Analyse von Yersinia enterocolitica Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Translokation von Effektorproteinen in Wirtszellen über das Vernien-Typ-3-Sekretionssystem zu messen. Dies wird durch die Inkubation von Ferela-Zellen mit Yersinien-Mutanten erreicht, die Effektor-TEM-1-Beta-Lactamase-Fusionen exprimieren, um eine Translokation von Effektorfusionen in die HELOC-Zellen zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt werden die infizierten HELOC-Zellen mit einer zellpermeierten Bundreporterverbindung beladen, die durch zelluläres Östro zu dem in fluoreszierenden CCF vier geladenen Prozessor verarbeitet und dadurch in der Zelle gefangen wird.

Als nächstes führt die Spaltung von CCF vier durch die translokalisierte Beta-Lactamase zu einer Störung von Fre, die mittels Laser-Scanning-Mikroskopie aufgezeichnet wird, um die Fluoreszenzintensitäten von Donor und Akzeptor zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Mengen an translokalisiertem Effektor TEM 1 Beta-Lactamase-Fusion, basierend auf unterschiedlichen Kinetiken des Anstiegs der Donorfluoreszenz. Einer der Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die interzelluläre Prozessierung der CCF-Vier-Verbindung ein hochspezifisches und empfindliches Werkzeug zur Messung der Translokation darstellt.

Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, z.B. wie die Translokation während der Interaktion von Bakterien und Wirtszellen einen Tag vor der Infektion fein abgestimmt wird. Drei separate Durchstechflaschen mit drei Millilitern LB-Medium und den erforderlichen Antibiotika werden mit einer Kolonie aus jedem der transformierten Stämme von Y enterocolitica geimpft, die wie im Begleittextprotokoll beschrieben hergestellt wurden. Bereiten Sie außerdem am Tag vor der Infektion Platten mit Ferla-Zellen vor, indem Sie 15.000 Zellen in 200 Mikrolitern Kulturmedium in neun Vertiefungen einer 96-Well-Platte säen und die Zellen am Tag der Infektion in einem 5%-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Impfen Sie zwei Milliliter der Übernachtkultur in 40 Milliliter frisches lb-Medium ohne Antibiotika. Inkubieren Sie die Bakterien 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Shaker bei 180 U/min. Dies induziert die Expression des Typ-3-Sekretionssystems nach 90 Minuten, die Kulturen werden in ein frisches Röhrchen überführt und die Kulturen auf Eis gehalten.

Von diesem Punkt an. Zentrifugieren Sie die Kulturen 10 Minuten lang bei 5.000 g und vier Grad Celsius, um die Bakterien zu pelletieren. Als nächstes wird das Pellet in zwei bis drei Millilitern eiskaltem PBS erneut suspendiert, die Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 800 Millionen koloniebildenden Einheiten pro Milliliter verdünnt und dann die Kulturen auf Eis gelegt.

Bestimmen Sie dann die entsprechende optische Dichte jeder Kultur. Geben Sie 3,5 Mikroliter der Bakteriensuspension von jedem Stamm in verschiedene Vertiefungen der vorbereiteten 96. Well, Teller und Mischen, indem das Medium zweimal vorsichtig pipettiert wird, lassen Sie die Bakterien mit einer maximalen Infektionswahrscheinlichkeit von etwa 100 Bakterien pro Zelle auf den Zellen sedimentieren.

Führen Sie einen Zeitverlauf durch, indem Sie Infektionen in 30-Minuten-Intervallen starten und die Zellen in einer 5%-CO2-Kammer bei 37 Grad Celsius halten. Nach jeder Infektion, 90 Minuten nach der ersten Infektion, aspirieren Sie das Medium vorsichtig, ohne eine der Helazellen zu entfernen. Fügen Sie dann 50 Mikroliter PBS hinzu, das 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 2,5 Millimolar Pronic enthält.

Dadurch wird die Expression von Effektoren gestoppt und der Export von CCF vier reduziert. Um die Mikroskopie vorzubereiten, stellen Sie ein kontinuierliches Eintauchen sicher, indem Sie das Immersionsmedium mit einer Ein-Milliliter-Spritze auf den Boden der Vertiefungen verteilen. Vermeiden Sie es, Luftblasen im Immersionsmedium einzuschließen.

Übertragen Sie dann die 96-Well-Platte auf den Mikroskoptisch und lokalisieren Sie jeweils geeignete Stellen für die spätere Analyse. Nun, beenden Sie diesen Schritt innerhalb von 10 Minuten. Geben Sie dann jeweils 70 Mikroliter CF 4:00 AM Ladelösung hinzu.

Inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Als nächstes aspirieren Sie die Ladelösung und fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu, das 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 2,5 Millimolare Pronic enthält. Starten Sie dann schnell die Mikroskopie.

Setzen Sie ein Immersionsobjektiv mit 20-facher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur ein, öffnen Sie die Lochblende des Detektors auf 2,5 luftige Einheiten und übertragen Sie die 96-Well-Platte in den konfokalen Laserscanning-Tisch. Wählen Sie als Nächstes hochempfindliche Galliumarsenidphosphat-Detektoren mit gleichzeitig aktiven Donor- und Akzepterkanälen. Dreifache Rahmenmittelung mit acht Bit Tiefe und Anregung mit 10% eines 405-Nanometer-Diodenlasers.

