Name: Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Proteomik zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae mit SILAC und Affinitätsreinigung. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Protein-Interaktionen.

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Material und Methoden <ol><li> Hefestämme <ul><li> Alle Stämme in dieser Studie basieren auf der BY4742 Hintergrund. Der SILAC Kontrollstamm (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 und arg4: G418): bis BY4742 (Mat alpha wurde durch Paarung arg4 Löschung Stamm (: G418 Mat a, HIS3, URA3, LEU2 und arg4) gemacht his3, leu2, ura3 und lys2) und der meiotischen Haploiden wurden von Tetrade Dissektion erhalten. Daher ist die Kontrolle Stamm eine auxotroph für Lysin und Arginin. Der Köder Stamm wurde durch PCR-vermittelte homologe Rekombination mit dem Vektor pBS1479 gemacht. Daher ist die Epitop-Tag in dieser Studie verwendeten die Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)-Tag (3). </li></ul></li><li> SILAC: <ul><li> Der SILAC Kontrolle Stamm wurde in minimal-Dropout-Medien mit 98% L-Lysin-4 ,4,5,5-D4 (0,03 g / L, Cambridge Isotope) und 98% L-Arginin-13 C 6 (ergänzt gewachsen 0,036 g / L, Cambridge Isotope). </li><li> Der Köder Stamm wurde in regelmäßigen Vollmedium mit normaler Isotopenzusammensetzung Aminosäuren gewachsen. </li></ul></li><li> Erste Stufe der TAP Reinigung [Dieses Protokoll wird von der Cold Spring Harbor Laboratory Kurs-Handbuch (4) angepasst] ** Die Nacht vor Ihrer Reinigung, pre-chill Mörser und Stößel in -80 ° C Gefrierschrank. Auch vor Kälte einen Becher in -20 ° C ** Machen Sie diese Puffer kurz vor Gebrauch (für 1 l Kultur): <ul><li> 30 ml NP-40-Puffer mit 25 ul PIC (1 / 2000), 50 &amp;mgr; l 1 M DTT </li><li> 20 ml der NP-40-Puffer mit 1 / 200 PIC, 50 ul 1M DTT </li><li> 10 ml der TEV-C-Puffer mit 1 / 2000 PIC, 10 ul 1 M DTT </li></ul></li></ol> SILAC und Vorbereitung <ol><li> Wachsen 1L jeder der Köder Belastung und der Kontrolle getrennt Stamm OD 600 = 1,0 bis 1,3. </li><li> Gießen Kultur in 500ml Nalgene Zentrifugenröhrchen. Balance der Last-und Pellet-Zellen bei 2580X g. </li><li> Dekantieren Medien-und Pellet mit 50 ml kaltem dH 2 O während der Übertragung der Zellen zu 50ml Zentrifugenröhrchen. Pellet-Zellen. ** Sie können das Pellet bei -80 ° C einzufrieren ** </li><li> ** Wichtig ** entsprechen der Kontrollstamm Kultur, um den Köder Stammkultur in 1:1 durch trockene Pellet Gewicht. </li><li> Resuspendieren jedem Zellpellet in 10 ml NP-40-Puffer mit 1 / / 2.000 Protease Inhibitor Cocktail (PIC). </li><li> Mix der beiden Zellkulturen durch direkt Umfüllen einer Röhre in die andere. Mahlen </li><li> Gießen Sie flüssigem N 2 in die vorgekühlten Mörser und lassen Sie es vollständig verdampfen. 2 ml der Zellen, um den Mörtel in kreisenden Bewegungen. Gießen Sie etwas flüssigem N 2, um die Zellen einzufrieren. Grind die Zellen, bis die Zellen feines Pulver zu werden. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen Boden sind. ** Nicht in die Zellen zu tauen. Fügen Sie flüssigem N 2 bei Bedarf ** </li><li> Übertragen Sie die Pulver zu einem eiskalten Becher und bei Raumtemperatur auftauen. Wenn die Kanten zu tauen beginnt, 20 ml NP-40-Puffer mit 1 / 200 PIC. </li><li> Transfer Rohlysat bis 40-ml Nalgene Röhrchen. Spin bei 39000 xgfor 30 min. </li><li> Während der Wartezeit, nehmen Sie 300 ul Sepharose 2B-Beads (GE). Waschen Sie die Perlen in 300 ul NP-40 Puffer (2.1, 000 PIC) 3 mal. Resuspendieren der Beads in 300 ul Puffer, so dass sie in 1:1 Aufschlämmung. Pre-Clearing-Zelllysat </li><li> Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen und fügen Sie die Sepharose 2B Perlen. Inkubieren auf einer rotierenden Plattform in Kühlraum für 30 min. </li><li> Während der Wartezeit, nehmen Sie 300 ul IgG Sepharose 6 Beads (GE). Waschen Sie die Perlen in 300 ul NP-40 Puffer (2.1, 000 PIC) 3 mal. Resuspendieren der Beads in 300 _l-Puffer, so dass sie in 1:1 Aufschlämmung. </li><li> Pellet der Perlen. