Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Genexpression mit Hilfe von funktionsfähigen Kernmaschinen zu testen, die aus Zellen extrahiert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst im Anschwellen der Helazellen geerntet wird. Anschließend werden die Zellen durch Downing geschnürt und anschließend zentrifugiert, um die Zellkerne im dritten Schritt zu pelletieren.

Die Zellkerne werden mit Salz extrahiert, konzentriert und dialysiert, um lösliche und funktionelle Genexpressionsmaschinen zu erhalten. Letztendlich kann die Funktionalität der Kernextrakte anhand ihrer Transkriptions- und Spleißaktivitäten bewertet werden, wie sie mit einem gekoppelten RNA-Polymerase-zu-Transkriptions- und Spleißsystem bewertet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Herstellung von Zellkernextrakten in großen Mengen besteht darin, dass bei dieser Technik eine kleine Anzahl von Zellen zur Herstellung des Zellkernextrakts verwendet werden kann.

Beginnen Sie mit dem Plattieren von Hela-Zellen auf drei 150-Millimeter-Platten mit DMEM-Medien, die mit FBS und Antibiotika ergänzt sind, züchten Sie die Kulturen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2, bis die Zellen zu diesem Zeitpunkt eine CO-Flüssigkeit von 90 % erreichen, saugen Sie das Medium aus den HELOC-Zellkulturen ab und waschen Sie sie einmal bei 13 Millilitern Raumtemperatur. PBS pro Platte, dann aspirieren. Die PBS stellen jede Platte für einige Sekunden auf die Seite und saugen den Rest der PBS an.

Verwenden Sie als Nächstes einen Zellheber, um die Zellen bis zur Unterkante jeder Platte zu kratzen, und ziehen Sie die Zellen dann in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen. Zum Schluss pelletieren Sie die Zellen in einer Mikrofuge für fünf Minuten bei hundertmal G und bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie nun das PBS aus dem Zellpellet und schätzen Sie das gepackte Zellvolumen oder PCV, indem Sie sich die Abstufung auf dem Röhrchen ansehen.

Geben Sie dann das doppelte Volumen an hypotonischem Puffer wie PCV zum Zellpellet. Schütteln Sie die Tube vorsichtig, um sie wieder zu suspendieren. Die Zellen pipettieren die Zellsuspension vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipette auf und ab, um Zellcluster bei Bedarf zu entfernen.

Pelletieren Sie dann die Zellen unter den gleichen Zentrifugenbedingungen wie zuvor. Nach der Zentrifugation wird die hypotone Pufferschicht vorsichtig abgesaugt. Die Zellen haben begonnen zu schwellen und das Zellvolumen hat sich auf etwa 750 bis 1000 Mikroliter erhöht.

Geben Sie neuen hypotonen Puffer auf ein Endvolumen von 1,5 Millilitern und resuspendieren Sie die Zellen im Puffer. Wieder. Zum Schluss inkubieren Sie die resuspendierten geschwollenen Zellen 10 Minuten lang auf Eis, während die Zellen abkühlen. Spülen Sie einen Homogenisator mit hypotonem Puffer aus und legen Sie ihn dann zusammen mit den Zellen auf Eis.

Trocknen Sie dann den Stößel mit einem feinen Wischer wie einem Kim-Tuch ab. Verwenden Sie eine verlängerte 1000-Mikroliter-Mikropipettenspitze, um den Puffer aus den Downs zu entfernen. Nun mit der Pipette die gekühlten geschwollenen Zellen in die Downs nach unten übertragen.

Ist der kniffligste Teil dieses Verfahrens zu einer erfolgreichen Prüfung auf Lyse. Bewegen Sie den engen Stößel der Böden am Mikroskop langsam fünfmal auf und ab, um die Zellen zu läusieren, und achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden. Übertragen Sie als Nächstes fünf Mikroliter Eloqua der Lys-Zellsuspension in ein Einor-Röhrchen und fügen Sie 10 Mikroliter Trianblau und 15 Mikroliter eines XPBS hinzu.

Geben Sie die Zelllösung auf einen Objektträger und untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop auf Lyse, die Zellkerne der Lyszellen erscheinen nach drei Unzen blau. Es gibt nicht genügend Lyse, da zahlreiche lebende Zellen sichtbar sind. Nach fünf Unzen ist genug Lyse vorhanden.

