Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen Multi-Target-Ansatz zur strukturierten Bestimmung eines Zielproteins mittels Röntgenkristallographie zu verwenden, beginnend mit nur einem einzigen Gen oder einer genetischen Sequenz im hier vorgestellten Fall. Das Zielprotein ist die PB-2-Polymerase-Untereinheit von Influenza A, eine Schlüsselkomponente der Virusreplikation. Der Multi-Targett-Ansatz wird erreicht, indem zunächst eine Reihe von genetischen Konstrukten parallel auf der Grundlage der Einzelzielsequenz und anderer über das Protein bekannter Informationen entworfen und kloniert wird.

Der zweite Schritt besteht darin, die Expressionsniveaus für jedes Konstrukt zu testen und die besten für die Proteinexpression in großem Maßstab in Zellkulturen auszuwählen. Der nächste Schritt besteht darin, Zellen aufzubrechen, um die Zielproteine aus dem Expressionsmaterial zu entfernen und jedes von ihnen zu sehr hoher Reinheit zu veredeln. Anschließend wird mit jedem Protein eine Reihe von Kristallisationsversuchen durchgeführt, um eine für Röntgenuntersuchungen geeignete Kristallform zu erhalten.

Hochauflösende Röntgenbeugungsdaten werden dann an einem oder mehreren Kristallen gesammelt und verwendet, um eine Elektronendichtekarte zu lösen und zu verfeinern, die die Struktur jedes Zielproteins beschreibt. Diese Ergebnisse ermöglichen es, eine dreidimensionale Struktur des Zielproteins auf der Grundlage der Elektronendichtekarte darzustellen. Die Multi-Target-Verarbeitung erhöht die Erfolgswahrscheinlichkeit bei der strukturierten Bestimmung erheblich, indem sie an jedem potenziellen Hindernis auf dem Weg praktikable Alternativen bietet.

Die parallele Arbeit mit mehreren Targets ist ebenfalls hocheffizient und reduziert den Zeit- und Kostenaufwand pro Protein bei jedem Schritt. Das Potenzial, die Geschwindigkeit zu erhöhen, mit der die strukturierte Bestimmung für medikamentöse Ziele abgeschlossen wird, wird mehr Möglichkeiten zur Therapieentwicklung pro Jahr bieten. Obwohl diese Methode wertvolle Einblicke in die Strukturbiologie liefern kann, kann das hochwertige Protein, das durch diese Methoden gewonnen wird, jede proteinbasierte Untersuchung unterstützen.

Jede Phase des Prozesses hat ihre eigene Wissenschaft und erfordert ihr eigenes Fachwissen, aber die Investition in Personal, Instrumentierung und Know-how kann sich wunderbar auszahlen, sobald alle Teile zusammengebaut sind. Sobald ein Zielgen und ein Genprodukt für die Untersuchung ausgewählt wurden, erfordert der erste Schritt das Design mehrerer genetischer Varianten oder Konstrukte. Gencomposer-Software wird verwendet, um diese Konstrukte auf Proteinebene zusammen mit dem zugehörigen Code auf manipulierten synthetischen Gensequenzen zu entwerfen.

Vergleichen Sie mit dem Alignment-Viewer-Modul und dem Construct-Design-Modul die Ausrichtung von Proteinsequenzen und definieren Sie Proteinkonstrukte, Design-, Insert-PCR- und Vektor-PCR-terminale Primer oder Amper. Verwenden Sie als Nächstes den Protein-zu-DNA-Algorithmus des Genkomponisten, um jede Aminosäuresequenz in einen Code auf der manipulierten Nukleinsäuresequenz zurückzuübersetzen. Verwenden Sie den richtigen Code in der Verwendungstabelle, um die Sequenz für die Expression in einer bestimmten Zellzeile zu optimieren.

