Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszenzmarkierte bakterielle Symbianz innerhalb ihres Nematodenwirts zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die Bakterien zunächst durch Konjugation mit einem fluoreszierenden Protein markiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, AIC-Nematoden durch die Entnahme von Eiern zu isolieren.

Als nächstes werden die AIC-Nematoden in Kombination mit ihrem fluoreszenzmarkierten bakteriellen Symbianten gezüchtet, um eine natürliche Assoziation zu ermöglichen, letztendlich die Lokalisierung des bakteriellen Symbianten innerhalb des Nematodenwirts. Und die Häufigkeit dieser Assoziation innerhalb der Nematodenpopulation kann durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Symbiose zu beantworten, z. B. wo sich Bakterien in ihrem Wirt lokalisieren und wie ist die Verteilung des Bakterientransports in einer Wirtspopulation?

Nach dem Wachstum der Bakterienstämme, der Subkultur, des Spenders und der Helferstämme über Nacht in nährstoffreiche Wachstumsmedien ohne Antibiotika in einem Verhältnis von Kultur zu Medium von eins zu 100, wachsen die Kulturen dann bei der für jeden Stamm geeigneten Temperatur, bis sie das mittlere logarithmische Wachstumsstadium erreichen. Kombinieren Sie anschließend die Stämme in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Mischkulturen zwei Minuten lang. Bei 17.900 g wird der Überstand dekantiert und das Pellet in 30 Mikrolitern frischem Medium gedreht. Tupfen Sie dann die Suspension ohne Antibiotika auf eine nährstoffreiche Medienplatte und lassen Sie die Stelle trocknen, wenn die Suspension getrocknet ist.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht umgedreht bei einer Temperatur, die für das Empfängerbakterium optimal und gegebenenfalls für den Spender und den Helfer zulässig ist. Kratzen Sie nun den Fleck und den Streifen für einzelne Kolonien auf einer selektiven Antibiotikaplatte auf, um eine reine Kultur von Bakterienstreifen zu erhalten, eine einzelne Kolonie zur Isolierung. Stellen Sie schließlich sicher, dass es sich bei den resultierenden Kolonien um den Empfängersymbianten und nicht um den Spenderstamm handelt.

Durch Screening auf das Vorhandensein von empfängerspezifischen Phänotypen. Zum Beispiel können Cino-Abdi-Bakterien von E-coli unterschieden werden, indem ein Katalysatortest durchgeführt wird, der auf das Vorhandensein des Plasmids untersucht wird, indem die Fluoreszenz unter der Wellenlänge bestätigt wird, die dem fluoreszierenden Plasmidprotein entspricht. Nachdem das natürliche Bakteriensymbiant über Nacht gezüchtet wurde, verteilen Sie 600 Mikroliter der Bakterienkultur auf acht bis 10,10 Millimeter große Lipidbelüfte und inkubieren Sie die Platten dann im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 Grad Celsius.

Nach zwei Tagen geben Sie 5.000 infektiöse juvenile Nematoden in 500 Mikrolitern Medium zu den Bakterienrasen. Nachdem Sie die Platten drei Tage lang bei 25 Grad Celsius inkubiert haben, geben Sie 20 Mikroliter Wasser auf einen Objektträger. Kratzen Sie dann mit einem sterilen Stäbchen eine kleine Menge Nematoden vom Bakterienrasen ab.

Lege den Stock ins Wasser, damit die Nematoden davonschwimmen können. Schau dir diese Rutsche mit geringer Vergrößerung an. Wenn Eier und Weibchen sichtbar sind, fahren Sie fort, wenn die Weibchen Eier enthalten, geben Sie einige Milliliter Wasser auf die Oberfläche der Platten, schwenken Sie die Platten vorsichtig und gießen Sie dann das Wasser in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Die Nematoden sollten sich von den Platten lösen und nicht mehr auf der Plattenoberfläche sichtbar sein. Lassen Sie die Nematoden am Boden des Rohrs absetzen, spritzen Sie dann das überschüssige Wasser von der Oberseite des Rohrs ein und füllen Sie das Rohr wieder mit sauberem Wasser. Nachdem Sie die adulten Nematoden abgesetzt und das überschüssige Wasser erneut abgetropft haben, füllen Sie die konischen Röhrchen mit Eilösung.

Anschließend die Röhren durch sanftes Wenden genau 10 Minuten bei Raumtemperatur mischen. Nach dem Schütteln werden die konischen Röhrchen sofort genau 10 Minuten lang bei 1.250 g und Raumtemperatur mit eingeschalteter Pause zentrifugiert. Dann den Überstand schnell dekantieren, das Pellet durch Pipettieren wieder mit Eilösung resuspendieren und das konische Röhrchen mit frischer Eilösung füllen.

Mischen Sie die Eisuspension gut, indem Sie das Röhrchen drei- bis fünfmal umdrehen und dann, nachdem Sie die Eier sofort pelletiert und den Überstand wie eben gezeigt dekantiert haben. Suspendieren Sie das Pellet in Misogynie, Brühe oder LB durch Pipettieren und geben Sie dann die Eisuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie nun das 15-Milliliter-Röhrchen mit lb, waschen Sie die Eier dreimal in der Brühe mit der gleichen Schnellschritttechnik wie gerade gezeigt und verdünnen Sie dann die resuspendierten P-Nematoden-Eier auf mindestens 10 Eier pro Mikroliter.

