Name: Analyse von Yersinia enterocolitica Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Effektor-Translokation in HeLa-Zellen mittels Beta-Lactamase-Fusionen und FRET-Reporter. Diese Methode ermöglicht die quantitative Untersuchung bakterieller Virulenzmechanismen bei Yersinia enterocolitica.

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Wir danken Dr. Antonio Virgilio Failla für die Bereitstellung des FRET-Erfassungsquantifizierungsalgorithmus und Erwin Bohn für die Bereitstellung der Konstrukte pMK-bla und pMK-ova.

1. Spitzenemission und Übersprechen Bestimmung (siehe auch Abbildung 2) <ol><li> Um die Emissionsspitzen und die Höhe des Übersprechens zwischen dem Donor (Cumarin-Derivat V450) und Akzeptor (Fluorescein) Farbstoffe zu bestimmen, führen spektralen Scans von Zellen, die sowohl einzelne Fluorophore bei 405 nm Anregung bezeichnet. </li><li> Bestimmen einer 10 nm Bandbreite, innerhalb der Spitze von jedem Farbstoff, der für die Donor- und Akzeptor-Kanälen (hier: 455-465 nm und 525-535 nm) verwendet wird. Zeichnen Sie die normierte Intensität über der Wellenlänge und die Berechnung der durchschnittliche Prozentsatz der Übersprechen der Donor-Farbstoff in der Akzeptor-Kanal und umgekehrt (Abbildung 2). </li></ol> 2. Herstellung von Y. enterocolitica Stämme für die Zellkultur-Infektion <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Stämme: WA-314 pMK-Eizellen und (WA-314 mit den Plasmiden pMK-bla 17 und PMK-17-Eizellen bzw. transformiert) WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformiert mit dem Plasmid pMK-bla 17) </li><li> Mindestens zwei Tage vor der Infektion Strähne Y. enterocolitica WA-314 pMK-Eizellen, WA-314 pMK-bla und cryo Bestände auf LB-Agarplatten, die die erforderlichen Antibiotika (Kanamycin für WA-314 pMK-bla und WA-314 pMK-Eizellen WA-314ΔE pMK-BLA ; Kanamycin und Tetracyclin für WA-314ΔE pMK-bla) und wachsen O / N bei 27 ° C. Danach halten die Platten für bis zu einer Woche bei 4 ° C. </li><li> Einen Tag vor der Infektion zu impfen 3 ml LB-Medium, das die erforderlichen Antibiotika mit einer Kolonie der jeweiligen Stämme und inkubieren O / N bei 27 ° C in einem Schüttler bei 180 UpM. </li><li> Am Tag der Infektion zu impfen 2 ml des O / N-Kultur in 40 ml frisches LB-Medium ohne Antibiotika und Inkubation für 90 min bei 37 ° C in einem Schüttler bei 180 rpm, um die Expression des Typ-III-Sekretionssystem induzieren. </li><li> Übertragen Sie die Kulturen in ein geeignetes Rohr und die Kulturen zu halten auf Eis oder bei 4 ° Cvon jetzt an. Zentrifugieren die Kulturen 10 min bei 5000 × g und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in 2-3 ml eiskaltem PBS. Verdünnen der Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 8 x 10 8 cfu / ml unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bestimmen Sie die entsprechende optische Dichte individuell. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis, bis die Infektion der HeLa-Zellen. </li></ol> 3. Überzug HeLa-Zellen <ol><li> Einen Tag vor der Infektion Saatgut 1,5 x 10 4 Zellen HeLa-Zellen in 200 ul DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte und pflegen in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Seed drei Brunnen für jeden Stamm (drei unterschiedlichen Inkubationszeiten). </li></ol> 4. Die Infektion von HeLa-Zellen und Laden mit CCF4 <ol><li> Infizieren HeLa-Zellen durch Zugabe von 3,5 ul der Bakteriensuspension auf das Medium und mischen durch vorsichtiges Pipettieren das Medium zweimal. Lassen Sie sich die Bakterien zu sedimentieren aufzu den Zellen bei einer MOI (Gruppierung of infection) von etwa 100 Bakterien pro Zelle. Für eine Zeit Kurs beginnen Infektionen bei -90 min, -60 und -30 min min und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator bis 0 min, um einen gemeinsamen Endpunkt zu