Name: Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Erfahren Sie die DGMP-Technik zur Herstellung mehrschichtiger, biokompatibler Zellkultur-Scaffolds für Tissue Engineering. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise Untersuchungen des Zellverhaltens.

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Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung aus New Innovator NIH Director Awards (1DP2 OD006499-01 bis AA und 1DP2 OD006460-01 bis AJE) und King Abdulaziz City for Science and Technology (UC San Diego Center of Excellence in Nanomedizin). Wir möchten Ms. Jessica Moore für ihre kritischen Anmerkungen zum Manuskript danken.

Ein. Synthese von fluoreszenzmarkierten Acryloyl-PEG-RGDS <ol><li> Reagieren des RGDS-Peptids mit Acryloyl-PEG-Succinimidyl carboxymethylester (APEG-SCM, PEG MG: 3400 g / mol) und NN Diisopropylethylamin (DIPEA) in 1.2:1:2 Molverhältnisse in Dimethylsulfoxid (DMSO) unter Argon bei Raumtemperatur Übernachtung. </li><li> Bestätigen Konjugation durch Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie. Hinzufügen 1 ul APEG-RGDS Reaktionslösung zu einer Probe Fleck auf das MALDI-Target und trocken. Bereiten Sie eine gesättigte Lösung von Universal MALDI Matrix in Tetrahydrofuran (THF) und Vortex für 1 min. Fügen Sie ~ 1 ul dieser Lösung auf die gleiche Probe vor Ort. Wiederholen Sie den Vorgang für APEG-SCM für den Vergleich. Laden und zu analysieren. Das Molekulargewicht APEG-RGDS sollte größer sein als APEG-SCM (Abbildung 2). </li><li> Um das Fluorophor konjugiert, fügen eine äquimolare Menge von Alexa Fluor 350 carbonsäure (succinimydyl Ester), gelöstin einem minimalen Volumen von DMSO, die RGDS-APEG Reaktionslösung von 1,1 und reagieren unter Argon bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Läutern APEG-RGDS-350 durch Dialysieren (MW 3500 Da) gegen DI-H 2 O bei 4 ° C für 48 h bei 1.000:1 Volumenverhältnis, Austauschen Dialysat wenigstens zweimal pro Tag. </li><li> Freeze Dry das gereinigte APEG-RGDS-350 in einer Labconco Freezone Plus oder gleichwertige Freeze Dry-System und bei -20 ° C. </li></ol> 2. Herstellung eines 2D-Mold und Anfertigung einer 2D PEG Gel mit alternierenden Schichten RGDS-350 <ol><li> Bereiten hydrophoben Glasträger. Zeigen sauberes Glas gleitet in einer Glasschale in einem Vakuumofen. Wärme auf 80 ° C für 30 min vollständig trocknen die Flächen. Platz Teller mit Folien in einer Abzugshaube und 250 ul Sigmacote zu jeder Folie, sanft schaukelnden für 30 sec zu beschichten gesamte Fläche. Gründlich die beschichteten Objektträger mit 100% Methanol, gefolgt von Waschen in destilliertem Wasser, Einweichen zweimal für 5 min in bei Leasingt 10 ml. </li><li> Cut Silikon-Abstandshalter (0,8 mm dick) mit 10 mm Biopsieausstanzungen. </li><li> Autoklaven werden die Silikon-Abstandshalter und Sigmacote behandelten Objektträger. </li><li> Formulierung von Lösungen für jedes jeweilige Schicht in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen durch Mischen PEG-diacrylat (PEGDA) Vorstufe (Endkonzentration 15% w / v) mit unterschiedlichen Mengen von Iodixanol (60% ige Stammlösung in Wasser) in unterschiedlichem Endkonzentrationen (zB 40% zu ergeben, 30%, 20% und 10%) zur Ergänzung der restliche Volumen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), um Lösungen von abgestuften Dichten zu erhalten. In einer ähnlichen Weise, zum alternierenden Schichten, um Mischung APEG-RGDS-350 (8 mM Endkonzentration) mit Iodixanol und PBS zu ergeben verschiedenen Konzentrationen (z. B. 35%, 25% und 15%). </li><li> Hinzufügen Fotoinitiator (2-Hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon, 333mg/ml stock in N-vinylpyrrolidon) zu jeder Lösung für verschiedene Schichten (10 ul Stammlösung pro ml jeder Schicht Lösung). Photoinitiator is zuletzt zugegeben, um die Polymerisation vor Schichtung der Gele in der Form zu verhindern, da sie lichtempfindlich ist. </li><li> Nachfolgende Schritte dieses Protokoll wird in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Filtern sterilisieren jede Lösung mit einer sterilen 1-ml-Spritze und 0,2 um Filter. Montieren Sie den Werkzeug-Setups durch Anordnen der Abstandhalter zwischen zwei Sigmacore behandelten Glasplatten und mit Zwingen befestigen Platzierung wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Warf die geschichteten Gele, indem das dichteste Lösung (zB PEGDA mit 40% Iodixanol) zunächst durch eine weniger dichte Lösung (zB APEG-RGDS-350 mit 35% Iodixanol) gefolgt. Wiederholen des alternativen Schichtung mehrere Schichten von gewünschten Zusammensetzung und Dichten zu erzielen, wie in Abbildung 1 gezeigt. </li><li> Bestrahlen der Form mit 365 nm Licht für 3 min unter Verwendung eines tragbaren UVR-9000 Lampe. Lassen Sie die polymerisierte Gele für 5 min zu heilen. Entfernen Sie die Klammern, dann heben Sie die obere GlasRutsche und die Form, die geschichtete DGMP Gele werden auf den Folien bleiben. Mit einem sterilen Spatel, vorsichtig die Gele in einem 50 ml Röhrchen mit sterilem PBS oder Kulturmedium für Wäsche. </li><li> Waschen der polymerisierten Gele in PBS bei 1.000:1 Volumenverhältnis, Austauschen Puffer mindestens zweimal pro Tag das Dichtemodifikationsmittel, Photoinitiator und nicht umgesetztem Polymer zu entfernen. Alternativ kann PBS mit Zellwachstumsmedium ausgetauscht werden. Speichern der DGMP Gele in PBS oder Wachstumsmedium für die Zellkultur Experiment in Schritt 3 beschrieben. </li><li> Um abwechselnden Schichten visualisieren, zu veranlassen DGMP Gel (diese Gele nicht verwendbar für die Zellkultur) entlang einer Lineal auf der Probenschale eines VersaDoc Geldokumentation Einheit. Setzen der Gele in 350 nm; die Belichtungszeit variiert in Abhängigkeit von der Konzentration des Fluorophors. Abwechselnd dunklen und blauen Streifen im DGMP Hydrogel demonstrieren Bildung von diskreten Schichten aus verschiedenen chemischen Zusammensetzung (Abbildung 3). </li></ol><ol><li> Für Gele Einbeziehung RGDS-Peptid, verwenden Adhäsion abhängigen Zellen, wie C2C12 Myoblasten. </li><li> Schieben Sie DGMP Gele (gespeichert in PBS) in die Vertiefungen der 48-Well-Zellkultur-Platten mit einer sterilen Zellschaber in einer biologischen Sicherheitswerkbank. </li><li> Vorwärmen Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium oder DMEM, ergänzt mit 10% v / v fötalem Rinderserum und 1% v / v 100x Penicillin-Streptomycin-Lösung) und PBS in ein Wasserbad gesetzt bei 37 ° C </li><li> Waschen mit 60% konfluenten Platte (10 mm) von C2C12 Zellen dreimal mit PBS. Absaugen PBS und Ernte Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 2 min. Die Zellen in Wachstumsmedium und Anzahl Zellen. Samen der DGMP Gel enthaltenden Zellkultur gut mit C2C12 Myoblasten (20.000 Zellen / cm 2). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2/95% relative Luftfeuchtigkeit. Gently Tauschmittel nach 4 h, aufpassen, nicht wiederBewegen leicht anhaftenden Zellen. </li><li> Nach 24 Stunden kann die Anbringung von C2C12 Myoblasten auf den RGDS-haltigen Schichten DGMP Gele durch Epifluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskopie (Zeiss Axiovert 200) bestätigt werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen offen zu legen.

