Name: Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Xenorhabdus-Bakterien in Steinernema-Nematoden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung symbiotischer Interaktionen in vivo.

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Die Autoren möchten sich Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Sugar, Eric Stabb und Todd Ciche für ihre Beiträge danken für die Entwicklung dieses Protokolls und Werkzeuge verwendet. KEM und JMC wurden von den National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 &quot;Mikroben in Health and Disease&quot;) unterstützt. JMC wurde von der National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Science Foundation (IOS-0.920.631 und IOS-0950873) unterstützt.

<ol><li>Holterman, M., van der Wurff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylum-wide+analysis+of+SSU+rDNA+reveals+deep+phylogenetic+relationships+among+nematodes+and+accelerated+evolution+toward+crown+clades%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Phylum-wide analysis of SSU rDNA reveals deep phylogenetic relationships among nematodes and accelerated evolution toward crown clades.</a> Mol. Biol. Evol. 23, 1792-1800 (2006).</li>
<li>Lambshead, P. J. D., Boucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+nematode+deep-sea+biodiversity+-+hyperdiverse+or+hype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biogeogr%22%5BJournal%5D)">Marine nematode deep-sea biodiversity - hyperdiverse or hype.</a> J. Biogeogr. 30, 475-485 (2003).</li>
<li>Poinar, G. O. J., Thomas, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+Achromobacter+nematophilus+Poinar+and+Thomas+%28Achromobacteraceae%3A+Eubacteriales%29+in+the+development+of+the+nematode%2C+DD-136+%28Neoaplectana+sp.+Steinernematidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteraceae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae).</a> Parasitol. 56, 385-390 (1966).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annu. Rev. Entomol. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Bird, A. F., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+intestinal+vesicle+in+nematodes+of+the+family+Steinernematidae%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The nature of the intestinal vesicle in nematodes of the family Steinernematidae.</a> Int. J. Parasitol. 13, 599-606 (1983).</li>
<li>Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Steinernema+carpocapsae+intestinal+vesicle+contains+a+subcellular+structure+with+which+Xenorhabdus+nematophila+associates+during+colonization+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Steinernema carpocapsae intestinal vesicle contains a subcellular structure with which Xenorhabdus nematophila associates during colonization initiation.</a> Cell. Microbiol. 7, 1723-1735 (2005).</li>
<li>Snyder, H. A., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+colonization+and+release+process+of+Xenorhabdus+nematophila+and+the+morphology+and+ultrastructure+of+the+bacterial+receptacle+of+its+nematode+host%2C+Steinernema+carpocapsae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New insights into the colonization and release process of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338-5346 (2007).</li>
<li>Abebe, E., Abebe-Akele, F., Morrison, J., Cooper, V., Thomas, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insect+pathogenic+symbiosis+between+a+Caenorhabditis+and+Serratia%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">An insect pathogenic symbiosis between a Caenorhabditis and Serratia.</a> Virulence. 2, 158-161 (2011).</li>
<li>Abebe, E., Jumba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entomopathogenic+Caenorhabditis+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">An entomopathogenic Caenorhabditis briggsae.</a> J. Exp. Biol. 213, 3223-3229 (2010).</li>
<li>Torres-Barragan, A., Suazo, A., Buhler, W. G., Cardoza, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+entomopathogenicity+and+bacterial+associates+of+the+nematode+Oscheius+carolinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Control%22%5BJournal%5D)">Studies on the entomopathogenicity and bacterial associates of the nematode Oscheius carolinensis.</a> Biol. Control. 59, 123-129 (2011).</li>
<li>Ye, W. M., Torres-Barragan, A., Cardoza, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscheius+carolinensis+n.+sp+%28Nematoda%3A+Rhabditidae%29%2C+a+potential+entomopathogenic+nematode+from+vermicompost%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Oscheius carolinensis n. sp (Nematoda: Rhabditidae), a potential entomopathogenic nematode from vermicompost.</a> Nematology. 12, 121-135 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterorhabditidoides+chongmingensis+gen.+nov.%2C+sp.+nov.+%28Rhabditida%3A+Rhabditidae%29%2C+a+novel+member+of+the+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov. (Rhabditida: Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes.</a> J. Invertebr. Pathol. 98, 153-168 (2008).</li>
