Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Dieses Experiment beschreibt, wie man Kristalle in Beugungsqualität eines Proteins erhält, das an DNA gebunden ist, die ein methyliertes Tandemhem enthält. GATC. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die Kristallpackung des Protein-DNA-Komplexes zu begünstigen. Beginnen Sie mit dem rationalen Design der DNA-Länge, des GATC-Abstands und der DNA-Enden, fahren Sie mit den komplementären einzelsträngigen Oligonukleotiden fort, um die DNA zu reinigen, und dann mit Anel, um den hemimethylierten DNA-Duplex zu bilden, und mischen Sie dann den gereinigten Seq A ein, um den Komplex zu bilden.

Als nächstes finden Sie optimale Bedingungen für die Züchtung von Kristallen in Beugungsqualität des Protein-DNA-Komplexes mit Kristallisationsversuchen unter Verwendung kommerzieller Siebe mit geringer Matrix. Nachgewiesene Ergebnisse. Teilen Sie die Auswirkungen unterschiedlicher DNA-Längen, GATC-Abstände und -Enden auf die Beugungsqualität der CQ A-DNA-Kristalle.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, Kristalle von CK in Beugungsqualität zu erhalten, die an DNA gebunden sind, aber sie kann auch helfen, die allgemeinen Variablen zu verstehen, die bei der Entwicklung von DNA-Duplexen für die Kristallisation anderer Protein-DNA-Komplexe berücksichtigt werden müssen. In dieser Studie wird eine Variante der DNA-replikationsregulatorischen Proteine verwendet. Suchen Sie nach einem, der stabile Dimere bildet und eine verkürzte Linkerregion zwischen seiner Isierungs- und DNA-Bindungsdomäne aufweist.

Diese Variante beschränkt die DNA-Bindung auf Tandem-GATC-Wiederholungen, die ausschließlich durch eine Umdrehung auf der DNA getrennt sind, transformieren zunächst BBL 20 1D drei Zellen mit dem Plasmid, das für DEMETRIC seq A kodiert, unter der Kontrolle der T-Sieben-Promotorplatte. Die Umwandlungsreaktion erfolgt auf LB-Agarplatten mit 100 Mikrogramm pro Milliliter, Ampicillin und über Nacht in den Bakterieninkubator. Pflücken Sie gemischte Völker und beginnen Sie mit einer kleinen Anbaukultur über Nacht.

Am nächsten Morgen impfen Sie einen Liter Kultur mit 10 Millilitern des Nachtinokulums. Wenn sich die Kultur in der logarithmischen Phase befindet, fügen Sie zwei Milliliter 0,5 molare IPTG hinzu, um die Proteinproduktion zu induzieren. Setzen Sie die Inkubation für drei Stunden in einem 37 Grad Celsius heißen Orbitalschüttler fort.

Ernten Sie dann die Zellen durch Zentrifugation bei 3.300 g für 10 Minuten. Reese, suspendieren Sie die Zellpalette bei der Reinigung, puffern Sie sie durch Ultraschall und klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 39.000 G für 40 Minuten. Laden Sie nun den S-Überstand auf eine mit Reinigungspuffer äquilibrierte Heparinsäule.

Um das CK-Protein zu eluieren. Verwenden Sie einen linearen Gradienten zu einem molaren Natriumchlorid-CK-Protein, das bei etwa 0,7 molaren Natriumchlorid eluiert. Ziehen Sie die CK-haltigen Fraktionen und verdünnen Sie sie, um die Ionenstärke der Probe zu verringern.

Laden Sie dann die Probe in eine Kationenaustauschchromatographie-Säule E, die mit dem Reinigungspuffer gleichgesetzt ist. Wenden Sie einen linearen Salzgradienten an, um das reine CK-Protein bei etwa 0,4 molaren Natriumchlorid zu schleifen. Kombinieren Sie die CK-haltigen Fraktionen.

