Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Das übergeordnete Ziel dieses mikroskopiebasierten Ansatzes ist es, einen zentralen Prozess während des Wachstums von Bakterienzellen zu beobachten. Mit dieser Methode können wir wichtige Fragen der Bakteriologie beantworten, wie z.B. wie essentielle Prozesse beim Wachstum und der Teilung von Bakterienzellen koordiniert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, fluoreszierende Reagenzien zu verwenden, um bakterielle Zelloberflächen und -strukturen in lebenden Zellen sichtbar zu machen.

Hier nutzen wir diese Methode, um Einblicke in wesentliche Prozesse in Agrobacterium tumefaciens zu geben. Dieser Prozess könnte jedoch auch auf andere Bakterien übertragen werden, um deren Wachstum zu untersuchen. Verwenden Sie zu Beginn ein steriles Holzstäbchen oder eine Pipettenspitze, um drei Milliliter ATGN Growth Medium mit einer einzigen Kolonie eines Wildtyp- oder mutierten Stammes von A. Tumifaciens zu impfen.

Züchten Sie die Kultur bei 28 Grad Celsius und 225 U/min über Nacht. Verwenden Sie am nächsten Tag ein Spektralphotometer, um den OD600 zu messen. Verdünnen Sie dann die Zellkultur auf einen OD600 von ca. 0,2 und züchten Sie die Zellen weiter auf einen OD600 von 0,6.

Geben Sie einen Milliliter Exponentialkultur in drei Mikrofuge-Röhrchen ab. Und pelletieren Sie die Zellen in einer Desktop-Zentrifuge bei 7.000 x g für fünf Minuten. Suspendieren Sie jedes Zellpellet erneut in einem Milliliter PBS und fügen Sie dann entweder einen Mikroliter DMSO Orange-Stammlösung oder DAPI-Stammlösung hinzu.

Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie die resuspendierten Zellen fünf Minuten lang im Dunkeln. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 7.000 x g für fünf Minuten und suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter PBS, um überschüssiges Reagenz zu entfernen. Waschen Sie dann die Zellen noch zwei weitere Male und suspendieren Sie das Pellet wieder in 50 Mikrolitern PBS oder Medium.

Kombinieren Sie für die gleichzeitige Zeitraffer-Bildgebung zehn Mikroliter Zellen aus jeder Behandlung in einem neuen Mikroschleierröhrchen. Um Agarose-Pads für die Zellbildgebung vorzubereiten, verwenden Sie ein Deckglas als Leitfaden und schneiden Sie ein 22 x 22 Millimeter großes Quadrat Laborfilm ab, indem Sie mit einem Skalpell um die Ränder fahren. Schneiden Sie aus der Mitte der Laborfolie ein Quadrat aus und lassen Sie dabei einen etwa zwei bis fünf Millimeter breiten Rand übrig, der als Dichtung für das Agarose-Pad dient.

Entsorgen Sie dann den mittleren Ausschnitt. Legen Sie die Foliendichtung auf einen Objektträger, der mit einem ammoniak- und alkoholfreien Reiniger gereinigt wird. Und verwenden Sie einen auf 70 Grad Celsius eingestellten Heizblock oder eine Flamme, um den Objektträger zu erhitzen, bis die Folie leicht auf dem Glas aufgeschmolzen ist.

Bereiten Sie als nächstes die Agaroselösung vor, indem Sie etwa 0,075 Gramm Agarose und fünf Milliliter Medium in einem kleinen Kolben mischen. Erhitzen Sie die Lösung in einer Mikrowelle unter periodischem Schwenken, bis sich die Agarose aufgelöst hat und die Lösung klar ist. Halten Sie die Agaroselösung bei 55-70 Grad Celsius und verwenden Sie sie innerhalb von 48 Stunden für den Bau mehrerer Agarose-Pads.

Pipettieren Sie das warme Agarose-Medium in die Mitte der Dichtung. Legen Sie dann einen Deckslip über die Dichtung, um die Agarose gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie den Objektträger auf eine kühle, ebene Oberfläche, damit er etwa zwei Minuten lang fest wird.