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. ** Speichern ein Aliquot von dem Zelllysat für Western Blotting später ** Die Bindung an IgG-Sepharose beads </li><li> Entfernen Sie die Sepharose 2B Perlen durch Zentrifuge. Fügen Sie die IgG-Beads (zuvor in 1:1 Aufschlämmung hergestellt). Trennen Sie die Inhalte in zwei Röhren für effizientere bindend. Inkubieren auf einer rotierenden Plattform in kalten Raum für 2 Stunden. </li><li> Spin down der Perlen. ** Speichern einen aliquoten Teil der ungebundenen Fraktion ** </li><li> Wash-Kügelchen mit 10 ml NP-40 Puffer (2.1, 000 PIC). </li><li> Wash Perlen mit 3 ml TEV-C-Puffer (2.1, 000 PIC). ** Speichern einen aliquoten Teil der Perlen. Darin soll die Effizienz der Bindung ** Eluting von IgG Beads durch TEV-Protease-Spaltung </li><li> Add 5 ul AcTEV zu 1 ml TEV-C-Puffer (mit 1 / 2, 000 PIC). Nach dem Mischen, trennen Sie die Inhalte in zwei 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für eine effizientere Vermischung. Inkubieren auf einer rotierenden Plattform im Kühlraum über Nacht. </li><li> Spin down die Perlen und den Transfer des Eluats in ein frisches 1,5-ml-Tube. Waschen Sie die Perlen mit zusätzlichen 0,5 ml TEV-C-Puffer </li><li> Kombinieren Sie die elaute in einem Rohr. Sie sollten 1,5 ml Eluat insgesamt haben.** Speichern einen aliquoten Teil der TEV Eluat ** Trichloressigsäure (TCA) precipatation (für die Massenspektrometrie-basierte Analyse, empfehlen wir die Verwendung EtOH / Acetat-Fällung) </li><li> Passen Aliquots zu 25% TCA mit 100% TCA. Um dies zu tun, trennen Sie die 1,5 ml Eluat in 2 Röhren von 750 ul jeder. Add 250 ul 100% TCA auf das Rohr. Ihre Lösung sollte milchig. </li><li> Auf Eis für 30 min mit periodischen Vortexen. </li><li> Spin bei maximaler Geschwindigkeit in der Tischzentrifuge in Kühlraum für 30 min. </li><li> Wash einmal mit 500 ul eiskaltem Aceton mit 0,05 N HCl und Spin für 5 min bei maximaler Geschwindigkeit (Kühlraum). </li><li> Wash einmal mit 500 ul eiskaltem Aceton und Spin für 5 min bei max (Kühlraum). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Aceton und trockene Pellets. </li><li> Für Silber-Färbung, das Pellet in 50 ul 1X SDS-Probenpuffer. EtOH / Acetat precipatation </li><li> Fügen Sie 20 g Glykogen </li><li> Verdünnen Sie die Proben mit 5x 100% EtOH und passen zu 50 mM NaCH 3 COO mit einer 2,5 M Stammlösung, pH 5,0, </li><li> Stellen Sie die Lösung für 2h </li><li> Pellet ausgefallene Protein durch Zentrifugation für 10 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur. </li></ol> NP-40 Puffer (200 ml) <table border="0"><tbody><tr><td></td><td> Lager-Konzentration </td><td> Hinzufügen </td></tr><tr><td> 10 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,2) </td><td> 0,1 M </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> 1% NP-40 </td><td> 100% </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 50 mM NaF </td><td> 1 M </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 0,1 mM Na 3 VO 4 </td><td> 10 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> Volume auf 200 ml </td></tr></tbody></table> ADD vor dem Gebrauch: <ol><li> 1 / 1, 000 von 1 M DTT </li><li> 1 / 2, 000 von PIC (Protease-Inhibitoren Cocktail) </li></ol> TEV-C-Puffer (für 50 ml) <table border="0"><tbody><tr><td></td><td> Lager-Konzentration </td><td> Hinzufügen </td></tr><tr><td> 25 mM Tris (pH 8,0) </td><td> 100 mM </td><td> 12,5 ml </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td><td> 2 M </td><td> 3,75 ml </td></tr><tr><td> 0,1% NP-40 </td><td> 100% </td><td> 50 _l </td></tr><tr><td> 0,5 mM EDTA </td><td> 500 mM </td><td> 50 __l </td></tr><tr><td style="text-align:right;" colspan="3"> Volumen von 50 ml </td></tr></tbody></table> ADD vor dem Gebrauch: <ol><li> 1 / 1, 000 1M DTT </li><li> 1 / 2, 000 PIC </li></ol>