Um eine korrekte Quantifizierung zu gewährleisten, stellen Sie die Detektorverstärkung beider Kanäle auf den gleichen Wert ein und vermeiden Sie gesättigte Pixel. Aktivieren Sie anschließend das Durchlicht und überprüfen Sie die repräsentativen Sichtfelder in jedem Fall erneut, passen Sie die Positionen an und speichern Sie sie bei Bedarf mit einem kalibrierten Automatiktisch. Stellen Sie abschließend den Zeitraffer auf zwei Minuten und die Dauer auf zwei Stunden ein und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.

Importieren Sie den Datensatz nach der Bildaufnahme in eine Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrizen ermöglicht. Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mit dem gleichen Offset, indem Sie zuerst auf Menü klicken, und gehen Sie dann zur Bildverarbeitung und wählen Sie Grundliniensubtraktion. Wählen Sie dann jeden Kanal aus und geben Sie den Basiswert ein.

Korrigieren Sie das Durchbluten des Donorkanals, leiten Sie den ersten Kanal in den Akzeptorkanal Kanal zwei mit dem vorgegebenen Korrekturfaktor, und erstellen Sie einen neuen Kanalkanal zwei zu diesem Zweck. Klicken Sie auf das Menü und wählen Sie dann Bildverarbeitung gefolgt von Kanalarithmetik und geben Sie den absoluten Wert von Kanal zwei 33 Mal subtrahiert durch Punkt ein. Löschen Sie anschließend Kanal eins Kanal zwei, und stellen Sie sicher, dass das Durchbluten des korrigierten Accepter-Kanals als neuer Kanal zwei erhalten bleibt.

Erstellen Sie dann einen neuen Kanal mit der hier gezeigten Operation, um den relativen Bundkoeffizienten zu bestimmen. Gehen Sie als Nächstes zurück in das Menü für Kanalarithmetik und geben Sie Kanal zwei geteilt durch Kanal eins plus Kanal zwei ein, um den Bundkanal richtig zu visualisieren. Erstellen Sie in einem Acht-Bit-Image einen vierten Kanal Kanal vier, der dem 255-fachen des dritten Kanals entspricht.

Ändern Sie die Kanalfarbe, indem Sie zum Menü "Bildeigenschaften" gehen, Kanal vier auswählen, dann "Zugeordnete Farbe", gefolgt von "Farbtabellendatei" und dann "Jet". Wenden Sie als Nächstes einen Medianfilter von drei x drei auf die Kanäle drei und vier an. Dadurch wird das Rauschen in den Bildern reduziert, indem Sie das Bildverarbeitungsmenü aufrufen und die Option Glättung auswählen.

Gefolgt von einem Medianfilter, wählen Sie beide Kanäle aus und wenden Sie eine Filtergröße von drei mal drei mal eins an, um zelluläre Signale zu quantifizieren. Erkennen Sie die Zellen in Kanal vier, indem Sie Ansicht übertreffen auswählen und auf das Symbol klicken. Fügen Sie neue Flächen hinzu.

Definieren Sie die Parameter des Erkennungsalgorithmus im Oberflächenfenster und aktivieren Sie die beiden Kontrollkästchen. Segmentieren Sie nur einen Bereich von Interesse und verarbeiten Sie das gesamte Bild. Definieren Sie schließlich den interessierenden Bereich, indem Sie seine Abmessungen bearbeiten.

Wählen Sie Kanal vier als Quellkanal aus und stellen Sie den Schwellenwert ein, indem Sie zum Schwellenwertmenü gehen und die Option Hintergrundsubtraktion auswählen. Stellen Sie den Durchmesser auf 10 Mikrometer, den minimalen Intensitätsschwellenwert manuell auf null und den maximalen Schwellenwert auf die maximale Intensität ein. Filtern Sie die Strukturen nach Fläche und setzen Sie den Mindestwert auf 187 Quadratmikrometer.

Beenden Sie dann die Oberflächenerkennung. Extrahieren Sie schließlich die Mittelwerte für die Fluoreszenzintensität des Donors im ersten Kanal und den relativen Bundkoeffizienten im dritten Kanal zusammen mit ihren Standardabweichungen in der zellulären Einheit. Um die Fähigkeit dieser Methode zu zeigen, die Effektortranslokation in Zielzellen quantitativ zu analysieren, wurden zwei Yersinienstämme mit unterschiedlicher Translokationskinetik untersucht, wobei sowohl die Donorfluoreszenz als auch die relativen Fret-Koeffizienten verwendet wurden.

Die Wildtyp-infizierten Zellen zeigen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit. Erwartungsgemäß korreliert die maximale Steigung der Fluoreszenzintensität positiv mit der Dauer der Infektion, was darauf hindeutet, dass in Übereinstimmung mit früheren Studien verschiedene Konzentrationen von translatierter Beta-Lactamase unterschieden werden können. Zellen, die mit der Yersinia YOPE-Deletionsmutante infiziert sind, zeigen einen schnelleren Anstieg der Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

Interessanterweise beschleunigte die Verlängerung der Infektion auf 90 Minuten den Anstieg der Donorfluoreszenz im Vergleich zu 60 Minuten der Infektion nicht weiter. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass die Verarbeitung der CCR-Vier-Verbindung unmittelbar nach ihrer Zugabe beginnt. Daher ist es wichtig, rechtzeitig mit der Bildaufnahme zu beginnen.