Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reaktionen von Immunzellen auf bakterielle Toxine sichtbar zu machen. Zunächst wird das Toxin in BL 21-Goldzellen exprimiert und aus ihnen gereinigt. Sobald die Aktivität und Konzentration des Toxins bestätigt sind, wird das Toxin an die Immunzellen abgegeben.

Mit einem Mikroinjektor und einer Hochgeschwindigkeits-Lebendzellmikroskopie wird eine Hochgeschwindigkeits-Lebendzellmikroskopie durchgeführt. Die Analyse der resultierenden Bilder zeigt die Echtzeit-Kinetik der Immunzellreaktionen auf das Toxin. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Immunologie zu beantworten, wie z.B. den Mechanismus der Inflammasom-Aktivierung.

Obwohl diese Methode Einblicke in die durch Toxine vermittelten Immunzellreaktionen geben kann, kann sie auch auf andere Stimuli angewendet werden, einschließlich chemotaktischer Traktoren. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir die Interaktion von Bakterien mit kultivierten Immunzellen untersuchten und hochvariable Wechselwirkungen zwischen Bakterien und den Immunzellen beobachteten. Beginnen Sie die Reinigung von Streptokokken Lysin O oder SLO mit einer Kultur von BL 21-Goldzellen, die PAG drei SLO enthalten.

Sein Plasmid wuchs auf eine OD von etwa 0,6 an. Um die Proteinexpression zu induzieren, geben Sie fünf Milliliter mit 20 % des Betriebssystems in die Kultur und schütteln Sie sie drei Stunden lang bei 2 25 U/min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie anschließend die Bakterien in eine 500-Milliliter-Zentrifugenflasche.

Schleudern Sie dann die Kultur nach dem Schleuderdekantieren 12 Minuten lang bei 12.000 Mal G bei vier Grad Celsius. Das Supinat lagert das Pellet über Nacht bei minus 80 Grad Celsius oder bei Bedarf länger. Um das exprimierte SLO zu reinigen, geben Sie 10 Milliliter Waschpuffer, ergänzt mit Triton X 100, Lysozym und Phenylmethylsulfurylfluorid, in die gefrorene Pelletpipette und puptieren Sie sie etwa 15 Minuten lang auf und ab.

Zur Wiederbelebung das Pellet aufhängen und die Probe auf Eis halten. Übertragen Sie das resuspendierte Pellet in ein 50-Milliliter-Eichenfirstrohr aus Polypropylen mit rundem Boden. Beschallung des Lysats mit einer Sonde mit einer Sonde fünfmal für jeweils 30 Sekunden im Abstand von 30 Sekunden mit 30 Sekunden auf Eis dazwischen.

Schleudern Sie dann das Ultraschalllysat bei 39.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern das bakterielle Supinat zu einem Milliliter gewaschenem Nickel NTA Aros hinzufügen. Inkubieren Sie das Nickel NTA aros und lysieren Sie zusammen 2,5 Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln Nach der Inkubation.

Pelletieren Sie die Kügelchen, indem Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 400 mal G drehen. Beachten Sie, dass alle weiteren Waschungen und Elutionen mit diesen Zentrifugationseinstellungen durchgeführt werden und weniger anders angegeben. Nach der Zentrifugation.

Kombinieren Sie 30 Mikroliter des Supinats mit 10 Mikrolitern vierfachem SDS-Probenpuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie es für die Reinheitsanalyse auf Eis auf. Entsorgen Sie dann den Rest des Rückenmarks und waschen Sie die Kügelchen viermal in Läusewaschpuffer. Und wenn Sie Interesse an Salzpufferzentrifugieren zwischen jedem Waschgang Von diesem Zeitpunkt an stellen Sie sicher, dass die Probe immer auf Eis bleibt.

SLO ist ein sehr redoxempfindliches Protein und verliert schnell seine Aktivität, wenn es auf 37 Grad Celsius erwärmt wird, auch wenn es nur für kurze Zeit ist. Um das SLO-Protein zu eluieren, geben Sie einen Milliliter Elutionspuffer und fünf Mikroliter eines molaren DTT zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis. Dann zentrifugieren und das Supinat in einem Fugeröhrchen sammeln, das mit der elucianischen Zahl beschriftet ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um das Endotoxin aus dem SLO-Protein zu erschöpfen, fügen Sie der Probe 200 Mikroliter gewaschene Polymisch-konjugierte Agrokügelchen hinzu, suspendierten Salzpuffer und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dann bei 10.000 Mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius drehen. Nach dem Schleudern den Überstand in neu markierten Mikrozentrifugenröhrchen auffangen.