<li>Martens, E. C., Heungens, K., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+colonization+events+in+the+mutualistic+association+between+Steinernema+carpocapsae+nematodes+and+Xenorhabdus+nematophila+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Early colonization events in the mutualistic association between Steinernema carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria.</a> J. Bacteriol. 185, 3147-3154 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen%2C+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen, Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Ciche, T. A., Kim, K. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+and+matricide+during+Photorhabdus+luminescens+transmission+by+Heterorhabditis+bacteriophora+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275-2287 (2008).</li>
<li>Easom, C. A., Joyce, S. A., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+the+mutualistic+colonization+of+the+nematode+Heterorhabditis+bacteriophora+by+the+bacterium+Photorhabdus+luminescens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in the mutualistic colonization of the nematode Heterorhabditis bacteriophora by the bacterium Photorhabdus luminescens.</a> BMC Microbiol. 10, 45(2010).</li>
<li>Somvanshi, V. S., Kaufmann-Daszczuk, B., Kim, K. S., Mallon, S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorhabdus+phase+variants+express+a+novel+fimbrial+locus%2C+mad%2C+essential+for+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photorhabdus phase variants express a novel fimbrial locus, mad, essential for symbiosis.</a> Mol. Microbiol. 77, 1021-1038 (2010).</li>
<li>Martens, E. C., Russell, F. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Xenorhabdus+nematophila+metabolic+mutants+yields+insight+into+stages+of+Steinernema+carpocapsae+nematode+intestinal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Xenorhabdus nematophila metabolic mutants yields insight into stages of Steinernema carpocapsae nematode intestinal colonization.</a> Mol. Microbiol. 51, 28-45 (2005).</li>
<li>Sugar, D. R., Murfin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+and+host+interactions+of+Xenorhabdus+bovienii+SS-2004%2C+the+entomopathogenic+symbiont+of+Steinernema+jollieti+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation and host interactions of Xenorhabdus bovienii SS-2004, the entomopathogenic symbiont of Steinernema jollieti nematodes.</a> Env. Microbiol. 14, 924-939 (2012).</li>
<li>Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenorhabdus+nematophila+nilABC+genes+confer+the+ability+of+Xenorhabdus+spp.+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Xenorhabdus nematophila nilABC genes confer the ability of Xenorhabdus spp. to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 190, 4121-4128 (2008).</li>
<li>Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Xenorhabdus+nematophila+genes+required+for+mutualistic+colonization+of+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes.</a> Mol. Microbiol. 45, 1337-1353 (2002).</li>
<li>Goetsch, M., Owen, H., Goldman, B., Forst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+PixA+inclusion+body+protein+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the PixA inclusion body protein of Xenorhabdus nematophila.</a> J. Bacteriol. 188, 2706-2710 (2006).</li>
<li>Bhasin, A., Chaston, J. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Analyses+Reveal+Overall+Topology+and+Functional+Regions+of+NilB%2C+a+Bacterial+Outer+Membrane+Protein+Required+for+Host+Association+in+a+Model+of+Animal-Microbe+Mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutational Analyses Reveal Overall Topology and Functional Regions of NilB, a Bacterial Outer Membrane Protein Required for Host Association in a Model of Animal-Microbe Mutualism.</a> J. Bacteriol. 194, 1763-1776 (2012).</li>
<li>Ciche, T. A., Goffredi, S. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCiche%2C+TA+%22Methods+in+General+and+Molecular+Microbiology%22">Methods in General and Molecular Microbiology</a>. Reddy, C. A. , ASM Press. 394-419 (2007).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D., Grewal, P. S., Ciche, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodrich-Blair%2C+H+%22Insect+Pathogens%2C+Molecular+Approaches+and+Techniques%22">Insect Pathogens, Molecular Approaches and Techniques</a>. Stock, S. P., Boemare, N., Vandenberg, J., Glazar, I. , CABI Publishing. 239-269 (2009).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. Lacey, L. A. , Elsevier Press. 375-425 (2012).</li>
<li>Martens, E. C., Gawronski-Salerno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophila+requires+an+intact+iscRSUA-hscBA-fdx+locus+to+colonize+Steinernema+carpocapsae+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophila requires an intact iscRSUA-hscBA-fdx locus to colonize Steinernema carpocapsae nematodes.</a> J. Bacteriol. 185, 3678-3682 (2003).</li>
<li>Vivas, E. I., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenorhabdus+nematophilus+as+a+model+for+host-bacterium+interactions%3A+rpoS+is+necessary+for+mutualism+with+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Xenorhabdus nematophilus as a model for host-bacterium interactions: rpoS is necessary for mutualism with nematodes.</a> J. Bacteriol. 183, 4687-4693 (2001).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