erreichen. </li><li> Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, wird das Medium sorgfältig absaugen, ohne HeLa-Zellen und 50 &amp; mgr; l PBS, das 20 ug / ml Chloramphenicol, um die Expression von Effektoren und 2,5 mM Probenecid zu stoppen, um den Export von CCF4 reduzieren. </li><li> An dieser Stelle überweisen Sie den 96-Well-Platte in den Mikroskoptisch, und definieren geeignete Plätze für eine spätere Analyse in jede Vertiefung. Beenden Sie den Schritt innerhalb von 10 Minuten (für Details der Akquisition siehe Abschnitt 5.1). </li><li> Pro Loch, fügen Sie 70 ul CCF4 / AM Beladungslösung (0,24 &amp; mgr; l Lösung A, 1,2 ul Lösung B, 18,56 &amp; mgr; l Lösung C (Lösung A, B und C innerhalb CCF4 / AM Lade Kit enthalten) und 50 ul PBS (enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid) unter Verwendung einer Mehr pipette und Inkubation für 5 min bei RT. Von nun an Arbeiten ohne Unterbrechungen. </li><li> Absaugen Beladungslösung und 100 ul PBS, enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid mit einem Multipipette. Dann schnell die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen in den Mikroskoptisch und starten Akquisition innerhalb von 10 Minuten vom Streben der Beladungslösung. </li></ol> 5. Laser Scanning Mikroskopie und Analyse von Daten <ol><li> Bilderfassung <ol><li> Setzen die Bilderzeugungsbedingungen in einer Weise, um die Gesamtphotonenzahl zu maximieren und Phototoxizität, Photobleichen und Queranregung. <ol><li> In einer modernen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, mit einem 20X hoher numerischer Apertur Sionsobjektiv, öffnen Sie den Detektor Pinhole bis 2,5 Airy-Einheiten (dh breite optische Schnitte), wählen Sie eine hohe Empfindlichkeit GaAsP-Detektoren gleichzeitig aktive Donor und Akzeptor-Kanäle, 8 Bit-Tiefe , ~ 750 nm Pixelgröße, 3-fach-Rahmen Mittelwertbildung und excite mit 10% einer 405 nm Laserdiode. </li><li> Um zu gewährleisten, stellen Sie die korrekte Quantifizierung Detektor-Verstärkung beider Kanäle auf den gleichen Wert und zu gesättigten Pixeln zu vermeiden. Anmerkung: Hier wurden die Gewinne zu 150% festgelegt. </li></ol></li><li> Sicherzustellen Überflutung durch Spreizen Sionsmediums zum Boden der Vertiefungen, beispielsweise mit einer 1 ml Spritze und das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Aktivieren Sie den Durchlicht und finden Sie eine repräsentative Sichtfeld in jeder gut. Verwenden Sie eine richtig kalibriert automatische Bühne und markieren Sie die Position in der Software. </li><li> Nach der Entfernung der Platte für die Färbung (siehe Abschnitt 4.3), legen Sie die Platte und fügen Sie ein Gewicht auf den Brenndrift zu vermeiden. Überprüfen Sie die gespeicherten Positionen mit der Laser-Scanning-Modus und stellen Sie den Fokus und Seitenlage richtig. </li><li> Stellen Sie den Zeitablauf bis 2 Minuten, die Dauer bis 2 Stunden und starten Akquisition. </li></ol></li><li> Bildquantifizierung (Beispiele für Bitplane Softw gegeben werdensind wie Imaris) <ol><li> Importieren Sie die Datenmenge in Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrix ermöglicht. Tun Sie dies durch Ziehen und Ablegen die Quelldatei, die sowohl den Donor und Akzeptor-Kanal auf das Software-Symbol. </li><li> Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mit den gleichen Versatz. Um dies zu tun, klicken Sie auf Menü und dann auf Bild&gt; Verarbeitung&gt; Basisliniensubtraktion. Wählen Sie jeden Kanal und geben Sie den Ausgangswert. </li><li> Korrigieren Sie den Durchschlag des Spenders Kanal (CH1) in das Akzeptor-Kanal (CH2) mit der vorgegebenen Korrekturfaktor f (siehe 1.1), die Schaffung eines neuen Kanal: Ch2 &#39;= CH 2 - Ch1 * f HINWEIS: Ein Durchschlagen des Akzeptors in den Spender Kanal nicht über die Höhe der Rausch nachweisbar. <ol><li> Klicken Sie auf Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Danach