<ol><li>Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritance+of+cortical+ER+in+yeast+is+required+for+normal+septin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Jour.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization.</a> Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.</li>
<li>Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric-based+approaches+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics.</a> Methods. 29, 124-130 Forthcoming.</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 Forthcoming.</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Yeast+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methods in Yeast Genetics.</a> , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.</li>
</ol>

Die Aliquots während der Reinigungsprozedur gespeichert werden sollen umfassen (1) mit bereits geklärten Zelllysat, (2) gebundenen Fraktion (3), ungebundene Fraktion, und (4) eluierte Fraktion. Wir empfehlen die Analyse der Protein Inhalt der oben Aliquots durch Western-Blot mit anti-TAP-Antikörper oder Silberfärbung, die Bindung und Elution Effizienz des Experiments zu reflektieren. Beispiele für eine mit Silber gefärbten Gel und ein Schandfleck sind in Abbildung 1 dargestellt. Da SILAC bie...

identifizierung von protein-komplexen mit der quantitativen proteomik in s. cerevisiae

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipide sind die Bausteine ​​der Zellmembranen, die als Barrieren und in Abschottung von zellulären Prozessen, und vor kurzem, wie wichtig intrazellulären Signalmolekülen. Doch im Gegensatz zu Proteinen, Lipiden sind kleine hydrophobe Moleküle, dass der Verkehr vor allem durch schlecht beschrieben nonvesicular Routen, die die Hypothese aufgestellt, um an der Membran Kontaktstellen (MCS) auftreten. MCSs sind Regionen, in denen das endoplasmatische Retikulum (ER) ermöglicht den direkten körperlichen Kontakt mit einem Partner Organellen, zB Plasmamembran (PM). Die ER Teil des ER-PM MCSs ist in lipid-synthetisierenden Enzyme angereichert, was darauf hindeutet, dass Lipid-Synthese zu diesen Seiten gerichtet ist und was impliziert, dass MCSs wichtig sind für die Lipid-Verkehr. Hefe ist ein ideales Modell, um ER-PM MCSs wegen ihrer Fülle Studie mit über 1000 Kontakten pro Zelle, und ihre konservierte Natur in allen Eukaryoten. Das Aufdecken der Proteine, die MCSs bilden ist entscheidend für das Verständnis, wie Lipide Verkehr in Zellen erreicht wird, und wie sie wirken als Signalmoleküle. Wir haben festgestellt, dass ein ER genannt Scs2p zu ER-PM MCSs lokalisieren und ist für ihre Bildung wichtig. Wir sind auf die Aufdeckung der molekularen Partner Scs2p konzentriert. Identifizierung von Protein-Komplexen beruht traditionell auf der ersten Lösung gereinigtes Protein-Proben mittels Gelelektrophorese, durch In-Gel-Verdauung von Eiweiß Bands und Analyse von Peptiden durch Massenspektrometrie verfolgt. Diese oft Grenzen der Studie auf eine kleine Teilmenge von Proteinen. Außerdem werden Protein-Komplexe zu denaturieren oder nicht-physiologischen Bedingungen während des Verfahrens ausgesetzt. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine groß angelegte quantitative Proteomics-Technik für eine objektive und quantifizierte Daten zu extrahieren umgesetzt. Wir verwenden stabile Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) zu heften Isotop Kerne in Proteine ​​einzubauen in einem untagged Kontrollstamm. Gleiche Volumina getaggt Kultur und untagged, SILAC-markierten Kultur miteinander vermischt und lysiert durch Schleifen in flüssigem Stickstoff. Wir führen dann eine Affinität Reinigungsverfahren nach unten ziehen, Protein-Komplexen. Schließlich Niederschlag wir die Proteinprobe, die bereit sind für die Analyse durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie / Tandem-Massenspektrometrie ist. Am wichtigsten ist, sind Proteine ​​in der Kontrolle Belastung durch das schwere Isotop markiert und wird eine Masse / Ladungs-Verschiebung, die gegen die unmarkierte Proteine ​​in den Köder Belastung quantifiziert werden können, zu produzieren. Daher können Verunreinigungen oder unspezifische Bindung leicht beseitigt werden. Durch diesen Ansatz haben wir mehrere neue Proteine, die ER-MCSs PM lokalisieren identifiziert. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung unseres Ansatzes.