<li>Ciche, T. A., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((For+the+insect+pathogen+Photorhabdus+luminescens%2C+which+end+of+a+nematode+is+out%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of a nematode is out.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890-1897 (2003).</li>
<li>Sicard, M., Brun, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+native+Xenorhabdus+on+the+fitness+of+their+Steinernema+hosts%3A+contrasting+types+of+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of native Xenorhabdus on the fitness of their Steinernema hosts: contrasting types of interaction.</a> Parasitol. Res. 91, 520-524 (2003).</li>
<li>Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-Tn7+transposons+for+site-specific+tagging+of+bacteria+with+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins.</a> Environ. Microbiol. 6, 726-732 (2004).</li>
<li>Miller, W. G., Leveau, J. H., Lindow, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+gfp+and+inaZ+broad-host-range+promoter-probe+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Int%22%5BJournal%5D)">Improved gfp and inaZ broad-host-range promoter-probe vectors.</a> Mol. Plant Microbe Int. 13, 1243-1250 (2000).</li>
<li>Teal, T. K., Lies, D. P., Wold, B. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiometabolic+stratification+of+Shewanella+oneidensis+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatiometabolic stratification of Shewanella oneidensis biofilms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 7324-7330 (2006).</li>
<li>Bao, Y., Lies, D. P., Fu, H., Roberts, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+Tn7-based+system+for+the+single-copy+insertion+of+cloned+genes+into+chromosomes+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved Tn7-based system for the single-copy insertion of cloned genes into chromosomes of Gram-negative bacteria.</a> Gene. 109, 167-168 (1991).</li>
<li>Woodring, J. L., Kaya, H. K. Steinernematid and Heterorhabditid Nematodes: A Handbook of Biology and Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoodring%2C+JL+%22Southern+Cooperative+Series+Bulletin+331%22">Southern Cooperative Series Bulletin 331</a>. , Arkansas Agricultural Experiment Station. (1988).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebene Protokoll stellt ein Verfahren zur optischen Detektion von Bakterien in einer Nematode Host (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die optische Transparenz von Nematoden und die Fähigkeit zur Fluoreszenz-Label Bakterien, mit der in vivo-Analyse von Bakterien innerhalb des Nematoden Host (Abbildung 3). Insbesondere, identifiziert dieser Ansatz bakteriellen Lokalisation innerhalb seines Wirtes. Durch Zählen einer Nematoden Bevölkerung und Scoring für bakterielle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Lipid Agar (Steril) </td><td></td><td></td><td> 8 Gramm Nährbrühe, 15 Gramm Agar, 5 g Hefeextrakt, 890 ml Wasser, 10 ml 0,2 g / ml MgCl 2. 6H 2 0, 96 ml Maissirup Lösung *, 4 ml Maisöl * Stir Medien während Giesserplatten * In sterile Wirkstoff nach dem Autoklavieren </td></tr><tr><td> Corn Syrup Lösung (Steril) </td><td></td><td></td><td> 7 ml Maissirup, 89 ml Wasser Mix und Autoklaven </td></tr><tr><td> Egg Lösung </td><td></td><td></td><td> 16,6 ml 12% ige Natriumhypochlorit, 5 ml 5M KOH, 80 ml Wasser </td></tr><tr><td> Lysogenie Broth (Steril) </td><td></td><td></td><td> 5 Gramm Hefeextrakt, 10 g Trypton, 5 g Salz, 1 L Wasser Mix und Autoklaven </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Fischer </td><td> 13-100-675 </td><td> Jede Mikrofuge die Mikrozentrifugenröhrchen hält funktionieren </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman </td><td> 366802 </td><td> Große Tischzentrifuge, die 15 ml und 50 ml konischen Röhrchen hält </td></tr><tr><td> Sterile 60 mm X 15 mm Petrischale </td><td> Fischer </td><td> 0875713 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Zentrifugenröhrchen </td><td> Fischer </td><td> 05-539-6 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Zentrifugenröhrchen </td><td> Fischer </td><td> 05-531-6 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile 100 mm X 20 mm Petrischale </td><td> Fischer </td><td> 0875711Z </td><td> Tiefer als Standard-Petrischalen </td></tr><tr><td> 24-Well-Platte </td><td> Greiner Bio-One &lt;/ Td&gt; <td> 662000-06 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> Das Mikroskop muss florescent Funktionen kompatibel mit Ihrem Fluorophor </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> PBS (Steril) </td><td></td><td></td><td> 8 g NaCl 0,2 g KCL 1,44 g Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 1 l Wasser Den pH-Wert von 7,4 und Wasser auf 1 l und Autoklav </td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fischer </td><td> 05-408-138 </td><td> 2 ml oder 1,5 ml Röhrchen </td></tr><tr><td> Shaker </td><td></td><td></td><td> Jeder Schüttler, der die Flüssigkeit sanft bewegen verursacht wird funktionieren </td></tr><tr><td> Diaminopimelinsäure </td><td> Sigma </td><td&gt; D-1377 </td><td> Wenn nötig, zu ergänzen Medien auf eine Konzentration von 1 mM oder </td></tr></tbody></table>