In diesem Fall E-Coli-Bakterien. Sobald die Zielgensequenz fertig ist, klonen Sie das Gen virtuell und fügen Sie es in ein geeignetes Vektorplasmid für die bakterielle Expression ein. In diesem Fall handelt es sich um einen modifizierten PET 28-Vektor.

Dieser Vektor enthält bestimmte Komponenten, die für die Expression und Proteinreinigung notwendig sind. Das Zielgen wird so modifiziert, dass es eine Histamin-Tag-Sequenz entweder am N- oder C-Terminus des Proteins und eine Spaltsequenz enthält, um die Entfernung des Tags während der Reinigung zu ermöglichen. Der Vektor besitzt auch ein Antibiotikaresistenzgen für Expressionstests und Fermentationen.

Jede genetische Sequenz des Zielproteins wird dann durch Standard-Gensynthesemethoden in Vorbereitung auf die Rohrklonierung, die Polymerase, die unvollständige primäre Verlängerungsklonierung oder die Rohrklonierung erstellt. Dabei handelt es sich um eine PCR-basierte Klonierungsstrategie, bei der das Zielgen mit Primern amplifiziert wird, die komplementär zum beabsichtigten Vektor sind. Diese Methode nutzt die Unvollständigkeit der PCR im Spätstadium aus, wodurch die PCR-Produkte variable einzelsträngige Termini aufweisen. Ich bereite die Insert-PCR oder IPCR vor, indem ich jeder Reaktion jeweils fünf Mikroliter Vorwärts- und Rückwärtsprimer hinzufüge.

In einer 96-Well-Platte gemäß einer Plattenkarte werden zwei Mikroliter jedes synthetischen Gens in voller Länge in die entsprechende Vertiefung gemäß der Plattenkarte gegeben. Nachdem Sie jeweils 25 Mikroliter PFU-Mastermix hinzugefügt haben, durchlaufen Sie die Reaktionen 25 Mal unter den folgenden PCR-Bedingungen. Denaturieren Sie bei 95 Grad Celsius für 30 Sekunden.

Anil bei 50 Grad Celsius für 45 Sekunden und bei 68 Grad Celsius für drei Minuten ausdehnen. Die Fragmentamplifikation wird durch die AGROS-Gelanalyse von IPCR-Produkten bestätigt. Erfolgreiche IPCR-Produkte werden durch robuste Bänder repräsentiert.

Weniger wünschenswerte Ergebnisse werden oft als schwache oder Schmierbanden in einer separaten Reaktion gesehen. Die Expression des Plasmids wird durch Vektor-PCR amplifiziert oder die VPCR-Fragmentamplifikation wird durch die AROS-Gelanalyse von VPCR-Produkten bestätigt. Sobald die IPCR- und VPCR-Produkte amplifiziert sind, werden sie auf eine Merge-Platte gegeben und für die Merge-Reaktion in einen Thermocycler gegeben.

Die erfolgreich klonierten Konstrukte werden dann in chemisch kompetente E-Coli-Zellen umgewandelt und in Glycerinstielen gelagert, um mit dem Expressionstest zu beginnen. Eine kleine Menge jeder Probe aus einem Glycerinvorrat eines klonierten Konstrukts auf eine separate Agarplatte. Die Platte besteht aus bakterieller Nährstoffbrühe und dem im Vektor kodierten Antibiotika-Marker Kanamycin, der am Folgetag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wird.

Starten Sie eine Vorkultur für jede Probe, indem Sie eine einzelne Kolonie von der frisch gewachsenen Agarplatte auswählen. Verwenden Sie diese Kolonie, um 1,2 Milliliter TB-Brühe zu impfen, die mit Dosenmycin und Glukose für die parallele Verarbeitung ergänzt wird. Jede Vorkultur wird in einem 96 Well runden Bodenblock gezüchtet.

Anbau über Nacht bei 37 Grad Celsius und Schütteln mit 220 Umdrehungen pro Minute. Nach dem Wachstum über Nacht. Beginnen Sie mit kleinen Induktionskulturen für jede Probe, indem Sie 40 Mikroliter der Vorkultur zum Impfen verwenden.

