Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Dieses Verfahren beginnt mit der Kultivierung des Köderstamms in Medien, die normale Aminosäuren des SLAC-Kontrollstamms und schwere Isotopen Lysin und Arginin enthalten. Gleiche Mengen beider Stämme werden gemischt und durch Mahlen und Flüssigstickstoff-Rohlysate lysiert, zuerst durch Zentrifuge pelletiert und dann durch Bindung an Spheroskügelchen geklärt. Das Zelllysat wird dann an IgG-Kügelchen gebunden.

Die Proteine, die an IgG-Kügelchen gebunden sind, werden durch Protease, Spaltung und Ausfällung angedeutet. Die Probe ist nun bereit für die Analyse mittels Massenspektrometrie. Hallo, ich bin Jesse Chao vom Lone Lab in der Abteilung für Zellumweltbiologie am Life Sciences Institute der University of British Columbia.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur quantitativen Proteomanalyse namens Silak. Kombiniert mit Affinitätsreinigung. Dieses Verfahren nutzen wir in unserem Labor, um Proteinkomplexe zu untersuchen.

Fangen wir also an: Bei diesem Verfahren enthält der Köderstamm normale Aminosäuren, während der SLAC-Kontrollstamm schwere Isotopen, Lysin und Arginin enthält. Um zu beginnen, züchten Sie zunächst einen Liter, jeweils den Köderstamm und den Kontrollstamm separat auf den auf Ihrem Bildschirm angezeigten Wert. Gießen Sie anschließend die Kultur in 500-Milliliter-Zentrifugenröhrchen von Nalgene.

Gleichen Sie die Last in den Pelletzellen bei 2.580 RCF aus, dekantieren Sie das Medium und resuspendieren Sie das Pellet. Mit 50 Millilitern kaltem D H2O beim Transfer der Zellen auf 50 Milliliter zentrifugieren Sie die Röhrchen, zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die Zellen bei 3000 RCF zu pelletieren. Zu diesem Zeitpunkt können Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Kontrollstammkultur eins zu eins mit der Köderstammkultur nach dem Trockenpelletgewicht abzustimmen. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 10 Millilitern NP 40-Puffer mit einem Proteasehemmer-Cocktail von einem bis 2000. Mischen Sie die beiden Zellkulturen, indem Sie ein Röhrchen direkt in das andere umfüllen.

Um mit dem Mahlen der Zellen zu beginnen, gießen Sie zuerst flüssigen Stickstoff in den vorgekühlten Mörtel und lassen Sie ihn vollständig verdampfen. Geben Sie anschließend zwei Milliliter Zellen in den Mörser. Gießen Sie etwas flüssigen Stickstoff ein, um die Zellen einzufrieren.

Mahlen Sie die Zellen, bis die Zellen fein werden. Pulver. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen gemahlen sind. Achten Sie darauf, die Zellen nicht auftauen zu lassen.

Fügen Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff hinzu. Anschließend das Pulver in einen eiskalten Becher geben und bei Raumtemperatur auftauen. Wenn die Ränder aufzutauen beginnen, fügen Sie nach dem Auftauen 20 Milliliter NP 40-Puffer mit einem PIC von eins bis 200 hinzu.

Füllen Sie das Rohlysat in 40-Milliliter-Nalgene-Röhrchen um und drehen Sie es 30 Minuten lang mit 16.000 U/min in einem Sovos SA 600-Rotor. Nehmen Sie während des Wartens 300 Mikroliter der SROs zwei B-Kügelchen und waschen Sie die Kügelchen dreimal in 300 Mikrolitern NP 40 Puffer. Als nächstes resuspendieren Sie die Kügelchen in 300-Mikroliter-Puffern, so dass sie sich in einer Eins-zu-Eins-Aufschlämmung befinden.

Der nächste Schritt besteht darin, das Zelllysat vorzuklären. Um dies zuerst zu tun, überträgst du das Super Natin in eine neue Tube und fügst die Spheros mit zwei B-Kügelchen hinzu. Inkubieren Sie auf einer rotierenden Plattform in einem Kühlraum für 30 Minuten.

Nehmen Sie während der Inkubation 300 Mikroliter IgG SROs sechs Kügelchen und waschen Sie die Kügelchen dreimal in 300 Mikrolitern NP 40 Puffer. Dann resuspendieren Sie die Kügelchen in 300-Mikroliter-Puffern, so dass sie sich in einer Eins-zu-Eins-Aufschlämmung befinden. Nach der Inkubation pelletieren Sie die SROs.

Zwei sein Perlen in. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen. Denken Sie daran, ein Aliquot des Zelllysats für das spätere Western Blotting aufzubewahren.

Dann die IgG-Kügelchen hinzufügen. Trennen Sie den Inhalt für eine effizientere Bindung in zwei Röhrchen und inkubieren Sie ihn zwei Stunden lang auf einer rotierenden Plattform in einem Kühlraum. Nach der Inkubation sammeln Sie die Kügelchen in einer Chromatographiesäule bei vier Grad Celsius.