löschen Sie Kanal 2, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Kanäle löschen. Sicherzustellen, dass dieDurchschlagen korrigiert Akzeptorkanal bleibt der neue Kanal 2. Optional: Ändern Sie den Kanal Farbe von grau auf die ursprüngliche Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Grundfarbe und ändern Sie es in zB grün. </li></ol></li><li> Erstellen Sie einen neuen Kanal mit den folgenden Vorgang, um die relative FRET Koeffizienten zu bestimmen: Ch3 = CH 2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;) <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben ch2 ./ (ch1 + ch2) </li></ol></li><li> Für die richtige Visualisierung der FRET-Kanal in einem 8-Bit-Bild, erstellen Sie einen vierten Kanal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie 255 * CH 3. Ändern Sie den Kanal Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Farbtabelle Datei&gt; Jet. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine 3x3 Medianfilter, um die Kanäle CH3 und CH4 that das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Um dies zu tun, Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Glätten&gt; Median-Filter klicken. Wählen Sie beide Kanäle und einen Filter Größe &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Zur Quantifizierung von zellulären Signalen, erkennen die Zellen in Ch4 durch geeignetes Einstellen der Offset und filtern Sie die Strukturen durch Größe, um zu kleine Strukturen auszuschließen. <ol><li> Wählen Sie die Surpass-Ansicht und klicken Sie auf das Symbol &quot;Neue Oberflächen&quot;. Definieren Sie die Erkennungsalgorithmus Parameter in der Oberflächen Fenster. Für eine schnellere Verarbeitung, aktivieren Sie die beiden Checkboxen &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; und &quot;Prozess gesamte Bild endlich&quot;. Definieren Sie die Region von Interesse, indem Sie ihren Dimensionen. </li><li> Wählen Sie Channel 4 als Quellkanal und stellen Sie die Schwelle durch Thresholding&gt; Hintergrund Subtraktion (Local Contrast) und stellen Durchmesser bis 10 um. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle manuell auf 0 und die maximale Schwelle der maximalen intensiviertty. Filtern Sie die Strukturen durch Bereich und den Minimalwert auf zB 187 um². Beenden Sie die Oberflächenerfassung. </li></ol></li><li> Extrahieren der Mittelwerte für Donorfluoreszenzintensität (Ch1) und die relative FRET Koeffizienten (CH3) und ihre Standardabweichungen im zellularen Entität. Um dies zu tun, gehen Sie auf die Oberflächeneigenschaften. Ändern Sie das Aussehen der Strukturen durch Auswahl Surfaces Style / Qualität&gt; Surface. Wählen Sie alle Strukturen, indem Sie auf die Registerkarte Filter. Vereinheitlichen Sie die erfassten Strukturen, indem Sie auf Auswahl&gt; Unify verarbeiten. Exportieren Sie die Oberfläche Statistiken in MS Excel, indem Sie auf der Registerkarte Statistik&gt; Export Alle Statistiken in Datei. </li><li> Zeichnen Sie diese Werte im Laufe der Zeit. Identifizierung der 10 min-Intervall der maximalen Steigung der Spenderkanal Fluoreszenzzunahme für jede Bedingung als eine vernünftige Parameter, um die Menge an transloziert Effektor darzustellen. Berechnung der Steigung m = Δ Donorfluoreszenzintensität / Δ Zeit (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir hier erfolgreich angewendet ein TEM-1-beta-Lactamase-Reporter-basierten Assay für die quantitative Analyse von Effektorzellen Translokation von Y. enterocolitica. Viele verschiedene Variationen dieses empfindliche, spezifische und relativ einfache Technik, wurden in der Literatur beschrieben worden. In dieser Studie wurde der Laser Scanning Mikroskopie für die empfindlichsten und präzise Detektion von Fluoreszenzsignalen durchgeführt. Insbesondere die Korrektur für das Übersprechen zwischen den Don...

