Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den trans vivo DTH-Assay zu verwenden, um sowohl pro- als auch antiinflammatorische Antigen-spezifische Reaktionen bei menschlichen Probanden zu überwachen. Isolieren Sie zunächst mononukleäre Zellen des peripheren Blutes aus dem peripheren Blut des menschlichen Probanden. Mischen Sie dann die PBMC-Zubereitung mit PBS.

Recall-Antigen-Test-Antigen und Test-Antigen plus Recall-Antigen. Fahren Sie mit den Messungen der Fußballen fort und injizieren Sie die vorbereiteten Mischungen in die Skid-Mäuse. Die Fußballen wiederholen die Messungen 24 Stunden später. Drei.

Definitive Muster von DTH-Reaktionen sind möglich: regulatorisch, nicht-regulatorisch und sensibilisiert. Der trans-vivo-Überempfindlichkeitsassay vom verzögerten Typ kann zur Bestimmung klinischer Parameter wie Allo-Reaktionsantworten eingesetzt werden, bei denen die Antigenquelle die Zellen des Transplantatspenders sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden In-vitro-Methoden besteht darin, dass sowohl entzündungsfördernde als auch regulatorische Reaktionen auf allo-Antigene, Autoantigene oder Tumorantigene mit einem einzigen Assay-System leicht nachgewiesen werden können.

Egon, ein Forscher in meinem Labor, wird nun das Verfahren demonstrieren: Bei Verwendung von frischem menschlichem peripherem Blut, das in sauren Citrat-Dextrose-Röhrchen gesammelt wurde, um die Aktivierung von Blutplättchen zu vermeiden. Isolierung von PBMC unter Verwendung eines Lymphozytentrennmediums nach Standardmethoden. Waschen Sie das PBMC-Präparat mit PBS, um kontaminierende Blutplättchen zu entfernen.

Wenn eine auffällige Kontamination der roten Blutkörperchen vorliegt, führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen mit einem CK-Lysepuffer durch. Führen Sie dann zwei weitere Wäschen mit PBS Resus durch. Suspendieren Sie das PBMC in PBS in einer Konzentration von 10 Millionen PBMC pro Milliliter für das allo-Antigen.

Beginnen Sie mit P-BMCs, die aus dem peripheren Blut des Spenders unter Verwendung des zuvor gezeigten Verfahrens isoliert wurden. Dann Reanimation. Suspendieren Sie die Spenderzellen in PBS in einer Konzentration von 120 Millionen Zellen pro Milliliter und fügen Sie ein Mikromolar PMSF hinzu, um den Proteinabbau zu verhindern.

Nun wird die Zellsuspension mit sieben Ein-Sekunden-Impulsen mit einer Zwei-Millimeter-Sonde sonica beschallt. Mit einem Hämozytometer. Überprüfen Sie die Störung von mehr als 90 % der Zellen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Mischung bei 14.000 U/min bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Den Überstand vorsichtig in ein Röhrchen mit zwei sicheren Verschlüssen überführen und die Proteinkonzentration mit Standardmethoden für jede Injektion bestimmen. Aliquotiert sieben mal 10 zum sechsten P BMCs in zwei Milliliter.

Safe Lock Tubes pelletieren die Zellen durch Zentrifugation. Bereiten Sie zunächst die Negativkontrollsuspension von PBMC in 35 Mikrolitern PBS vor. Fügen Sie dann für die Positivkontrolle 25 Mikroliter eines Rückrufantigens, Tetanus, Toxoid, Diptherie, Toxoid hinzu und stellen Sie das Injektionsvolumen mit PBS auf 35 Mikroliter ein.

Gemäß dem Versuchsdesign zur Bewertung der spenderspezifischen Reaktion resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Mikrolitern Spenderantigen plus 25 Mikroliter PBS für ein Gesamtvolumen von 35 Mikrolitern. Zur Bewertung der experimentellen Donorantigen-spezifischen Regulation wird das Zellpellet in 35 Mikrolitern durch Zugabe von 10 Mikrolitern Spenderantigen und 25 Mikrolitern Recall-TT-DT-Antigen reanimiert. Nach der Betäubung platziert die Gleitmaus mit Fluor einen federbelasteten Messschieber in der Mitte eines Fußpolsters, wobei eine Kante das letzte Laufpolster des Fußes berührt, um einen Maßstab zu setzen, um die Messstelle konsistent zu halten, wenn sich der Messwert stabilisiert hat.

Notieren Sie die Grunddicke der Fußballen für die Fußballeninjektion. Platzieren Sie die Spritze so, dass die Nadel in Richtung der Zehen zeigt und die Fase nach oben zeigt. Beginnen Sie nun mit subkutanen Injektionen jeder Zellsuspension in die hinteren Fußpolster für die Maus.

Nummer eins, injizieren Sie langsam das rechte Fußpolster mit Negativkontrollpräparat. Als nächstes injizieren Sie das linke Fußpolster mit der Positivkontrolle von PBMC plus TT dt. Bringen Sie nun die Maus wieder in ihren Käfig für die Maus zurück.