1,2 Milliliter TB-Brühe. Ergänzt mit 50 Milligramm pro Milliliter Dose Mycin und Novagen Overnight Express System. Erstens, züchten Sie die Induktionskulturen 48 Stunden lang bei 20 Grad Celsius und schütteln Sie die Erntezellen bei 220 U/min durch Zentrifugation bei 4.000 GForce-Einheiten für 15 Minuten.

Gießen Sie den Überstand ab und lagern Sie die Pellets mindestens eine Stunde lang bei minus 20 Grad Celsius, bevor Sie nach der Reinigung weiterverarbeitet werden. Analysieren Sie das Protein mit und ohne Spaltreaktion durch Kapillarelektrophorese mit einem Messschieber lab CHIP 90 System gemäß dem Protokoll des Herstellers. Im Fall der Influenza führten zwei Protein-Untereinheiten 14 der 34 Konstrukte zu einem löslichen Zielprotein und gingen in den nächsten Schritt, die großtechnische Fermentation, ein.

Um eine Fermentation im großen Maßstab zu beginnen, inokulieren Sie 100 Milliliter Bakterienzellkulturbrühe mit 50 Milligramm pro Milliliter. Kann Mycin aus einem Glycerin gelagert und über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen? Schütteln Sie am nächsten Tag bei 220 U/min und erweitern Sie die Vorkultur, indem Sie 10 Milliliter zum Impfen verwenden.

Ein Liter Brühe, die Autoinduktionsmedien und 50 Milligramm pro Milliliter enthält, kann Mycin in einem Zwei-Liter-Kolben mit Blende enthalten. Schütteln Sie die expandierten Kulturen bei 37 Grad Celsius etwa alle 30 Minuten. Überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur, indem Sie die UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern messen.

Wenn eine optische Dichte von 0,6 erreicht ist, ändern Sie die Temperatur des Schüttelinkubators auf 20 Grad Celsius nach der gewünschten Wachstumszeit. Entfernen Sie aus jedem Konstrukt ein repräsentatives 10-Milliliter-Ali-Quad für den Expressionstest. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 GForce-Einheiten für 15 Minuten.

Gießen Sie den Überstand ab und frieren Sie das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius ein. Um dieses Verfahren zu starten, tauen Sie die Zellpaste auf und resuspendieren Sie sie in Lysepuffer bei einem Mastervolumenverhältnis von eins zu fünf. 30 Minuten bei vier Grad Celsius kräftig umrühren.

Verwende einen sauberen Spatel, um die Stücke von der Seite des Bechers zu lösen. Lyzieren Sie die Zellen mechanisch auf Eis mit dem Ultraschall eines Freimaurers. Das Rohlysat wird durch Zentrifugation bei 18.000 GForce-Einheiten für 30 Minuten bei vier Grad Celsius geklärt.

Sammeln Sie den Überstand und bewahren Sie ein kleines Aliquot für die Analyse auf, bevor Sie mit der Reinigung in großem Maßstab fortfahren. Bestätigen Sie die Proteinexpression jeder Kultur in großem Maßstab über die SDS-Seitengelanalyse. Das Ergebnis dieser repräsentativen SDS-Seite zeigt eine robuste Proteinexpression, eine Löslichkeit von etwa 50 % und eine Spaltbarkeit von etwa 50 %.

In diesem Fall wurde der Histidin-Tag zusammen mit einem hinzugefügten Proteinlöslichkeits-Tag entfernt, der im ursprünglichen Konstrukt entwickelt wurde. Nickelharz wird verwendet, um das Zielprotein mit dem einzigartigen Histamin-Tag von allen anderen zellulären Materialien, einschließlich nativer bakterieller Proteine, zu trennen. Eine Nickel-Ein-Säule wird durch Waschen mit vier Säulenvolumina UE-Wasser hergestellt, um den Speicherpuffer zu entfernen, gefolgt von einem Säulenvolumen des Puffers B und fünf Säulenvolumina des Puffers.

