Software-Suite SPHIRE vor. Das vorliegende Protokoll kann für fast alle Einzelteilchen-EM-Projekte angewendet werden, die auf eine nahezu atomare Auflösung abzielen.

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

Lernen Sie die Analyse dynamischer Proteinkomplexe mit Biolayer-Interferometrie, Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Anthrax-Toxin-Assemblierung in verschiedenen pH-Umgebungen.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

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