Kombinieren Sie 30 Mikroliter jeder Elution mit 10 Mikrolitern, vierfachem SDS-Probenpuffer. Speichern Sie für die SDB-Seitenanalyse die SLO-Lösungen auf Eis. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen und die hämolytische Aktivität, wenn sie zufriedenstellend sind, ziehen Sie den SLOE in fünf bis 10 Mikroliter-Quats, frieren Sie ihn dann auf Trockeneis ein und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.

Bestimmen Sie dann die spezifische Lyse. Reese. Suspendieren Sie die zu testenden Zellen zu zwei Zeitpunkten. Zentrieren Sie die sechs Zellen pro Milliliter im Puffer RB mit 20 Mikrogramm pro Milliliter.

Propidiumiodid. Hier werden T 27 A-Zellen getestet. Geben Sie 100 Mikroliter Zellen in separate Mikrozentrifugenröhrchen in jede Vertiefung einer 96-Well-V-Bodenplatte.

SLO wird seriell auf das Zweifache der Endkonzentration in Puffer rb verdünnt. Geben Sie dann entweder 100 Mikroliter Toxin oder 100 Mikroliter Puffer RB in die Zellen und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Typische Endkonzentrationen reichen von 2000 Einheiten pro Milliliter bis 31,25 Einheiten pro Milliliter.

Lassen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer laufen und sammeln Sie Daten mit Filtern für fi, cethrin oder pe. Eine Verschiebung um einen Logarithmus steht für vorübergehend durchlässige Zellen, während eine Verschiebung um drei Logarithmus tote Zellen anzeigt. Berechnen Sie die spezifische Lyse der Zellen, indem Sie den Prozentsatz der toten Zellen in der Kontrolle von der experimentellen mit der hier gezeigten Gleichung einen Tag vor der Versuchsplatte subtrahieren, zentrieren Sie die fünf Makrophagen zweimal auf kollagenbeschichtetem Glas.

Untere 35-Millimeter-Schüsseln. Das für die Toxinabgabe verwendete Mikroskop sollte mit einem invertierten Tisch, einem beheizten Tisch, den entsprechenden Anregungsemissionsfilterwürfeln und, falls vorhanden, einer Berton-Linse ausgestattet sein. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, die Nadel intakt zu den Zellen zu bringen.

Um den Erfolg zu gewährleisten, verwenden wir eine Bertrand-Linse, die normalerweise für die Ausrichtung verwendet wird, um die Nadel zu visualisieren, während wir sie durch die Fokusebenen führen. Das Mikroskop sollte an einen Mikroinjektor angeschlossen sein und von einem Computer mit ausreichendem Speicher gesteuert werden, um Daten zu sammeln und zu speichern, das Mikroskop und den Mikroinjektor einzuschalten und den beheizten Tisch auf 37 Grad Celsius erwärmen zu lassen, während darauf gewartet wird, dass sich der Tisch erwärmt. Markieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit Farbstoff bei 37 Grad Celsius.

Je nach Assay kann die Markierung mit fünf Mikrolitern, vier oder 2:00 AM in einem Milliliter, HBSS oder zwei Mikroliter Calcium am in einem Milliliter Vollmedium erfolgen, hier werden vier oder zwei verwendet. Entfernen Sie das Zellmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es durch einen Milliliter RPMI, der mit zwei Millimolaren Calciumchlorid ergänzt wird.

Montieren Sie die Schüssel am Mikroskop, bringen Sie die Zellen mit einem Hellfeld in den Fokus und stellen Sie sie dann so ein, dass sie leicht über den Zellen fokussiert wird. Kombinieren Sie anschließend einen Mikroliter SLO-Toxin, vier Mikroliter, 10 Milligramm pro Milliliter, DEXTRA 5 55 und sechs Mikroliter Wasser. Zentrifugieren Sie dann Ihre 20.000 Mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Dextran wird verwendet, um zu überprüfen, ob die Femtospitze nicht G-verstopft ist. Verwenden Sie einen Mikrolader, um zwei Mikroliter verdünntes Toxin von hinten in die Femtospitze zu laden. Laden Sie die Femtospitze auf den Mikroinjektor.

Stellen Sie dann den Winkel des Injektors so ein, dass die Spitze über der Mitte der Zellen sitzt und sich in alle Richtungen bewegen kann, löschen Sie die vorherigen Einstellungen für die Z-Grenze, die begrenzt, wie tief die Mikroinjektorspitze gehen kann. Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass er 0,5 Sekunden lang bei 120 PSI und 20 PSI Gegendruck einspritzt. Senken Sie dann die Spitze ab, bis sie in das Medium eintritt.

Mit dem Bertrand-Objektiv. Zentrieren Sie die Spitze und folgen Sie der Spitze, während sie näher an die Zellen gesenkt wird. Sobald die Nadel unscharf ist, schalten Sie wieder auf die normale Optik um.