Achte darauf, dass du ein Aliquot der ungebundenen Fraktion speicherst. Waschen Sie die Kügelchen mit 10 Millilitern. NP 40 Puffer.

Als nächstes die Perlen mit drei Millilitern waschen. TEVC-Puffer. Denken Sie auch hier daran, ein Aliquot der Perlen aufzubewahren.

Dies spiegelt die Effizienz der Bindung wider, um die Kügelchen zu eluieren. Fügen Sie zunächst fünf Mikroliter A-C-T-E-V zu einem Milliliter TEVC-Puffer hinzu. TEVC-Puffer zu den Kügelchen geben und mischen.

Füllen Sie den Inhalt in zwei 1,5-Milliliter-EINOR-Röhrchen um, die effizienter gemischt werden können, und inkubieren Sie ihn über Nacht auf einer rotierenden Plattform in einem Kühlraum. Als nächstes schleudern Sie die Kügelchen herunter und geben Sie das Eluat in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Kügelchen nach dem Waschen mit zusätzlichen 0,5 Millilitern TEVC-Puffer.

Kombiniere die acht in einer Tube. Sie sollten insgesamt 1,5 Milliliter ELU acht haben. Bewahren Sie ein Aliquot der TEV Elu acht zum Niederschlag auf.

Passen Sie die Aliquoten auf 25 % TCA mit hundert Prozent TCA an. Trennen Sie dazu die 1,5 Milliliter LU Acht in zwei Röhrchen zu je 750 Mikrolitern. Geben Sie 250 Mikroliter 100% TCA in das Röhrchen.

Deine Lösung sollte milchig werden. Legen Sie es anschließend 30 Minuten lang auf Eis. Die Mischung nach der Inkubation regelmäßig vortexen.

In der Tischzentrifuge in einem Kühlraum 30 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit schleudern. Einmal mit 500 Mikrolitern eiskaltem Aceton waschen, das 0,05 normale Salzsäure enthält. Dann drehen Sie sich fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius.

Anschließend einmal mit 500 Mikrolitern eiskaltem Aceton waschen und fünf Minuten bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius schleudern. Entfernen Sie nach dem Schleudern vorsichtig das Aceton und das trockene Pellet für die Silberflecken. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern des Einmaligen des SDS-Probenpuffers.

Wenn Sie vorhaben, das gefällte Protein für die massenspektrometrische Analyse zu verwenden, empfiehlt es sich, mit Ethanol zu fällen. Um dies zu tun, fügen Sie zuerst 20 Mikrogramm Glykogen hinzu, verdünnen Sie die Proben fünfmal mit hundertprozentigem Ethanol und stellen Sie sie auf 50 Millimolare Natriumbicarbonat mit einem 2,5-molaren Stamm bei pH 5,0 ein. Mischen Sie die Lösung, indem Sie das Röhrchen umdrehen.

Lassen Sie es zwei Stunden bei Raumtemperatur stehen. Zum Schluss teilen Sie den Inhalt in zwei Einor-Röhrchen auf. Das gefällte Protein wird durch Zentrifugation 10 Minuten lang bei 12.000 GS bei Raumtemperatur pelletiert.

Das während des Aufreinigungsverfahrens eingesparte Aliquot sollte das vorgeklärte Zelllysat, die gebundene Fraktion, die ungebundene Fraktion und die entzogene Fraktion umfassen. Wir empfehlen, die Proteingehalte der oben genannten Aliquote durch Western Blotting unter Verwendung von Antit TAP-Antikörpern oder Silberfärbung zu analysieren, um die Bindungs- und Eluierungseffizienz des Experiments widerzuspiegeln. In diesem Silberfleckengel gereinigtes SCS zwei Tippen auf seine Wechselwirkung, Partner wurden visualisiert und mit einer nicht markierten Kontrolle in diesem Western Blot verglichen.

Verschiedene Fraktionen, die während der Reinigung von SCS Two Tap entnommen wurden, wurden durch Western Blotting unter Verwendung von Antit-Tap-Antikörpern analysiert. Beachten Sie, dass SCS mit zwei Taps mit einem niedrigeren Molekulargewicht migrierte, nachdem die Protease-Spaltung durch eluzian durch TEV erfolgt war, und dass nach der Elution kein S SCS zwei Tap auf den IgG-Kügelchen übrig war. Dies bestätigte, dass die Reinigung hocheffizient war.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Proteinkomplexe durch Affinitätsreinigung mit IgG-Kügelchen aufreinigen können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie den Basisstamm und den Kontrollstamm durch trockenes Pellgewicht abstimmen, bevor Sie mit dem Reinigungsverfahren beginnen. Da LAC uns unverzerrte und qued-Messungen von Proteinbindungspartnern liefert, führen wir nur die erste Stufe der Klopfreinigung durch, um den Probenverlust zu minimieren.

Wenn Sie erhebliche Mengen an unspezifischen Bindungen feststellen, möchten Sie möglicherweise das gesamte Protokoll durchführen, das im Handbuch von Cold Springing Harbor zu finden ist. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Hey, komm schon, Mark. Ah, los.