Bildgebung morphologischer Veränderungen bei Bakterien mittels lebender Zellfluoreszenzmikroskopie

Beginnen Sie mit einer Bakterienkultur, die unter einer Agaroseplatte in einer Glasbodenschale immobilisiert ist.

Die bakteriellen Zellmembranen sind mit einem fluoreszierenden Farbstoff beschriftet.

Die Bakterien sind außerdem so konstruiert, dass sie eine Antisense-RNA exprimieren, die eine bestimmte mRNA angreift und die Produktion eines essentiellen Zellteilungsproteins hemmt.

Fügen Sie dem Objektiv des invertierten Fluoreszenzmikroskops einen Tropfen Immersionsöl hinzu.

Setze die Schale in ein Metallgehäuse und befestige sie auf der Mikroskopbühne.

Heben Sie das Objektiv an, bis das Öl die Schüssel berührt, und konzentrieren Sie sich dann auf die Zellen.

Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Z-Stacks für die Aufnahme von Bildern in mehreren Tiefen einzustellen.

Beginnen Sie mit der Aufnahme von Fluoreszenz-Zeitrafferbildern.

Da die Zellen auf die Antisense-RNA-Expression reagieren, können sie sich nicht teilen und entwickeln geschwollene Formen.

Die Membranorganisation wird gestört, was zu ungleichmäßiger und fokaler Fluoreszenz führt, die auf eine defekte Zellteilung hinweist.

Um die Probe abzubilden, verwenden Sie den groben Einstellknopf, um sicherzustellen, dass das Objektiv vollständig abgesenkt ist, bevor Sie das Mikroskop in der Mikroskopsoftware initialisieren. Geben Sie einen Tropfen Öl mit 1,517 Brechungsindex in das 100-fache Öl-Eintauchobjektiv und übertragen Sie die Glasbodenschale mit der Probe in den Metallgehäusesarg.

Schiebe die Schale vorsichtig in die Bühnenklemme und benutze den groben Einstellknopf, um das Objektiv anzuheben, bis das Öl den Glasboden der Schale berührt. Benutze das Okular und den Feineinstellungsknopf, um das Sample scharf zu stellen, und schalte in den Kameramodus. Wählen Sie in der Bildbearbeitungssoftware im Resolve 3D-Fenster das Design/Run Experiment-Symbol aus.

Ein neues Dialogfeld mit dem Titel Design/Run Experiment erscheint. Öffnen Sie im Dialogfeld die Tabs Design und Sektionierung, um die Anzahl der Z-Stapel und die Probendicke festzulegen. Um die Dicke der Zellen in der Probe zu messen, passen Sie die Z-Ebene schrittweise mit den Auf- und Abwärtspfeilen im 3D-Dialogfeld "Auflösen" an, sodass die Stellen, an denen die Zellen unscharf werden, als obere und untere Grenzen für die Bildaufnahme werden.

Nachdem Sie die prozentuale Transmission der Lichtintensität und die Dauer der Belichtung für die einzelnen ausgewählten Kanäle im 3D-Dialogfeld "Auflösen" angepasst haben, klicken Sie auf Punktliste, um die Punktliste zu öffnen. In den Reitern Design und Zeitraffer wählen Sie das Kästchen Zeitraffer aus und geben Sie die Zeitrafferparameter ein. Wählen Sie die Option 'Visit Point List' und geben Sie die abzubildenden Punkte in das Textfeld ein, wobei Sie die Punkte durch Kommas oder Bindestriche für vollständige Sequenzen trennen.

Bearbeiten Sie dann Dateinamen und Dateistandorte im Reiter Ausführen und wählen Sie im Dialogfeld "Experiment beginnen" "Spielen" aus, um das Experiment zu starten.