Der Nadelschatten sollte im Feld sichtbar sein. Fokussieren Sie oberhalb der Zellen und senken Sie die Nadel, bis sie scharf gestellt wird. Bringen Sie dann die Zellen in den Fokus und bringen Sie die Nadel vorsichtig in die Nähe einer Zelle.

Nachdem Sie die Z-Grenze für die Injektion eingestellt haben, beginnen Sie mit der Bildgebung und injizieren Sie das Toxin. Heben Sie dann die Nadel an und bewegen Sie sich zu einer neuen Zellregion. Injizieren Sie zusätzliches Toxin und setzen Sie die Bildgebung nach der Injektion fort.

Bewegen Sie die Nadel in die Ausgangsposition, um ein unerwünschtes Austreten von Toxin aus der Nadel zu verhindern, indem Sie die in diesem Video beschriebene Methode anwenden, von 10 bis sieben bis 10 bis acht Einheiten pro Milliliter. SLO wird typischerweise mit einer Proteinkonzentration von vier Milligramm pro Milliliter erhalten. Dieses SDS-Seitengel zeigt Bakterienproben vor und nach der Toxininduktionsrate nach der Reinigung, und jede der drei Ellucian-Kamasi-Blau-Färbungen zeigt, dass das induzierte SLO erfolgreich gereinigt wurde.

SLO ist die Bande bei 69 Kilodalton, um die Menge an Toxin zu bestimmen, die für die Lyse von T 27 A oder D zwei Zellen erforderlich ist. Die Zellen wurden fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von Propidiumiodid mit verschiedenen Konzentrationen von SLO provoziert und mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die spezifische Lyse wurde bestimmt, wie hier gezeigt.

250 Einheiten pro Milliliter. SLO ergibt eine 50%ige Lyse von T 27 A und D zwei Zellen. Eine sub litische 10%ige Lysedosis des Toxins würde 62,5 Einheiten pro Milliliter betragen.

Diese Werte sind wichtig für die Benchmark-Toxinaktivität zur Beurteilung des Zelltods nach Toxinexposition. Humane dermale Fibroblasten wurden mit Calcium- und Atherium-Homodimer unter Verwendung eines Lebendtod-Kits von life technologies inkubiert. Nach lokalisierter Exposition gegenüber dem bakteriellen Toxin Anthrolysin O.In diesem Bild ist Calcium in grün und Atheriumbromid in roten Regionen in der Nähe des Mikrobioms dargestellt, zeigt einen Zelltod, der durch Kalziumverlust und die Aufnahme von Homodimeren gekennzeichnet ist, während Regionen, die weiter von der Spitze entfernt sind, keine Schäden aufweisen.

Mikroabgabe des Toxins ermöglicht auch die Untersuchung von Echtzeitereignissen wie dem Kalziumfluss. Diese menschlichen DCs, die mit 4:02 AM beladen waren, wurden SLO bei konstanter Flussrate mit gleichzeitiger Live-Bildverschiebung von grün nach blau ausgesetzt. Pseudofarbe weist auf einen Anstieg des zytosolischen Kalziumspiegels hin.

SLO induziert einen schnellen Anstieg des zytosolischen Kalziums, das aufgrund der lokalisierten Abgabe durch den Bereich der Schale vermehrt wird. Allerdings stoßen nur Zellen in der Nähe der Mikroinjektorspitze auf Reaktorgift. Dies zeigt sowohl eine zelluläre Reaktion auf Toxin als auch den räumlich begrenzten Bereich der Toxinabgabe zur Auflösung von Ereignissen in der zdi-Dimension.

Die Mikroverabreichung wurde mit konfokaler Hochgeschwindigkeits-3D-Mikroskopie kombiniert. Diese Reihe von Bildern zeigt dendritische Zellen nach der Toxininjektion. Sie wurden mit Anti-CD 11 C vorinkubiert, das an ein grün dargestelltes PC konjugiert wurde, um die Plasmamembran zu markieren.

Wie hier zu sehen ist, werden Mikrovesikel nach der Toxinabgabe freigesetzt. Als Teil des zellulären Reparaturprozesses werden Toxinmoleküle auf Bläschen konzentriert, die abgestoßen werden, um Toxine zu eliminieren. Sobald die Mikroskopie beherrscht ist, kann sie in 45 Minuten durchgeführt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Toxin kalt zu halten, bevor es sich mit den Zellen vermischt, und die hämolytische Aktivität zu testen. Gut. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kinetik der Reaktionen von Immunzellen auf bakterielle Toxine mithilfe der Lebendzellmikroskopie in Echtzeit messen können.