Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den dynamischen Aufbau von Proteinkomplexen in verschiedenen pH-Umgebungen mittels Biolayer-Interferometrie zu beobachten und die Komponenten mittels Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie zu bestätigen. Die Identifizierung und das Verständnis der Spezifität, die die Bildung und Assemblierung von Proteinkomplexen steuert, ist für biochemische Forscher von großem Interesse. Die Methodik, über die wir heute sprechen, ermöglicht es Forschern, vorhergesagte makromolekulare Komplexe zusammenzustellen, zu visualisieren und zu validieren.

Die komplexe Beschaffenheit der Oberfläche des Biosensors ermöglicht es den Forschern dann, zusammengesetzte Komplexe in kleine Mikrovolumina für die Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie freizusetzen. In dieser Demonstration verfolgten wir die Kinetik von pH-induzierten strukturellen Umlagerungen des Milzbrandtoxin-Komplexes und verifizierten diese Umlagerungen mit elektronenmikroskopischen und massenspektrometrischen Methoden, ohne dass eine Aggregation vermieden wurde. Alexandra Machen und Pierce O'Neil, Doktoranden aus meinem Labor, werden die Assemblierung von Milzbrandtoxinen auf der Oberfläche des BLI-Biosensors, die Freigabe von Makroproben und EM-negative Färbeverfahren demonstrieren.

Dr. Antonio Artigues ist maßgeblich an der Analyse und Identifizierung der BLI-freigesetzten Mikroproben mit dem Orbitrap Fusion Lumos Massenspektrometer beteiligt. Hydratisieren Sie zunächst eine aminreaktive BLI-Biosensorspitze der zweiten Generation, indem Sie sie in 250 Mikroliter Wasser tauchen und 10 Minuten lang inkubieren. Programmieren Sie in der Blitz-Software die Schrittzeiten, wie in dieser Tabelle aufgeführt.

Beginnen Sie den BLI-Lauf, indem Sie die Biosensorspitze 30 Sekunden lang in 250 Mikroliter Wasser tauchen, um eine anfängliche Basislinie der Biosensordicke und -dichte zu messen. Aktivieren Sie als Nächstes den Biosensor, indem Sie die Spitze sieben Minuten lang in 250 Milliliter 50 Millimolar NHS und 200 Millimolar EDC eintauchen. Tauchen Sie dann den aktivierten Biosensor fünf Minuten lang in 50 Millimolare PDEA, gelöst in 0,1 molaren Boratpuffer, pH 8,5, um eine aktivierte bioreaktive Oberfläche zu erzeugen.

Tauchen Sie nun den aktivierten bioreaktiven Biosensor fünf Minuten lang in 250 Mikroliter einer Lösung, die 100 nanomolare E126C LFn in 10 Millimolare Natriumacetat pH fünf und 100 Millimolare Natriumchloridpuffer enthält. Tauchen Sie die LFn-Spitze vier Minuten lang in 50 millimolares L-Cystein, 1 molares Natriumchlorid, 0,1 molare Natriumacetat pH fünf, um alle verbleibenden freien Thiol-reaktiven Gruppen zu löschen. Nach dem Eintauchen der abgeschreckten LFn-Spitze in 50 millimolare Tris, 50 millimolare Natriumchlorid, um die Pufferbasis zu etablieren, tauchen Sie die Spitze fünf Minuten lang in 0,5 mikromolare schützende Antigen-Prepore, 50 millimolare Tris, 50 millimolare Natriumchlorid, um den LFn-PA-Prepore-Komplex zu erzeugen.

Sobald PA-Prepore assoziiert ist, entfernen Sie die Spitze aus der PA-Prepore-Lösung und tauchen Sie die Spitze 30 Sekunden lang in 50 millimolare Tris, 50 Millimolare Natriumchlorid, um unspezifisch gebundenes PA-Prepore wegzuspülen. Tauchen Sie den LFn PA-Prepore-Komplex fünf Minuten lang in 0,5 mikromolare CMG2 in 50 millimolare Tris und 50 millimolare Natriumchlorid ein. Tauchen Sie den LFn PA-prepore CMG2-Komplex 30 Sekunden lang in 50 Millimolare Tris und 50 Millimolare Natriumchloride, um ungebundenes CMG2 wegzuspülen und einen präendosomalen Komplex zu bilden.

Für die EM-Analyse wird der LFn-PA-Prepore-CMG2-Komplex aus der Biosensorspitze freigesetzt, indem die Spitze in ein PCR-Röhrchen getaucht wird, das fünf Mikroliter 50 millimolares DTT, 50 millimolares Tris und 50 millimolares Natriumchlorid enthält. Für die Tandem-MS-Analyse der Peptide aus dem Komplex lösen Sie den LFn-PA-prepore CMG2-Komplex von der Biosensorspitze, indem Sie den Biosensor in ein PCR-Röhrchen eintauchen, das fünf Mikroliter 50 millimolares DTT, sechs molare keratinfreie Guanidinhydrochlorid und 25 millimolare Ammoniumbicarbonat, pH acht, enthält. Um den Komplex nach dem pH-Übergang zu betrachten, montieren Sie den LFn PA-prepore CMG2-Komplex auf dem Biosensor, wie gerade gezeigt.