visualisierung bakterien in nematoden durch fluoreszenzmikroskopie

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbiosen, das Zusammenleben von zwei oder mehr Organismen sind in allen Reichen des Lebens verbreitet. Als zwei der am weitesten verbreiteten Organismen auf der Erde bilden Nematoden und Bakterien eine breite Palette von symbiotische Assoziationen, die von Vorteil für pathogene 1-3. Eine solche Vereinigung ist die gegenseitig vorteilhafte Beziehung zwischen Xenorhabdus Bakterien und Steinernema Nematoden, die als Modellsystem Symbiose 4 entstanden ist. Steinernema Nematoden sind entomopathogenen, indem sie ihre bakteriellen Symbionten zu töten Insekten 5. Für die Übertragung von Insekten Gastgeber, besiedeln die Bakterien im Darm der Nematoden der infektiösen jugendlichen Stadium 6-8. In jüngster Zeit haben mehrere andere Nematoden wurde gezeigt, dass Bakterien nutzen zu töten Insekten 9-13, und Untersuchungen haben begonnen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Nematoden und Bakterien in diesen Systemen &lt;sup&gt; 9. Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung eines bakteriellen Symbionten innerhalb oder auf einer Nematode Host, unter Ausnutzung der optischen Transparenz der Nematoden, wenn durch Mikroskopie angesehen. Die Bakterien werden konstruiert, um ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wodurch deren Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie. Viele Plasmide zur Verfügung, die für Proteine ​​kodierenden Genen tragen, die bei verschiedenen Wellenlängen (dh grün oder rot), und die Konjugation von Plasmiden aus einer Escherichia coli Donor-Stamm in einen Empfänger bakteriellen Symbionten fluoreszieren erfolgreich ist für ein breites Spektrum von Bakterien. Die beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um den Zusammenhang zwischen Steinernema carpocapsae und Xenorhabdus nematophila 14 zu untersuchen. Ähnliche Verfahren sind verwendet worden, um andere nematodeninduzierbares Bakterium Assoziationen 9, 15-18 untersuchen und der Ansatz ist deshalb allgemein anwendbar. Der method ermöglicht die Charakterisierung von bakteriellen Präsenz und Lokalisierung innerhalb Nematoden in verschiedenen Stadien der Entwicklung, Einblicke in die Natur des Vereins und der Prozess der Kolonisierung 14, 16, 19. Mikroskopischen Analyse ergibt sowohl Kolonisierung Frequenz innerhalb einer Population von Bakterien und Lokalisierung von Geweben 14, 16, 19-21 hosten. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Methoden zur Überwachung Bakterien innerhalb Nematodenpopulationen, wie Ultraschallbehandlung 22 oder Schleifen 23, die Durchschnittswerte der Besiedlung bestimmt, die aber nicht zum Beispiel diskriminieren Populationen mit einer hohen Frequenz von niedrigen Lasten aus symbiont Populationen mit eine niedrige Frequenz von hoher Symbionten Lasten. Unterscheiden der Frequenz und der Last besiedelnden Bakterien kann besonders wichtig bei der Durchmusterung oder Charakterisierung bakteriellen Mutanten zur Besiedelung Phänotypen 21, 24. Tatsächlich hat Fluoreszenzmikroskopie in Hochdurchsatzscreening von bakteriellen Mutanten für Defekte in Kolonisierung 17, 18 eingesetzt, und ist weniger aufwendig als andere Verfahren, einschließlich Ultraschallbehandlung 22, 25-27 und Nematoden einzelnen Dissektion 28, 29.