Übertragen Sie die Eier in eine sechs Zentimeter große Petrischale, die fünf Milliliter LB und Antibiotika gegen siedelnde Bakterien enthält. Die Platte kann bis zu vier Tage nach dem Wachstum über Nacht und der Selektion der fluoreszierenden Bakterien in Perfil eingewickelt gelagert werden. Verwenden Sie ein steriles Stäbchen, um 600 Mikroliter der Bakterienkultur auf 10 Millimeter große Lipidbelüfte zu verteilen und die Kultur bei 25 Grad Celsius zu inkubieren.

Geben Sie nach zwei Tagen 500 bis 5.000 Nematodeneier auf jede Lipidplatte. Wenn die Platte gelagert wurde, waschen Sie die Eier in 15 Millilitern LB, wie gerade gezeigt, mindestens einmal, bevor Sie die Eier auf den zuvor vorbereiteten Bakterienrasen inokulieren. Dann inkubieren Sie die Nematodenbakterien-Co-Kulturen im Dunkeln ohne Feuchtigkeit bei 25 Grad Celsius, bis infektiöse Jungtiere als unscharfer weißer Ring am Rand der Platte erscheinen.

Wenn die infektiösen Jungtiere beobachtet wurden. Entfernen Sie den Deckel der Lipid-Agar-Platte und setzen Sie den Boden der Platte in den Boden einer leeren 100 Millimeter x 20 Millimeter großen Petrischale. Füllen Sie dann die Petrischale mit so viel Wasser, dass sie etwa die Hälfte der Höhe der kleineren Platte erreicht, und inkubieren Sie die Wasserfalle, bis die infektiösen Jungtiere aus dem Wasser geschlüpft sind.

Nach dem Sammeln der Nematoden aus dem Wasser oder im gewünschten Lebensstadium von dem entsprechenden Bakterienrasen lösen Sie einige Körner Ole in 30 Mikrolitern Wasser und bei ein bis zwei Mikrolitern dieses lähmenden Mittels pro 50 Mikroliter Nematodenprobe. Übertragen Sie dann etwa 20 bis 30 Mikroliter der gelähmten Nematodenprobe auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas auf die Probe. Betrachten Sie die Nematoden mit Hilfe der Lichtmikroskopie, um sicherzustellen, dass sich die Nematoden im Sichtfeld befinden.

Zur Identifizierung der bakteriellen Lokalisation. Fotografieren Sie die Nematoden zusätzlich zur Lichtmikroskopie-Einstellung unter Fluoreszenzmikroskopie und überlagern Sie dann die Bilder. Es kann notwendig sein, mehrere Vergrößerungen und Ansichten des Fadenwurms auszuprobieren, um die Bakterien zu finden.

Eine Population der Nematoden aus zwei Medien wurde gezählt und für die Besiedlung durch den bakteriellen Symbianten bewertet. Für eine solide Statistik ist es am besten, mindestens 100 Nematoden pro Probe zu zählen, wobei mindestens 30 in jede Kategorie fallen, wie in der Tabelle zu sehen ist. Diese Nematoden sind zu etwa 14,6 % besiedelt, wenn sie auf Lipid-Agar gezüchtet werden, und zu 68,6 %, wenn sie auf Leber-Nieren-Agar gezüchtet werden.

Es wurde gezeigt, dass andere Nematoden- und Bakterienarten einen unterschiedlichen Besiedlungsgrad aufweisen. Dieses Schema veranschaulicht das allgemeine Erscheinungsbild der Steiner NEMA-Weibchen. Der Einschub zeigt das differentielle Interferenzkontrastbild einer S fot Grafikweibchen bei 20-facher Vergrößerung.

Der schwarze Pfeil im Einschub zeigt die Vulva, während die weißen Pfeile sichtbare Eier anzeigen. Dieses Bild zeigt ein entwickeltes, aber noch nicht geschlüpftes Volt-Nematoden-Ei bei 40-facher Vergrößerung, und diese Eier, die von s Volta-Nematoden isoliert wurden, wurden unter 10-facher Vergrößerung aufgenommen. In diesem ersten Bild sind repräsentative Mikroskopaufnahmen von Steiner-Nima-Nematoden zu sehen, die mit Xeno aptus-Bakterien assoziiert sind.

Alvins Nematoden wurden mit ihrem bakteriellen Symbianten in Verbindung gebracht, der GFP exprimiert, um dieses Kompositbild zu erzeugen. Ein Phasenkontrastbild wurde mit einem Fluoreszenzbild überlagert. Der Pfeil zeigt die Bakterien an, die im infektiösen juvenilen Fadenwurm vorhanden sind.

Dieses Bild zeigt einen juvenilen Fadenwurm S carpa capsi mit GFP, das X nla exprimiert. Das Bild wurde auf ähnliche Weise wie das vorherige Bild konstruiert und zeigt den juvenilen Nematoden mit grün fluoreszierenden Protein-markierten Bakterien, die als grüne Stäbchen sichtbar sind, die im gesamten Darmlumen des Fadenwurms lokalisiert sind. Zusätzlich zu dem beschriebenen Verfahren können andere Methoden wie die genetische Manipulation des bakteriellen Symbianten vor der Assoziation mit dem Nematodenwirt einbezogen werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche molekularen Mechanismen für die Assoziation der Wirtsmikrobe notwendig sind.