Nummer zwei, injizieren Sie den rechten Fußballen mit PBMC plus Allo-Antigen und den linken Fußballen mit PBMC plus Allo-Antigen plus TT dt. Stellen Sie sicher, dass etwa 18 bis 24 Stunden nach der Injektion kein Leck auftritt. Betäuben Sie jede Maus mit Fluor und wiederholen Sie die Messung der Schwellung der Fußballen.

Subtrahieren Sie die Dicke jedes Fußpolsters vor der Injektion vom Wert nach der Injektion, um den Wert für die Schwellung des Fußpolsters zu erhalten. Berechnen Sie dann die antigenspezifische Nettoschwellung, indem Sie den Wert der Kontrollschwellung der Fußballen von den Schwellungswerten der Fußballen subtrahieren, die aus den Behandlungen erhalten wurden. Überprüfen Sie, ob die Positivkontrolle eine positive Kontrollreaktion auf den Abruf des Antigens TT DT von mehr als oder gleich 25 mal 10 bis minus vier Zoll über hat.

Eine Hintergrundreaktion auf PBS ist erforderlich, damit der Test als gültig angesehen werden kann. Bestimmen Sie als Nächstes die Hemmung von Recall-Reaktionen in Gegenwart von Spenderantigenen. In diesem Experiment werden Empfänger von Nierentransplantaten auf die spezifische Reaktion des Spenderantigens und auf die Regulation untersucht.

Es gibt drei Hauptmuster der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ bei Transplantatempfängern: regulatorisch, nicht-regulatorisch und sensibilisiert. Alle Patienten sprachen stark auf die positive Kontrolle des Recall-Antigens tt an. Patient Nummer 62 zeigt das Regulationsmuster, das durch eine schwache Reaktion auf das Spenderantigen und eine ausgeprägte verknüpfte Suppression zur Erinnerung an die Antigenantwort in Gegenwart des Spenderantigens gekennzeichnet ist.

Dies ist das Muster, das mit der Toleranz von Organ-Allotransplantaten verbunden ist. Patient Nummer 48 weist ein nicht-regulatorisches Muster auf, das durch ein schwaches Ansprechen auf den Spender, aber keine verknüpfte Suppression gekennzeichnet ist. Dieses Muster wurde häufig bei Patienten beobachtet, die Immunsuppressiva einnehmen.

Patient Nummer acht weist das spendersensibilisierte Muster auf, das durch eine hohe Reaktion auf das Spenderantigen und keine verknüpfte Suppression gekennzeichnet ist. Diese Reaktion ist mit einer Abstoßung des Transplantats verbunden. In klinischen Fallstudien wurden P-BMCs von Probanden, die an einer Beobachtungsstudie teilnahmen, auf spenderspezifische indirekte Signalwege, T-Effektoren und T-regulatorische Reaktionen untersucht, um die Rolle der spenderspezifischen Regulation bei der klinischen Toleranz zu bewerten.

Die indirekte Tektorantwort auf Donorantigene zeigt ein ausgeprägtes Spektrum über die Rekrutierungsgruppen hinweg. Die Schwellung der Fußballen nimmt zu, wenn sich der klinische Status des Patienten von toleranten zu chronisch abstoßenden Patienten verändert. Hier misst der Linked Suppression Assay den indirekten Weg der regulatorischen T-Reaktion gegen Donoren.

Diese Daten zeigen eine Abnahme der regulatorischen Reaktionen über den Bereich von den tolerantesten Patienten über intermediäre bis hin zu den am wenigsten toleranten chronisch abstoßenden Patienten. Zusammengenommen. Die Immunregulation, gemessen mit dem trans vivo DTH-Assay, scheint ein wichtiger Mechanismus für die Akzeptanz von Nierentransplantaten zu sein.

Ein vielversprechender Bereich ist die Anwendung des TDTH-Assays bei der Überwachung der Autoimmunität. Unsere Studie über die Rolle von Kollagen Typ 5 im pathologischen Prozess der Bronchiolitis OBL-Syndrom zeigte, dass das höchste relative Risiko für die Entwicklung von BOS bei Patienten mit einer positiven Reaktion auf Kollagen beobachtet wurde. Fünf pbmc von Empfängern von Lungentransplantaten, aber nicht von gesunden Kontrollpersonen oder Kollagen.

Vier reaktive Gutweide-Syndrom Patienten nach Nierentransplantation waren häufig Kollagen fünf reaktiv. Der TDTH-Assay kann auch verwendet werden, um die Reaktivität von pbmc von Krebspatienten auf tumorspezifische Antigene zu testen. Zum Beispiel kann das Vorhandensein von PAP-spezifischen T-regulatorischen Zellen bei Prostatakrebspatienten das Ansprechen auf eine Impfung mit PAP-Antigen einschränken.

Der TRANSVAAL DTH-Assay ist ein neuartiger diagnostischer Test mit klinischer Anwendung bei der Beurteilung zellvermittelter Immunantworten bei Transplantationskrebs- und Autoimmunpatienten. Es ist wertvoll, weil es nicht nur bei der Überwachung von T-Effektor-Recall-Reaktionen nützlich ist, sondern auch zum Nachweis von T-Regulationsreaktionen verwendet werden kann, da es nicht auf eine bestimmte Zytokinmessung zum Nachweis von Effekt- oder regulatorischen T-Zellen angewiesen ist. Es ist sehr flexibel und breit einsetzbar.