Typ III-Sekretion Systeme sind von verschiedenen spezialisierten Genera gram-negativer Bakterien, direkt liefern bakteriell kodierte Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen genutzt Protein-Export-Maschinen. Während die Sekretion Maschine selbst ist hoch konserviert, haben spezialisierte Gruppen von Effektorproteinen zwischen den verschiedenen Bakterienarten entwickelt, um Signale der Zelle verändern und erleichtern bestimmten bakteriellen Virulenz-Strategien ein. Im Falle von Yersinia, bis zu sieben Effektorproteine ​​sogenannte Yops (Yersinia äußeren Proteine), werden bei Wirtszelle Kontakt transloziert und wirken zusammen, um die Immunzellantworten, wie Phagozytose und die Cytokin-Produktion, dh wandern, um extrazelluläre Überleben der Bakterien erlauben 2-4. Der Prozess der Translokation ist eng in den verschiedenen Phasen 5 gesteuert. Es ist erwiesen, dass die primäre Aktivierung des T3SS durch seinen Kontakt mit dem Ziel ce ausgelöstll 6. Jedoch ist der genaue Mechanismus dieser Einleitung noch aufgeklärt werden. Yersinia in eine zweite Ebene von sogenannten Feinabstimmung der Translokation durch Aufwärts- oder Abwärtsregulierende Aktivität der zellulären Rho GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder RhoA erreicht. Aktivierung von Rac1 zB durch Invasindomäne oder zytotoxische nekrotisierende Faktor Y (CNF-Y) führt zu einer erhöhten Translokation 7-9, während die GAP (GTPase-aktivierendes Protein) Funktion transloziert YopE herunterreguliert Rac1-Aktivität und dementsprechend verringert sich die Translokation durch eine negative Rückkopplung der Mechanismus 10,11. Gültig und präzise Methoden sind die Voraussetzung, um zu untersuchen, wie die Translokation bei Yersinia Wirtszellinteraktion wird geregelt. Viele verschiedene Systeme wurden für diesen Zweck mit spezifischen Vor- und Nachteile gelegt, wobei jeder. Einige Ansätze beruhen auf der Lyse von infizierten Zellen, nicht aber Bakterien durch verschiedene Reinigungsmittel, gefolgt von Western-Blot-Analyse. The gemeinsamer Nachteil dieser Verfahren ist, dass geringfügige, aber unvermeidliche Bakterienlyse potentiell verunreinigt das Zelllysat mit Bakterien-assoziierten Effektor-Proteine. Die Behandlung der Zellen mit Proteinase K, um extrazelluläre Effektorproteine ​​und die anschließende Verwendung von Digitonin zur selektiven Lyse der eukaryotischen Zellen abgebaut wurden vorgeschlagen, um dieses Problem zu 12 zu minimieren. Wichtig ist, dass diese Assays entscheidend davon abhängen, hochwertige Anti-Effektor-Antikörper, die größtenteils im Handel erhältlich sind es nicht. Versuche, translationale Fusionen Effektorproteine ​​und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP verwenden, um die Translokation zu überwachen, waren nicht erfolgreich wahrscheinlich aufgrund der globularen Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine ​​und der Unfähigkeit des Sekretionsapparates, sie vor Sekretion 13 entfalten. Doch verschiedene Reporter-Tags wie die cya (Calmodulin-abhängige Adenylatcyclase) Domäne des Bordetella pertussis Toxin cyclolysin 14 oder dem Flash-Tag wurden erfolgreich eingesetzt, um die Translokation zu analysieren. Im ersteren Assay die enzymatische Aktivität der cya wird verwendet, um das Signal des intrazellulären Fusionsprotein zu verstärken, während der Flash Tag, ein sehr kurzer Tetracysteinmotiv (4cys) Motiv-Tag ermöglicht die Kennzeichnung mit dem biarsenische Farbstoff Flash ohne den Prozess der Sekretion stören 15. Das hier angewandte Konzept wurde erstmals von Charpentier et al. Berichtet, und ist an der intrazellulären Umwandlung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Farbstoff CCF4 durch transloziert Effektor TEM-1-beta-Lactamase-Fusionen 16 (1A) auf der Basis. CCF4 / AM ist ein zelldurchdringenden Verbindung, in der ein Cumarin-Derivat (Donor) und eine Fluoresceingruppe (Akzeptor) werden durch ein Cephalosporin-Kerns verbunden ist. Beim passiven Eintritt in die eukaryotische Zelle, die nicht-fluoreszierende verestert CCF4 / AM-Verbindung durch zelluläre Esterasen zu der geladenen und fluoreszierende CCF4 verarbeitet und dadurch gefangeninnerhalb der Zelle. Anregung der Kumarin-Gruppe bei 405 nm ergibt FRET an die Fluoresceingruppe, die ein grünes Fluoreszenzsignal bei 530 nm emittiert. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern durch die Beta-Lactamase FRET gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission at460 nm. Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, beispielsweise wurde die Technik in einem Mausinfektionsmodell verwendet, um die Leukozyten-Populationen für die Translokation in vivo 17-19 gezielte identifizieren. Auslesen der Signale kann mit Plattenlesegeräte, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Zu beachten ist, sieht das Verfahren auch die Möglichkeit, Translokation in Echtzeit Live-Zell-Mikroskopie während des Infektionsprozesses 20,21 überwachen. Hier wurde Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie für readou angewendett von Fluoreszenzsignalen da sie die höchste Empfindlichkeit und Genauigkeit. Insbesondere die Möglichkeit der Emissionsfenster mit Nanometer-Präzision in Kombination mit hochempfindlichen Detektoren erleichtert optimierte Fluoreszenzdetektion und minimiert ein Übersprechen zu justieren. Zusätzlich kann diese Einrichtung für die Mikroskopie eine Echtzeitüberwachung der Translokation angepasst werden und potenziell ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktion auf zellulärer Ebene. In dieser Studie Translokationsgeschwindigkeiten eines Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm und eine YopE Deletionsmutante die eine hypertranslocator Phänotyp 10,11 wurden exemplarisch analysiert.