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipide sind die Bausteine zellulärer Membranen, die als Barrieren und bei der Kompartimentierung zellulärer Prozesse fungieren, und seit Kurzem als ...

Dieses Verfahren beginnt mit dem Kultivieren des Bait-Stamms in Medium, das normale Aminosäuren enthält, sowie des SLAC-Kontrollstamms mit schweren lysin- und argininisotopen Aminosäuren. Gleichmäßige Mengen beider Stämme werden gemischt und durch Mahlen in flüssigem Stickstoff lysiert. Die rohen Lysate werden zunächst durch Zentrifugation pelletiert und anschließend durch Bindung an Sphäros-Beads geklärt. Danach wird das Zelllysat an IgG-Beads gebunden.Die an IgG-Perlen gebundenen Proteine werden durch Protease verdaut, gespalten und präzipitiert. Die Probe ist nun bereit zur Analyse mittels Massenspektrometrie. Hallo, ich bin Jesse Chao aus dem Lone-Labor der Abteilung für Zell- und Umweltbiologie am Life Sciences Institute der University of British Columbia.Heute stellen wir ein Verfahren für die quantitative proteomische Analyse namens SILAC vor, kombiniert mit Affinitätsreinigung. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Protein-Komplexe zu untersuchen.Beginnen wir nun. Bei diesem Verfahren enthält der Bait-Stamm normale Aminosäuren, während der SLAC-Kontrollstamm schwer isotope Lysin- und Argininanteile enthält. Zunächst werden jeweils ein Liter des Bait-Stamms und

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Forschung

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Biology

Biologie

Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.

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Affinitätsreinigung von markierten Proteinen in Kombination mit der Massenspektrometrie (APMS) ist eine leistungsfähige Methode für die systematische Kartierung von Protein-Wechselwirkung Netzwerken und zur Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von biologischen Prozessen. Hier beschreiben wir eine optimierte sequentielle Peptid Affinität (SPA) APMS Verfahren für das Bakterium...

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

SILAC Immunpräzipitationsexperimenten stellt ein wirksames Mittel zur Entdeckung neuer Protein-Protein-Interaktionen. Dadurch, dass die genaue relative Quantifizierung von Protein Hülle und Fülle in den Kontroll-und Testproben, true Wechselwirkungen können leicht von experimentellen Verunreinigungen unterschieden werden, und niedriger Affinität Wechselwirkungen durch die Verwendung von weniger strengen Pufferbedingungen erhalten.

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Verwendung von Protein-Mikroarrays enthält fast die gesamte S. cerevisiae Proteom ist für schnelle unvoreingenommene Abfragetausende von Protein-Protein-Wechselwirkungen in parallel sondiert. Dieses Verfahren kann für die Protein-Kleinmolekül, posttranslationale Modifikation und andere Assays mit hohem Durchsatz verwendet werden.

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Proteine interagieren miteinander und diese Wechselwirkungen bestimmen zu einem großen Teil ihre Funktionen. Protein-Interaktionspartner können bei hohem Durchsatz in vivo mit einem Hefe-Fitness-Assay identifiziert werden, der auf dem Dihydrofolat-Reduktase-Protein-Fragment-Komplementationsassay (DHFR-PCA) basiert.

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschreiben wir Protokolle Säugerzellen durch Solid-State-Fräsen bei einer kryogenen Temperatur zu stören, um einen Zellextrakt aus der resultierenden Zelle Pulver produzieren, und Proteinkomplexe von Interesse durch Affinitätseinfangen auf Antikörper-gekoppelten Mikrometer-Maßstab paramagnetischen Perlen zu isolieren.

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Hier stellen wir Protokolle für die Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen und deren Trennung durch blaue native PAGE, gefolgt von Proteinkorrelationsprofilierungs freie quantitative Massenspektrometrie Label. Diese Methode ist nützlich Interaktom in verschiedene Proteinkomplexe zu lösen.

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Für die hochauflösende Complexome-Profilierung wird ein vielseitiges kryolicing BN-MS-Protokoll mit einem Mikrotom vorgestellt.

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Erfahren Sie die quantitative Proteomik zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae mit SILAC und Affinitätsreinigung. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Protein-Interaktionen.

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