Schieben Sie nun vorsichtig den Deckslip vom Agarose-Pad ab und lassen Sie das Agarose-Pad ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen, bis die Oberfläche des Pads trocken erscheint. Die richtige Konstruktion des Agarose-Pads ist entscheidend für die Aufnahme hochwertiger Bilder. Versuchen Sie nicht, Bilder auf einem schlechten Block zu erstellen.

Wenn das Agarose-Pad austrocknet, sich wellt oder reißt, ist es am besten, nicht faul zu sein und stattdessen ein neues Pad herzustellen. Entfernen Sie dann mit einem Skalpell einen kleinen Streifen Agarose, um eine Lufttasche von etwa zwei mal sieben bis zehn Millimetern zu erzeugen. A.Tumefacien-Zellen neigen dazu, am besten in der Nähe der Lufttasche zu wachsen.

Platzieren Sie 0,8 bis 1 Mikroliter Zellen auf dem Agarose-Pad. Legen Sie dann vorsichtig einen Deckbogen über die Oberseite des Agarose-Pads, um die Zellen auf der Oberfläche des Pads zu verteilen. Verwenden Sie für Langzeit-Zeitrafferaufnahmen geschmolzenes Valap, um die Kanten des Deckglases zu versiegeln.

Achten Sie darauf, alle Kanten und Ecken des Deckglases mit Valap abzudichten. Andernfalls kann es während der Zeitrafferaufnahme des Agarose-Pads zu Drift kommen. Um die Epifluoreszenzmikroskopie durchzuführen, geben Sie Immersionsöl auf das gewünschte Objektiv und legen Sie den umgedrehten Objektträger in den Objektträgerhalter auf dem Tisch.

Verwenden Sie die Fokussierknöpfe, um die Zellen in den Fokus zu bringen. Erfassen Sie Bilder in Phase oder DIC und Fluoreszenz mit dem gewünschten Fluoreszenzfilter für Fluoreszenzbilder. Optional können Sie mehrere x- und y-Positionen erfassen, indem Sie nach dem Zufallsprinzip zehn Zellfelder in unmittelbarer Nähe der Lufttasche der Agarose-Pads auswählen.

Richten Sie die Zeitsequenzerfassung so ein, dass sie im gewünschten Zeitintervall (In-Phase) abgebildet wird. Wie hier gezeigt, wurden Zellen direkt aus der Kultur abgebildet, nachdem sie durch Zentrifugation gewaschen und die Zellen mit 0,1 Prozent DMSO inkubiert hatten, zeigten die Ergebnisse, dass DMSO allein die Zellmorphologie nicht beeinflusst. Sowohl Orange als auch DAPI markierten DNA in lebenden A.Tumefaciens-Zellen.

In späten Zellen vor der Teilung werden zwei unterschiedliche Nukleoloide mit Orange-Färbung beobachtet, während die DNA-Markierung mit der DAPI-Färbung diffuser erscheint. In diesem Zeitraffer-Experiment mit einem gleichen Anteil an unmarkierten, DAPI-markierten und orangefarbenen Wildtyp-Wildtyp-A.Tumefaciens wuchsen alle Zellen, wenn sie mit Phasenkontrastmikroskopie abgebildet wurden, was darauf hindeutet, dass keine der beiden Färbungen das Zellwachstum beeinträchtigte. Die Zellen wuchsen auch unter Phasenkontrast in der Epifluoreszenzmikroskopie mit dem TRITC-Filter.

Bei der Abbildung mit dem DAPI-Filter hörten die Zellen jedoch innerhalb einer Stunde auf zu wachsen. Nach ähnlichen Methoden können auch andere fluoreszierende Reagenzien verwendet werden, um die bakterielle Zellwand oder Membranen sichtbar zu machen. Darüber hinaus können viele dieser Fluoreszenzfarbstoffe kombiniert werden, um ein umfassendes Bild der bakteriellen Zelloberfläche zu erhalten.

Die Visualisierung essentieller Prozesse in lebenden Bakterien ist spannend, da sie die Möglichkeit eröffnet, diese Prozesse in bedingten Mutanten oder Nicht-Modellbakterien zu untersuchen. Dies ermöglicht es uns, unsere Studien über verschiedene Bakterienarten zu verbessern.