<table><tbody><tr><td>LB-Agar</td><td>Roth</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte (schwarz, klarer Boden)</td><td>Greiner Bio One 655087</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement, Pyruvat</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit mit CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Lektin aus Triticum vulgaris (Weizen) FITC-Konjugat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>Zur Bestimmung von Peak-Emission und Übersprechen</td></tr><tr><td>V450 Ratten-Anti-Maus CD8a</td><td>BD Bioscience</td><td>560469</td><td>Zur Bestimmung von Peak-Emissionen und Übersprechen</td></tr><tr><td>Immersol W Immersionsöl&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td>Brechungsindex = 1.3339 @ 23 &deg; C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>2x GaAsP-Hybrid-Detektoren, 4-Kanal-Spektrometer, acusto optischer Strahlteiler, motorisierter XY-Tisch, verstellbare Lochblende, Objektiv 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405&#160; nm Diodenlaser 50&#160; mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6 Software</td>, <td>Bitplane</td><td></td>, <td>enthaltene Plugins, ImarisXT und MeasurementPro</td></tr>, <tr><td>MatLab-Compiler, Runtime</td>, <td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td>, <td>GraphPad-Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von<em&gt; yersinia enterocolitica</em&gt; effektor translokation in wirtszellen unter verwendung beta-lactamase-effektor-fusionen

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Viele gramnegative Bakterien einschließlich pathogenen Yersinia spp. Beschäftigen Typ III-Sekretion Systeme Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen zu translozieren. Im Inneren der Wirtszelle die Effektor-Proteine ​​zu manipulieren zellulären Funktionen zum Vorteil der Bakterien. Um die Kontrolle des Typ III-Sekretion während der Host-Zell-Interaktion, empfindliche und genaue Tests besser zu verstehen, um die Translokation zu messen sind erforderlich. Wir beschreiben hier die Anwendung eines Assays auf der Basis der Fusion einer Yersinia enterocolitica Effektorprotein Fragment (Yersinia Außen Protein; YopE). TEM-1-Beta-Lactamase für eine quantitative Analyse der Translokation Der Assay beruht auf der Spaltung einer Zelle permeant FRET-Farbstoff (CCF4 / AM) durch transloziert Beta-Lactamase-Fusion. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern CCF4 durch die Beta-Lactamase, FRET von Cumarin zu Fluorescein ist gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission.Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, zB in einem Maus-Modell. Detektion der Fluoreszenzsignale kann unter Verwendung von Plattenleser, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie werden. In der hier von verschiedenen Yersinia Mutanten beschrieben, in vitro Translokation von Effektor-Fusionen in HeLa-Zellen-Setup wird durch Laser Scanning Mikroskopie überwacht. Aufzeichnung intrazellulären Umwandlung des FRET-Reporter durch die Beta-Lactamase-Effektor-Fusion in Echtzeit bietet robuste quantitative Ergebnisse. Wir zeigen hier beispielhafte Daten, was zeigt, erhöhte Translokation von einem Y. enterocolitica YopE Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

Um die Leistungsfähigkeit des beschriebenen Verfahrens zeigen, um quantitativ zu analysieren Effektor Translokation in Zielzellen wurden zwei Yersinia-Stämmen mit unterschiedlichen Translokation Kinetik untersucht: Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm WA-314 (Serogruppe O8, beherbergen die Virulenzplasmid pYVO8 22) und seine Ableitung WA-314ΔYopE (WA-314 beherbergt pYVO8ΔYopE 23). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Y. enterocolitica Mutanten ohne funktionelle YopE eine signi...