Die Parallelisierung von A für E-Äquilibrierung erfolgt mit dem Proteinmaker, der in der Lage ist, mehrere Säulen gleichzeitig zu betreiben. Jedes geklärte Lysat, das solubilisiertes Protein mit Histamin-Tag enthält, wird mit einer Geschwindigkeit von zwei Millilitern pro Minute in eine separate Säule geladen, gefolgt von mehreren Säulenvolumenwäschen mit Puffer A, sammelt den Fluss durch den Puffer und speichert ihn für die Analyse. Eluieren Sie das gebundene Protein in einer Reihe von Stufengradienten mit den Puffern A und B bei 95 bis fünf, 60 bis 40 und schließlich 100 % Puffer B. Die Komponenten in Puffer B konkurrieren mit Histamin um das Nickelharz und entfernen somit das Protein in einem bestimmten Verhältnis aus der Säule.

Sammeln Sie jede Elutionsfraktion separat. Hier ist ein repräsentatives Chromatogramm zu sehen, das aus einem Lauf auf einer Nickelsäule resultiert. Analysieren Sie die Nickel-Ein-Entgangen-Fraktionen, das Rohlysat, das geklärte Lysat und das Nickel-Ein-Fließen auf der SDS-Seite und vergleichen Sie sie mit der UV-Absorption bei 280 Nanometern, die während der Säulenreinigung gesammelt wurde.

In diesem Schritt wird ermittelt, ob die Reinigung erfolgreich war. Auswahl und Poolierung von Fraktionen, die das Zielprotein enthalten, um sie für die weitere Verarbeitung zu übertragen. Berechnen Sie die Gesamtmenge des Proteins in diesem Stadium mit dem theoretischen Extinktionskoeffizienten des Proteins, messen Sie die UV-Absorption bei 280 Nanometern und berücksichtigen Sie das Gesamtvolumen der gepoolten Fraktionen.

Bewahren Sie eine kleine Probe für die Analyse auf. Das Gen für das Zielprotein wurde mit einer spezifischen Sequenz kodiert, die von ULP one als Spaltstelle erkannt wird, so dass die Zugabe von ULP one zu einer Spaltung zwischen dem Histidin-Tag und dem Protein von Interesse führt. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie einen Mikroliter Ubiquitin-ähnliche Protease hinzu, einen pro fünf Milligramm Protein, das in den gepoolten Fraktionen vorhanden ist.

Zu diesem Zeitpunkt wird das gespaltene Protein von Puffer B zu Puffer A für die weitere Verarbeitung mit Hilfe von Dialyseschläuchen überführt, das Protein gegen zwei Liter Puffer A vier Stunden lang bei vier Grad Celsius unter Rühren dialysiert. Verwenden Sie einen Molekulargewichtsgrenzwert von 10 Kilodalton für PB zwei nach der Dialyse. Führen Sie ein weiteres SDS-Seitengel des Zielproteins mit und ohne vorhandenes ULP aus.

Dadurch wird festgestellt, ob die Spaltung von ULP eins erfolgreich war, und es können die besten Fraktionen ausgewählt werden, die für die weitere Verarbeitung übernommen werden können. Hier sehen Sie unsere repräsentative SDS-Seite Ergebnisse für drei Konstrukte der Polymerase pb. Zwei Molekulargewichtsmarker der Untereinheiten befinden sich auf Spur eins.

Die Bahnen zwei, sechs und 10 sind gepoolte Proteine aus Nickel-Eins-Säulen. Die Spuren drei, sieben und 11 enthalten den Durchfluss des gespaltenen Proteins in Puffer A von Nickel zwei und die Spuren vier, acht und 12. Zeigen Sie die Entfernung des Histamin-Tags in Puffer B von Nickel zwei.