Auf drei Milligramm pro Milliliter konzentrieren und lagern. Pufferdesign: komplementäre unmethylierte und methylierte Oligonukleotide. Bereiten Sie Proben von einem Mikromol jeder lyophilisierten Einzelstrang-DNA in 800 Mikrolitern Autoklav, doppelt destilliertem Wasserwirbel vor und stellen Sie sie jetzt für 15 Minuten und 800 Mikroliter beiseite.

Nachdem Sie jede Probe zweimal mit einem Ladepuffer für 20 bis 30 lange Nukleotide vorgeheizt haben, bereiten Sie ein großes 10%iges Denaturierungsgel vor. Sobald sie polymerisiert ist, entfernen Sie den Kamm und spülen Sie die Vertiefung gründlich aus. Das Gel zusammensetzen und den oberen und unteren Behälter mit einmaligem FSME-Laufpuffer füllen.

Lassen Sie das Gel bei 750 Volt vorlaufen, um das Gel auf 55 Grad Celsius aufzuwärmen. Stoppen Sie dann den Lauf und spülen Sie die Vertiefungen gründlich mit Laufpuffer aus. Erhitzen Sie nun die Oligonukleotide zwei Minuten lang auf 90 Grad Celsius.

Vortex und Spin. Die Proben werden sofort mit der Beladung des Gels fortgesetzt. Lassen Sie das Gel bei etwa 700 Volt laufen, bis das Oligonukleotid migriert ist.

Auf halbem Weg: Auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel wandert alph Phenolblau mit Oligonukleotiden von etwa 20 Basen Länge und Xylol Syl ff mit etwa 60 Basen Länge. Demontieren Sie das Gel vom Gerät und entfernen Sie die Abstandshalter auf einer ebenen Fläche. Entfernen Sie eine Glasplatte und decken Sie das Gel mit Frischhaltefolie ab.

Drehen Sie dann das Gel um, entfernen Sie die andere Glasplatte und decken Sie das Gel mit Plastikfolie ab. Markieren Sie anschließend die Banden mit UV-Licht und einer fluoreszierenden Platte hinter dem Gel. Um den DNA-Schatten mit einer Rasierklinge zu sehen, schneide das Band heraus und schneide es in kleine Stücke.

Jede Probe wird in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Neun Milliliter Elucian-Puffer zugeben und über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Rühren verdünnen. Übertragen Sie die Lösung vorsichtig mit einer Gelladepipettenspitze in ein Zentrifugenröhrchen im Autoklaven.

Um das Übertragen von Acrylamidstücken zu vermeiden, fügen Sie einen Milliliter drei Milliliter Natriumacetat mit einem pH-Wert von sieben plus 25 Milliliter gekühltes 100%iges Ethanol hinzu und inkubieren Sie mindestens drei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die ausgefällte DNA. Trocknen Sie dann die Pellets auf dem Speedvac bei mittlerer Hitze, resuspendieren Sie jedes Pellet in 400 Mikrolitern Autoklaven, doppeltem destilliertem Wasser und geben Sie es in ein frisches Rohr.

Fügen Sie 40 Mikroliter drei molare Natriumacetate bei einem pH-Wert von sieben und einen Milliliter 100%igen Ethanol-Vortex hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius, nachdem Sie 15 Minuten lang 18.000 Mal zentrifugiert haben. G, spülen Sie die DNA-Pellets mit 100 Mikrolitern 70 % kaltem Ethanol aus, um sechs Minuten lang 18.000 Mal alle Salzschleuderreste zu entfernen. G entsorgen Sie dann das Ethanol und trocknen Sie das Pellet auf einem Geschwindigkeitssauger.

Senden Sie nun jedes Pellet erneut in 100 Mikroliter doppelt destilliertes Autoklavenwasser. Bestimmen Sie die Konzentration der Oligonukleotide durch Spektrometrie. Zur Herstellung der Hemi-methylierten DNA-Duplexe werden zunächst gleiche Molo-Konzentrationen der komplementären Einzelstränge gemischt.

Anschließend die Mischungen in einem Wasserbad fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius erhitzen, um die Strähnen zu anilieren. Lassen Sie die Proben im Wasserbad langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Kombinieren Sie gleiche Volumina von 81 mikromolar gereinigtem CQ a-Protein und 81 mikromolar hem methylierter DNA.