Die Effektortranslokation in Wirtszellen über ein Typ-III-Sekretionssystem ist eine gängige Virulenzstrategie bei gramnegativen Bakterien. Es wurde ein auf Beta-Lactamase-Effektorfusion basierender Assay zur quantitativen Analyse der Translokation angewendet. In Yersinien-infizierten Zellen wird die Umwandlung eines FRET-Reporters durch die Beta-Lactamase mittels Laser-Scanning-Mikroskopie überwacht.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Translokation von Effektorproteinen in Wirtszellen über das Typ-III-Sekretionssystem von Yersinia zu messen. Dies wird erreicht, indem HeLa-Zellen mit Yersinia-Mutanten inkubiert werden, die Effektor-TEM-1-β-Lactamase-Fusionen exprimieren, um die Translokation der Effektorfusionen in die HEp-2-Zellen zu ermöglichen. Im zweiten Schritt werden die infizierten HEp-2-Zellen mit einer zellpermeablen FRET-Reporterverbindung beladen, die durch zelluläre Esterasen zu dem geladenen und fluoreszenten CCF2 verarbeitet und dadurch in der Zelle festgehalten wird.Der anschließende Schnitt von CCF vier durch die trans lokalisierte Beta-Lactamase führt zur Störung von fre, was mittels Laser-Scanning-Mikroskopie erfasst wird, um die Fluoreszenzintensitäten von Donor und Akzeptor zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen unterschiedliche Mengen an trans lokalisiertem Effektor TEM one Beta-Lactamase-Fusion, basierend auf verschiedenen Kinetiken des Anstiegs der Donorfluoreszenz. Einer der Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die interzelluläre Verarbeitung der CCF-vier-Verbindung ein äußerst spezifisches und empfindliches Werkzeug zur Messung der Translokation bereitstellt.Die Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, beispielsweise wie die Translokation während der Interaktion von Bakterien und Wirtszellen feinabgestimmt wird. Einen Tag vor der Infektion drei getrennte Gefäße mit jeweils drei Millilitern LB-Medium und den erforderlichen Antibiotika mit einer Kolonie jedes der transformierten Stämme von Y. enterocolitica, die wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben hergestellt wurden, ansäen. Außerdem Platten mit HeLa-Zellen am Tag vor der Infektion vorbereiten, indem 15.000 Zellen in 200 Mikrolitern Kulturmedium in neun Vertiefungen einer 96-Loch-Platte ausgesät werden. Die Zellen am Tag der Infektion in einem 5 % CO₂-Inkubator bei 37 °C inkubieren.Inokulieren Sie zwei Milliliter der Übernachtkultur in 40 Milliliter frisches LB-Medium ohne Antibiotika. Inkubieren Sie die Bakterien 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler bei 180 U/min. Dadurch wird nach 90 Minuten die Expression des Typ-III-Sekretionssystems induziert; überführen Sie anschließend die Kulturen in ein frisches Gefäß und stellen Sie sie auf Eis.Ab diesem Zeitpunkt die Kulturen 10 Minuten bei 5.000 ×g und vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Bakterien zu pelletieren. Danach das Pellet in zwei bis drei Milliliter kalter PBS erneut suspendieren, die Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 800 Millionen koloniebildenden Einheiten pro Milliliter verdünnen und anschließend die Kulturen auf Eis stellen.Bestimmen Sie anschließend die entsprechende optische Dichte jeder Kultur. Geben Sie 3,5 µL der bakteriellen Suspension von jedem Stamm in verschiedene Vertiefungen der vorbereiteten 96-Well-Platte und mischen Sie durch vorsichtiges zweimaliges Pipettieren des Mediums. Lassen Sie die Bakterien bei einer Multiplikation der Infektion von etwa 100 Bakterien pro Zelle auf die Zellen sedimentieren.Führen Sie eine Zeitreihe durch, indem Sie die Infektionen im Abstand von 30 Minuten beginnen und die Zellen in einer 5 %igen CO2-Kammer bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach jeder Infektion, jeweils 90 Minuten nach der ersten Infektion, saugen Sie das Medium vorsichtig ab, ohne HeLa-Zellen zu entfernen. Geben Sie dann 50 Mikroliter PBS mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 2,5 Millimolar Pronic zu.Dies stoppt die Expression von Effektoren und verringert die Sekretion von CCF4. Zum Vorbereiten der Mikroskopie stellen Sie eine kontinuierliche Immersion sicher, indem Sie Immersionsmedium mit einer Ein-Milliliter-Spritze auf den Boden der Vertiefungen auftragen. Vermeiden Sie es, Luftblasen im Immersionsmedium einzuschließen.