Um die Mutualismus zwischen studieren<em&gt; Xenorhabdus</em&gt; Bakterien und<em&gt; Steinernema</em&gt; Nematoden, Methoden wurden entwickelt, um bakterielle Präsenz und Position innerhalb Nematoden überwachen. Der experimentelle Ansatz, der auf andere Systeme angewendet werden kann, bringt Engineering Bakterien das grün fluoreszierende Protein exprimieren und zu visualisieren, mittels Fluoreszenzmikroskopie Bakterien innerhalb des transparenten Nematoden.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Symbiosen, das Zusammenleben von zwei oder mehr Organismen, sind in allen Reichen des Lebens weit verbreitet. Als zwei der allgegenwärtigsten Organismen auf ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmarkierte bakterielle Symbionten innerhalb ihres Nematodenwirts zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die Bakterien zunächst durch Konjugation mit einem fluoreszierenden Protein markiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, AIC-Nematoden durch Gewinnung von Eiern zu isolieren.Anschließend werden die AIC-Nematoden in Kombination mit ihrem fluoreszenzmarkierten bakteriellen Symbionten kultiviert, um eine natürliche Assoziation und letztlich die Lokalisation des bakteriellen Symbionten innerhalb des Nematodenwirts zu ermöglichen. Die Häufigkeit dieser Assoziation innerhalb der Nematodenpopulation kann mittels Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Symbiose zu beantworten, beispielsweise, wo sich Bakterien innerhalb ihres Wirts lokalisiert haben, und wie die Verteilung der bakteriellen Besiedlung über eine Wirtspopulation aussieht.Nach dem Übernacht-Wachstum der Bakterienstämme werden die Donator-, Rezipienten- und Helferstämme im Verhältnis 1:100 (Kultur zu Medium) in ein nährstoffreiches Wachstumsmedium ohne Antibiotika überimpft und anschließend bei d

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in...

Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronen-Tomographie zur Auflösung raumzeitlicher Merkmale des Sekretionssystems Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert die Herstellung und Bildgebung fluoreszierend markierter pathogener Bakterien. Agarose-Pads werden zunächst vorbereitet und in einem klebrigen Rahmen positioniert. Eine Suspension von genetisch veränderten Bakterien, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren,...

Probenvorbereitung und Bildgebung fluoreszenzmarkierter Bakterien

Dieses Video demonstriert die Bewertung der neurodegenerativen Wirkungen einer Testchemikalie auf Caenorhabditis elegans mit fluoreszenzmarkierten Neuronen. Normale Neuronen zeigen eine helle Fluoreszenz von intakten Somas und Fortsätzen, während verminderte Fluoreszenz, geschwollenes Soma und punktuelle Fortsätze auf Neurodegeneration hinweisen.

Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Neuronen von Caenorhabditis elegans

Dieses Video zeigt das Verfahren zur in vivo-Bildgebung von C. elegans, die prionenähnliche Proteine exprimieren, die mit rot fluoreszierendem Protein markiert sind. Das Protokoll beinhaltet die Immobilisierung von Nematoden auf einem Agarose-Pad für die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die Proteinaggregation und den Transport innerhalb und zwischen den Zellen aufzudecken. Diese Technik ist entscheidend für die Untersuchung der Proteinaggregation im Zusammenhang mit neurodegenerativen...

Zeitraffer-Bildgebung zur Überwachung der transzellulären Ausbreitung prionenähnlicher Proteine in transgenen Nematoden

Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Hier wird ein Protokoll zur Überwachung des Abbaus des mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2 verschmolzenen Proteins Huntingtin vorgestellt.

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

Junge erwachsene Caenorhabditis elegans Nematoden sind 2-24 h lang unterschiedlichen Konzentrationen kommerzieller Pestizide oder anderer Giftstoffe ausgesetzt. Dann können verschiedene Neuronen mit fluoreszierenden exprimierenden Stämmen sichtbar gemacht werden. Dieses Papier zeigt, wie man Nematoden Pestiziden aussetzt und Neuronenschäden bewertet.

Untersuchung der Wirkung von Pestiziden auf Caenorhabditis elegans Neuronen

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

Die Arbeit beschreibt die Optimierung von Fluoreszenzmikroskopie-Erfassungsparametern, um den axonalen Transport von endogenen markierten Frachten mit Einzelneuronenauflösung in einem lebenden Fadenwurm sichtbar zu machen.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Xenorhabdus-Bakterien in Steinernema-Nematoden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung symbiotischer Interaktionen in vivo.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

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