Dann 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bei vier Grad Celsius lagern, bis das Sieb für Kristallisationsbedingungen mit handelsüblichen dünnbesetzten Matrixsieben verwendet wird. Sobald die ersten Kristallisationsspuren identifiziert wurden, optimieren Sie die Bedingungen, um Kristalle in Beugungsqualität zu züchten. Um die resultierenden CK-DNA-Kristalle zu schützen und zu schützen.

Erhöhen Sie entweder die Menge an PEG 400 in der Kristallisationslösung auf eine Endkonzentration von 25 % oder fügen Sie der Kristallisationslösung 20 % Glycerin hinzu. Schöpfen Sie einzelne Kristalle mit Nylonschlaufe Flash heraus. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein.

Testen Sie nun die Beugungsgrenze jedes Kristalls bei 100 k. Um die Kristallstruktur der verkürzten Mutante von CK zu erhalten, die an Hemi-methylierte DNA gebunden ist, optimieren wir nacheinander drei Parameter auf der DNA, den Abstand zwischen Hemi-methylierten GATC-Sequenzen, die Länge des Duplex und das Fehlen oder Vorhandensein von fünf Prime-Überhängen. In dieser Studie wurde eine DME-Variante von seek a mit einer Punktmutation in der endterminalen Domäne, die eine weitere Ligamentisierung verhindert, und ein verkürzter Linker, der die DNA-Bindung an das Tandem einschränkt, verwendet.

GATC-Wiederholungen, die auf den DNA-Elektromobilitäts-Shift-Assays ausschließlich durch eine Umdrehung getrennt sind, deuten darauf hin, dass das modifizierte CK-Protein bevorzugt GATC-Wiederholungen bindet, die durch neun bis 10 Basenpaare getrennt sind. Daher verwenden die ersten Siebe Duplexe mit einer Länge von 23 bis 24 Basenpaaren, die zwei methylierte Schichten enthalten. GATC-Wiederholungen, die entweder durch neun oder 10 Basenpaare getrennt sind.

Drei Doppelhäuser ergaben schön geformte Kristalle. Während keiner der Kristalle auf eine hohe Auflösung zerfraktierte. Die Daten deuteten jedoch darauf hin, dass die A-G-A-T-C-Trennung von neun Basenpaaren für die Kristallisation bevorzugt wurde, wobei die unerwartete Verstärkung der Rillenrückgratwechselwirkungen durch die Einbeziehung eines CG-Dinukleotids zwischen den beiden GATC-Stellen die Beugungsgrenze der Kristalle nicht veränderte.

Im Gegensatz dazu veränderte die Optimierung der Länge der Überhänge die molekularen Kontakte und die Kristallmorphologie dramatisch. Die Kristallstruktur dieses CK-Proteins, das an einen häm-methylierten DNA-Duplex gebunden ist, bestätigte, dass die freie Fläche des DNA-Duplex trotz der relativen Größe von Protein und DNA keine Kristallkontakte eingeht, die meisten Wechselwirkungen zwischen Symmetriepartnern werden durch Protein-, Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen vermittelt. Interessanterweise ist in diesem speziellen Fall die vorteilhafte Wirkung eines Überhangs mit fünf Primzahlen nicht auf die Bildung einer pseudokontinuierlichen DNA zurückzuführen.

Stattdessen ragen die fünf Primzahlen des methylierten Strangs von den DNA-Achsen weg und interagieren mit dem proximalen CK-Molekül des Komplexes, was erklärt, warum zwei Nukleotide unbedingt erforderlich waren, um die Kristallpackung zu verändern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteine aufreinigt und DNA-Duplexe für die Kristallisation von Protein-DNA-Komplexen entwirft. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass, obwohl dieses Protokoll ein Gerät zur Kristallisation des CK-DNA-Komplexes war, die rationale Optimierung der DNA-Längensequenz und -Enden einen allgemeinen Rahmen für das Design von DNA-Duplexen für die Kristallisation anderer Protein-DNA-Komplexe bietet.