Überführen Sie dann die 96-Well-Platte auf den Mikroskopständer und suchen Sie geeignete Stellen für die spätere Analyse in jedem Well. Beenden Sie diesen Schritt innerhalb von 10 Minuten. Fügen Sie anschließend 70 Mikroliter der CF 4:00 AM-Ladelösung in jeden hinzu.Die Platte fünf Minuten bei Raumtemperatur gut inkubieren. Anschließend die Belösung abpipettieren und 100 Mikroliter PBS mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol sowie 2,5 Millimolar Pronic hinzufügen. Danach umgehend mit der Mikroskopie beginnen.Bringen Sie ein Immersionsobjektiv mit 20-facher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur an und öffnen Sie die Detektorblende auf 2,5 Airy-Einheiten. Überführen Sie die 96-Well-Platte in die Stufe des konfokalen Laserscanning-Mikroskops. Wählen Sie anschließend hochsensible Galliumarsenid-Phosphid-Detektoren mit gleichzeitig aktiven Donor- und Akzeptorkanälen. Verwenden Sie eine dreifache Bildmittelung mit einer Bittiefe von 8 und regen Sie mit 10 % eines 405 Nanometer-Diodenlasers an.Um eine korrekte Quantifizierung sicherzustellen, stellen Sie den Detektorverstärkungsfaktor beider Kanäle auf denselben Wert ein und vermeiden Sie gesättigte Pixel. Aktivieren Sie anschließend das durchgehende Licht und überprüfen Sie erneut die repräsentativen Sichtfelder in jedem Objektträger; passen Sie die Positionen bei Bedarf an und speichern Sie sie mithilfe eines kalibrierten automatischen Stages neu. Stellen Sie abschließend die Zeitraffer-Aufnahme auf zwei Minuten ein, die Dauer auf zwei Stunden und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.Nach der Bildaufnahme importieren Sie den Datensatz in eine Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrizen ermöglicht. Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mithilfe desselben Offsetwerts, indem Sie zunächst auf das Menü klicken, dann zur Bildverarbeitung wechseln und die Basissubtraktion auswählen. Wählen Sie anschließend jeden Kanal aus und geben Sie den Basiswert ein.Korrigieren Sie die Übersprechen des Donorkanals, Kanal eins, in den Akzeptorkanal, Kanal zwei, mithilfe des vorab bestimmten Korrekturfaktors, um einen neuen Kanal, Kanal zwei Strich, zu erstellen. Klicken Sie auf das Menü und wählen Sie anschließend Bildverarbeitung, gefolgt von Kanalarithmetik, und geben Sie den absoluten Wert von Kanal zwei abzüglich 0,33 mal Kanal eins ein. Löschen Sie danach Kanal zwei und stellen Sie sicher, dass der übersprechenkorrigierte Akzeptorkanal als neuer Kanal zwei erhalten bleibt.Erstellen Sie anschließend einen neuen Kanal mit der hier gezeigten Operation, um den relativen FRET-Koeffizienten zu bestimmen. Gehen Sie danach erneut in das Menü für Kanalarithmetik und geben Sie Kanal zwei geteilt durch Kanal eins plus Kanal zwei ein, um den FRET-Kanal korrekt darzustellen. Erstellen Sie in einem 8-Bit-Bild einen vierten Kanal, Kanal vier, der gleich 255 mal Kanal drei ist.Ändern Sie die Kanalfarbe, indem Sie zum Menü „Bildeigenschaften“ gehen, Kanal vier auswählen, dann „Zugeordnete Farbe“ und anschließend „Farbtabellendatei“, und wählen Sie „jet“. Wenden Sie danach einen 3-mal-3-Medianfilter auf die Kanäle drei und vier an. Dies reduziert das Rauschen in den Bildern, indem Sie das Menü „Bildverarbeitung“ aufrufen und „Glätten“ auswählen.Nach dem Medianfilter beide Kanäle auswählen und einen Filter der Größe drei mal drei mal eins zur Quantifizierung zellulärer Signale anwenden. Die Zellen im Kanal vier erkennen, indem die Surpass-Ansicht ausgewählt und auf das Symbol geklickt wird. Neue Oberflächen