Tauchen Sie die Biosensorspitze fünf Minuten lang in einen pH-Wert von 10 Millimolaracetat, um den Übergang der PA-Präpore in die PA-Pore zu initiieren. Dieser Übergang wird durch eine zunehmende Amplitude angezeigt, gefolgt von einem größeren Amplitudenabfall, von dem angenommen wird, dass er aufgrund einer verminderten Bindungsaffinität für die vollständige Rezeptordissoziation erheblich ist. Für die EM-Analyse tauchen Sie die Biosensorspitze fünf Minuten lang in eine Lösung mit 1,25 millimolaren Mizellen, um eine Aggregation in der Lösung nach der Disulfidfreisetzung zu verhindern.

Um eine negative Fleckenelektronenmikroskopie durchzuführen, beginnen Sie mit dem Glühen eines kohlenstoffbeschichteten Kupfergitters 300 bei 0,38 Millibar stabilem Atmosphärendruck und minus 15 Milliampere für 20 Sekunden und entlüften Sie dann das Gerät mit Luft. Befestigen Sie das Gitter zwischen einer sauberen Pinzette. Pipettieren Sie dann vier Mikroliter der freigesetzten komplexen Probe auf das Gitter und lassen Sie die Adsorption 60 Sekunden lang zu.

Mit einem Filterpapierkeil die restliche Flüssigkeit ableiten. Färben Sie dann das Gitter, indem Sie fünf Mikroliter mit einem Nullpunkt von zwei Mikron gefiltertem Uranylformiat auf das Gitter pipettieren und nach fünf Sekunden den überschüssigen Fleck entfernen. Lassen Sie den Rost abgedeckt bei Raumtemperatur trocknen.

Verwenden Sie dann das Transmissionselektronenmikroskop, um die Probe zu betrachten. Nachdem Sie die Proben für die Massenspektrometrie gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, betreiben Sie das Massenspektrometer unter Verwendung von CID und einer normierten Kollisionsenergie von 35 unter automatischer Steuerung, um kontinuierlich einen MS-Scan durchzuführen, gefolgt von so vielen Tandem-MS-MS-Scans wie möglich in einem Zeitraum von drei Sekunden. Die BLI-Sensogramm-Spur ist eine Echtzeit-Auslesung der Amplitudenänderungen aufgrund der spezifischen Zugabe der Milzbrandtoxin-Komponenten.

Die erste Erhöhung erfolgt durch LFn-Aufladung auf die Spitze. Nach dem Abschrecken und zu Studienbeginn bindet PA-Präpore an LFn, gefolgt von der Zugabe von löslichem CMG2, was zu dem assemblierten präendosomalen Komplex führt. Der Komplex wird dann einem niedrigen pH-Wert ausgesetzt, der die Rezeptorbindung schwächt und dazu führt, dass die Präpore in ihre erweiterte Porenbestätigung übergeht, die durch die Zugabe von Mizellen bestätigt wird.

Hier sind negative Färbungs-EM-Bilder von Komplexen nach der Freisetzung aus dem Biosensor zu sehen. Präendosomale Probengitter zeigten Dichten, die mit intakten ternären Komplexen aus LFn PA-Präpore CMG2 übereinstimmen. Komplexe Gitter nach der Ansäuerung zeigen, dass PA in Poren übergegangen und durch Mizelleneinschluss ohne offensichtliche CMG2-Dichte gelöst wurde.

Wie bei MS zu sehen war, die die Proteinkomplexe bestätigte, enthielten präendosomale MS-Proben Peptide aus allen drei Toxinkomponenten mit einer Abdeckung von 60,46, 67,97 bzw. 54,15 % für LFn, PA und CMG2. Postendosomale Proben enthielten nur Peptide aus LFn und PA. Das Fehlen von CMG2 stimmt mit der beobachteten Abnahme des BLI-Nanometers während der Porenbildung überein. Die Fähigkeit, den Zusammenbau großer Makromolekülkomplexe zu überwachen und zu validieren, ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Spezifität und Funktionalität großer biomolekularer Anordnungen.

Unsere Fähigkeit, vormontierte makromolekulare Komplexe von Biosensoren in Mikrovolumina für die elektronenmikroskopische Visualisierung freizusetzen, wird für die Strukturanalyse äußerst nützlich sein. Bei unserer Analyse der Zusammensetzung der Biosensor-Assemblierungskomplexe wurden nur 0,04 Femtomol des Freisetzungskomplexes verwendet, um seine Bestandteile vor und nach der assimilierten endosomalen Ansäuerung zu identifizieren. Das Freigabeprotokoll der Biosensor-Assemblierung kann angepasst werden, um natürlichen, aber schwer fassbaren pH-induzierten endosomalen Übergängen anderer bakterieller Toxine in viralen Proteinstrukturen zu folgen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass eine Proteinaggregation vermieden wird.