DGMP ist eine einfache Strategie zur Vorbereitung vielschichtigen Gele, die nicht auf teure Instrumente angewiesen ist. Dieses Protokoll kann zum Erstellen von Gerüsten mit anderen biokompatiblen Materialien, wie beispielsweise Collagen und Hyaluronsäure angepasst werden. Bioaktiven kleinen Molekülen, zum Beispiel Zell haftvermittelnde RGDS-Peptid, können an die Polymermatrix angebunden werden zur Verhinderung der Vermischung von Stimmungen zwischen den Schichten. Proteine ​​können in getrennten Schichten ohne chemische Konjugation eingekapselt werden, da sie je nach Matrix Maschengröße, weniger anfällig für durch Hydrogele 10 diffundieren können. Hier verwendet Iodixanol (Nycoprep), eine inerte Dichtemodifikationsmittel, die zuvor für lebensfähige Zelle Anwendungen verwendet worden. Andere Dichtemodifizierer wie Saccharose und Dextrose können ebenfalls verwendet werden. Durch Variation der Einschwingzeit (t s), kann man die Feinabstimmung der Schnittstellen zwischen zwei Schichten auf glatten oder scharfe Übergänge zu erzeugen, wie erforderlich ist (längere Einschwingzeit gibt weichere Übergänge) &lt;sup&gt; 10. Zum Beispiel könnte weichere Übergänge zwischen DGMP Gelschichten verwendet, um einen kontinuierlichen Gradienten eines biologischen Cue zu Zelle Prozesse wie Chemotaxis studieren zu erzeugen. Die Wirkung des Gels auf Dichtemodifikationsmittel Steifigkeit ist in 5 für einen 15%-Gel aPEGda gezeigt; eine vollständige Charakterisierung der Steifigkeit und Porosität als Funktion der PEGDA und Iodixanol Konzentrationen wird derzeit untersucht. Während die PEGDA Konzentration in diesem Beispiel ist relativ hoch, beobachteten wir eine 60% größer Elastizitätsmodul in Gelen mit 30% im Vergleich zu Iodixanol Gelen ohne. Die Veränderung der Steifigkeit Gel kann durch Modulation der Konzentration oder Makromer Vernetzungsdichte einstellbar. Wir haben auch die DGMP Technik 3D vielschichtigen Gele mit Polyacrylamid und PEG-Vorstufen 10 zu schaffen angewendet. Variieren der Konzentration oder der Grad der Vernetzung des Prepolymers ermöglicht strukturellen Variation in derGerüste, die zur Zell-Verhalten wie polarisierten Wachstum und Migration in 3D erforschen kann. Zusammenfassend ist DGMP eine anpassungsfähige Technik, die angewendet 2D-und 3D-Gerüste aus einer Vielzahl von biokompatiblen Werkstoffen für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen und Grundlagenforschung fabrizieren lassen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz oder Instrument </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Polyethylenglykol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene Glykoldiacrylat (PEGDA) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Serin (RGDS) </td><td> American Peptide </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropylethylamin (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamid (DMF) </td><td> Fischer </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetrahydrofuran (THF) </td><td> Fischer </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Dialysekassette (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 Carbonsäure succinimydyl Ester </td><td> Life Technologies </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Silikon Abstandshalter </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biopsieausstanzungen </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> Fischer </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-Hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) </td><td> Life Technologies </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Life Technologies </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12 Myoblasten </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