hinzufügen.Legen Sie die Parameter des Erkennungsalgorithmus im Oberflächenfenster fest und aktivieren Sie die beiden Kontrollkästchen. Segmentieren Sie nur einen interessierenden Bereich und verarbeiten Sie das gesamte Bild. Definieren Sie abschließend den interessierenden Bereich, indem Sie dessen Abmessungen bearbeiten.Wählen Sie Kanal vier als Quellkanal aus und setzen Sie die Schwelle, indem Sie zum Schwellwertmenü gehen und die Hintergrundsubtraktion aktivieren. Stellen Sie den Durchmesser auf 10 Mikrometer, die minimale Intensitätsschwelle manuell auf null und die maximale Schwelle auf maximale Intensität ein. Filtern Sie die Strukturen nach Fläche und setzen Sie den Mindestwert auf 187 Quadratmikrometer.Danach die Oberflächenerkennung abschließen. Schließlich die Mittelwerte der Donor-Fluoreszenzintensität im Kanal eins und des relativen FRET-Koeffizienten im Kanal drei sowie deren Standardabweichungen in der zellulären Einheit extrahieren. Um die Fähigkeit dieser Methode zur quantitativen Analyse der Effektor-Translokation in Zielzellen zu demonstrieren, wurden zwei Yersinia-Stämme mit unterschiedlichen Translokationskinetiken unter Verwendung sowohl der Donor-Fluoreszenz als auch der relativen FRET-Koeffizienten untersucht.Die mit dem Wildtyp infizierten Zellen zeigen im Laufe der Zeit eine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Wie erwartet besteht eine positive Korrelation zwischen der maximalen Steigung der Fluoreszenzintensität und der Dauer der Infektion, was darauf hinweist, dass unterschiedliche Konzentrationen der translatierten Beta-Lactamase entsprechend früheren Studien unterschieden werden können. Zellen, die mit dem Yersinia-YOPE-Löschungsmutanten infiziert wurden, weisen im Vergleich zum Wildtyp-Stamm eine schnellere Zunahme der Fluoreszenzintensität auf.Interessanterweise führte eine Verlängerung der Infektion auf 90 Minuten im Vergleich zu 60 Minuten Infektion nicht zu einer weiteren Beschleunigung des Anstiegs der Donor-Fluoreszenz. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Verarbeitung der CCR-four-Verbindung unmittelbar nach ihrer Zugabe beginnt. Daher ist es wichtig, die Bildaufnahme rechtzeitig zu starten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Dieser Artikel veranschaulicht die Verwendung von Pulse-Chase-Radiomarkierung in Kombination mit ortsspezifischer Photovernetzung, um Wechselwirkungen zwischen einem Protein von Interesse und anderen Faktoren in E. coli zu überwachen. Im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Vernetzungsmethoden erzeugt dieser Ansatz hochauflösende "Schnappschüsse" eines geordneten Assemblierungswegs in einer lebenden Zelle.

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Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Bakterielle Effektor-Proteine ​​sind wichtig für den Aufbau erfolgreicher Infektionen. Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle Identifizierung von proteinösen Bindungspartner eines bakteriellen Effektor-Protein in seiner natürlichen pflanzlichen Wirt. Die Identifizierung dieser Effektor - Wechselwirkungen über Hefe - Zwei-Hybrid - Screens ist ein wichtiges Instrument in entwirren molekularen Pathogenität Strategien werden.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Fluoreszierende Protein-basierte Ansätze, Effektoren abgesondert von Bakterien in Wirtszellen zu überwachen sind anspruchsvoll. Dies ist aufgrund der Inkompatibilität zwischen fluoreszierende Proteine und die Typ-III-Sekretion-System. Hier wird eine optimierte Split Superfolder GLP-System zur Visualisierung von Effektoren abgesondert von Bakterien in die Wirtszelle Pflanze verwendet.

Split-grün fluoreszierendes Protein System Effektoren geliefert von Bakterien während der Infektion zu visualisieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie...

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

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