Nach Entfernung des Histamins werden die gepoolten Fraktionen aus Nickel zwei konzentriert. Um mit SEC zu beginnen, muss das richtige Harz erneut auf der Grundlage des Molekulargewichts des Ziels ausgewählt werden. In diesem Fall wird eine Acere S 110 über 30 GL-Säule verwendet und mit 200 Millilitern SEC-Puffer bei einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute unter Verwendung einer Fünf-Milliliter-Spritze äquilibriert, die Probe in eine 10-Milliliter-Probenschleife geladen und der SEC-Säulenlauf gestartet. Überwachen Sie das UV-absorbierende Chromatogramm bei 280 Nanometern und sammeln Sie gleichzeitig kleine Volumenfraktionen.

Führen Sie alle relevanten SEC-Fraktionen über die SDS-Seite aus. Der Standardansatz für Proteinkristallisationsversuche wird nach der Sitztropfenmethode mit Dampfdiffusion durchgeführt. Es ist nicht ungewöhnlich, gleich zu Beginn für jedes Zielprotein zwei oder mehr dünnbesetzte Matrix-Screenings einzurichten.

Um diesen Prozess zu starten, füllen Sie jedes Reservoir einer kompakten Junior-Kristallisationsplatte mit 96 Vertiefungen mit 80 Mikrolitern pro Bedingung im ausgewählten Kristallisationssieb vor und geben Sie 0,4 Mikroliter Protein in SEC-Puffer in jede der 96 Vertiefungen ab. Fügen Sie dann 0,4 Mikroliter des Kristallisationssiebs hinzu und stellen Sie sicher, dass der Tropfen in jedem vollständig vermischt ist. Decken Sie die gesamte Platte mit kristallklarem Deckenband ab und sorgen Sie für eine vollständige Abdichtung jedes Brunnens. Lagern Sie die Platte bei 16 Grad Celsius an einem ungestörten Ort, der frei von Umwelteinflüssen ist.

Überprüfen Sie die Proteinkristallisation in den nächsten Wochen regelmäßig unter einem Präpariermikroskop. Wenn keine Proteinkristalle erscheinen, setzen Sie neue Platten mit anderen Bedingungen ein und variieren Sie die Proteinkonzentration im letzten Tropfen, um die Erfolgswahrscheinlichkeit vor der Ernte zu erhöhen. Kühlen Sie einen Puck im A-LS-Stil in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Macher ab und decken Sie ihn mit einem Deckel ab, um mit der Ernte zu beginnen.

Schneiden Sie das durchsichtige Klebeband, das die Vertiefung mit dem Zielproteinkristall abdeckt, bis zu einem nahe gelegenen leeren Loch ab. Nun, fügen Sie 1,6 Mikroliter des entsprechenden Kristallisationszustands hinzu und kombinieren Sie es mit 0,4 Mikrolitern Ethylenglykol. Eine Lösung aus 20%igem Ethylenglykol im kristallisierenden Zustand schützt den Proteinkristall.

Analysieren Sie während des Kryo-Einfrierens den Kristall unter dem Mikroskop und wählen Sie eine geeignete Kryoschleife für die Ernte aus, indem Sie den Innendurchmesser der Schleife an die maximale Breite des Kristalls anpassen. Befestigen Sie die Kryoschlaufe an einem magnetischen Kristallstab und schleifen Sie den Kristall direkt aus der Well-Lösung. Tauchen Sie die Kryoschleife mit dem geernteten Kristall sofort in ein Kryoprotektivum und tauchen Sie sie dann in den Puck im LS-Stil.

Zum Flashen frieren Sie den Kristall für eine gewünschte Anzahl von Kristallen ein. Sobald die Ernte abgeschlossen ist, lege mit einem Puckstab einen magnetischen Deckel auf den Puck, der schockgefrorene Kristalle mit gebogenen Zungen enthält. Drehen Sie den Puck für den nächsten Schritt auf den Kopf.