Zum Schluss werden die Lys-Zellen in das vorgekühlte Einor-Röhrchen überführt und die Zellsuspension fünf Minuten lang in einer Mikrofuge bei 1500 mal G und vier Grad Celsius heruntergeschleudert. Füllen Sie dann das Super Natin vorsichtig in eine neue Tube um, ohne das Pellet zu beschädigen. Schätzen Sie nun das Patch-Kernvolumen oder PNV, indem Sie sich die Abstufung auf dem Rohr ansehen.

Füllen Sie eine Mikropipettenspitze mit einem salzarmen Puffer bei der Hälfte des PNV. Führen Sie dann die Mikropipettenspitze in die Zellkerne am Boden des Einor-Röhrchens ein. Den Puffer langsam in die Zellkerne spritzen, während er vorsichtig mischt.

Schnippen Sie vorsichtig mit dem Rohr, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist. Fügen Sie dann Puffer mit hohem Salzgehalt bei der Hälfte des PNV hinzu und mischen Sie es schnell, indem Sie das Röhrchen umdrehen. Drehen Sie das Rohr 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Zum Schluss schleudern Sie die Kerne in der Mikrofuge 15 Minuten lang bei 18.000 G und vier Grad Celsius herunter. Beginnen Sie mit der Umfüllung von 500 Mikrolitern des Überstands in gekühlte Mikrokonserven. Schleudern Sie den Kernextrakt mit hohem Salzgehalt nach der Zentrifugation 15 Minuten lang bei 14.000 G und vier Grad Celsius herunter, invertieren Sie das Mini-Racon und setzen Sie es in ein neues individuelles EOR-Röhrchen ein.

Nach zwei Minuten Schleudern bei 1000 G und vier Grad Celsius wird der Kernextrakt mit hohem Salzgehalt auf etwa 115 Mikroliter konzentriert. Übertragen Sie nun 45 Mikroliter Aliquots des hochsalzigen Kernextrakts in Mini-Dialyse-SLIs. Stellen Sie sicher, dass die Unterseite der Rutsche mit der Unterseite des Schwimmers übereinstimmt.

Legen Sie die SLIs dann in 500 Milliliter gekühlten Dialysepuffer. Zum Schluss rühren Sie die Aliquots ein bis zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius, der Kernextrakt erscheint nach der Dialyse trüb. Diese Abbildung zeigt repräsentative Daten, die eine gekoppelte RNA-Polymerase, zwei Transkriptions- und Schneidereaktionen in einem kleinen Kernextrakt mit einem nuklearen Massenextrakt vergleichen.

Wenn das A-C-M-V-D-N-A-Konstrukt in den Massen- oder kleinen Extrakten inkubiert wurde, wurden ähnliche Mengen der naszierenden prä-mRNA bis zum Fünf-Minuten-Zeitpunkt nach der Zugabe von alpha und manin synthetisiert, um die weitere Transkription zu blockieren, die Spleißzwischenprodukte und Spleißprodukte akkumulierten sich im Laufe der Zeit mit ähnlicher Kinetik in beiden Arten von Extrakten. Diese repräsentativen Ergebnisse bestätigen, dass die Effizienz des gekoppelten RNA-Polymerase-, Zwei-Transkriptions- und Spleißsystems in den Bulk- und Small-Scale-Kernextrakten ähnlich ist. Um die Nützlichkeit des Extrakts im kleinen Maßstab zu demonstrieren, wurden Methodenextrakte aus Helazellen hergestellt, die mit dem Spleißinhibitor E 7 1 0 7 oder der Negativkontrollverbindung Platy analy F behandelt wurden, und dann wurde ein gekoppelter RNA-Polymerase-Zwei-Transkriptions- und Spleißassay durchgeführt, wie in dieser Abbildung gezeigt, die Transkription durch RNA-Polymerase zwei trat effizient in Extrakten auf, die sowohl aus dem Plaid F als auch aus E 7 1 0 7 hergestellt wurden. Zellen.

Im Gegensatz dazu trat das Spleißen normal in dem Extrakt auf, der aus den mit analysiertem F behandelten Zellen hergestellt wurde, wurde jedoch in den mit E 7 1 0 7 behandelten Zellen aufgehoben. Diese Daten liefern einen Proof of Concept für die Verwendung der kleinskaligen Kernextrakte für die spezielle Behandlung von Zellen im kleinen Maßstab. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als fünf Stunden abgeschlossen werden.