Schrauben Sie einen Puckschieber auf den Puck, übertragen Sie den Puck an den KU-Schauspieler und schlagen Sie damit den Deckel ab. Die Kristalle im Puck bleiben in einem Flüssigstickstoffbad eingefroren, bis sie für Röntgenbeugungsstudien mit der Bilderfassungssoftware J Director bereit sind. Stellen Sie die folgenden Parameter für den Kristallscreening-Strahlspalt bei 0,5 Grad, den Detektorabstand von 50 Millimetern, den Bildschritt bei 70 Grad und die Belichtungsdauer von 30 Sekunden ein.

Hier ist ein Beispiel-Screenshot aus der Bilderfassungssoftware, während ein Kristall gescreent wird, zeigt das mittlere Bild die beobachtete Röntgenbeugung von einem repräsentativen Kristall, um ausreichend Bilder mit hoher Auflösung für einen vollständigen Datensatz zu sammeln, der für die dreidimensionale Strukturbestimmung benötigt wird. Die in diesem Video gezeigten Klonierungs- und Proteinreinigungsstrategien führten zu 14 gereinigten PB-2-Proben, von denen neun Kristalle ergaben, die für Beugungsstudien geeignet sind. Der hauseigene Röntgenbeugungsdatensatz wurde an fünf der neun Konstrukte mit QK-Alpha-Strahlung unter Verwendung eines superhellen FRE plus rotierenden Röntgengenerators von Rigaku gesammelt, der mit ossec variax hf, HF-Optiken und einem Saturn 944 plus CCD-Detektor ausgestattet war.

Hier ist ein Röntgenbeugungsbild der Polymerase PB zwei Untereinheiten zu sehen. Jeder Datensatz wurde aufbereitet und es wurden insgesamt vier Strukturen der PB zwei Untereinheiten bestimmt. Jede Struktur wurde von Fachleuten begutachtet und zur öffentlichen Zugänglichkeit in die Proteindatenbank hochgeladen.

Diese Abbildung zeigt Banddiagramme der Moleküle in der kristallographischen asymmetrischen Einheit. Von den vier PB-Zwei-Strukturen sind die Sekundärstrukturen in einem Regenbogenmuster mit entsprechenden PDB-Codes eingefärbt. In dieser Tabelle ist die Ergebnisanalyse für die Influenza-PB zwei Ziele nach den in diesem Videoartikel beschriebenen Methoden dargestellt.

Die parallele Multi-Target-Prozesspipeline für die Gen-zu-Struktur-Bestimmung wird in fünf Schritten veranschaulicht: Klonierung, Löslichkeit, Reinigung, Kristallisation und Strukturbestimmung. Die Ergebnisse unserer strukturbiologischen Pipeline bilden nicht nur die Grundlage für die strukturbasierte Forschung, sondern speisen auch zusätzliche Studien wie funktionelle Assays zur Bestätigung der Proteinfunktion oder biophysikalisches Screening neuartiger Verbindungen in einem MAR oder SPR, um neue Ansatzpunkte für die Wirkstoffentwicklung zu identifizieren. Diese Technik und die damit verbundenen Werkzeuge haben dazu beigetragen, den Weg für Strukturbiologen zu ebnen, um viele Arten von entdeckungsbasierten Untersuchungen zu erkennen, einschließlich des strukturbasierten Wirkstoffdesigns, das einen enormen Einfluss auf die menschliche Gesundheit und Krankheit hatte.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die parallele Verarbeitung mit mehreren Zielen den Erfolg der strukturierten Bestimmung erheblich steigern kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in einem Labor für Strukturbiologie äußerst gefährlich sein kann und die richtigen Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. die Verwendung von PSA, immer bei Laboraktivitäten getroffen werden sollten.