density gradient multilayered polymerisation (dgmp): a novel technique für das erstellen von multi-fach, anpassbare scaffolds für das tissue engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Komplex Gewebekultur Matrizen, in denen Arten und Konzentrationen der biologische Reize (zB Wachstumsfaktoren, Inhibitoren, oder kleinen Molekülen) oder Matrix-Struktur (zB Zusammensetzung, Konzentration oder Steifigkeit der Matrix) variieren über Raum, würde es ermöglichen, eine Vielzahl von Untersuchungen darüber, wie diese Variablen Zelldifferenzierung, Migration und andere Phänomene beeinflussen. Die größte Herausforderung beim Erstellen geschichteten Matrices ist die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Schicht Schnittstellen ohne Diffusion einzelner Komponenten aus jeder Schicht ein. Aktuelle Methoden, dies zu erreichen, zählen Photostrukturierung 2-3, Lithographie 4, sequentielle functionalization5, Gefriertrocknung 6, Mikrofluidik 7 oder Zentrifugation 8, von denen viele erfordern anspruchsvolle Mess-und technischen Fähigkeiten. Andere verlassen sich auf sequentielle Befestigung der einzelnen Schichten, die kann dazu führen, Schichten 9 Delamination </sup&gt;. DGMP überwindet diese Probleme durch die Verwendung eines inerten Dichtemodifikationsmittel wie Iodixanol, um Schichten unterschiedlicher Dichte 10 zu erzeugen. Da das Dichtemodifikationsmittel mit jeder Prepolymer oder bioaktive Molekül vermischt werden können, ermöglicht DGMP jedes Gerüst Schicht angefertigt werden. Einfache Variation der Konzentration des Dichtemodifikationsmittel verhindert eine Vermischung benachbarter Schichten während sie wässrigen bleiben. Anschließende Polymerisation einzigen Schritt führt zu einer strukturell kontinuierlichen mehrschichtigen Gerüst, in der jede Schicht unterschiedlichen chemischen und mechanischen Eigenschaften. Die Dichtemodifizierer können leicht mit ausreichend Spülen ohne Störung der einzelnen Lagen oder deren Bestandteile entfernt werden. Diese Technik ist daher gut für die Erstellung von Hydrogelen in verschiedenen Größen, Formen und Materialien. Ein Protokoll für die Herstellung eines 2D-Polyethylenglykol (PEG)-Gel, in dem alternierende Schichten aufzunehmen RGDS-350, wird im Folgenden erläutert. Wir verwenden PEG beil es ist biokompatibel und inert. RGDS, eine Zelladhäsion Peptid 11 wird verwendet, um räumliche Beschränkung einer biologischen Cue demonstrieren, und die Konjugation von einem Fluorophor (Alexa Fluor 350) ermöglicht es, visuell zu unterscheiden verschiedenen Schichten. Dieses Verfahren kann auch für andere Materialien angepasst werden (z. B. Kollagen, Hyaluronsäure, etc.) und kann um 3D Gele mit einigen Modifikationen 10 herzustellen.

MALDI-TOF-Analyse bestätigt die Konjugation von RGDS-Peptid um Acryloyl-PEG (Abbildung 2). Gel Imaging offenbart alternierenden RGDS-350 (blau) Schichten nach Photopolymerisation (Abbildung 3A). Wie in 3A gezeigt, können 2D DGMP Gelgröße basierend auf dem Durchmesser der Silikonformen (10 mm, links; 8 mm, rechts) variiert werden, und sind daher leicht anpassbar für die Verwendung in mehreren Assays - in diesem Fall um einen passenden 48 well Zellkulturplatte (3B). Epifluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskopie von C2C12 Myoblasten auf einem DGMP Gel kultiviert zeigt selektiver Anbringung auf RGDS-350-enthaltenden PEG Schichten (Abbildung 4), was zeigt, Kompartimentierung der Zelladhäsion Peptid (RGDS). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Molecular Weight Analyse durch MALDI-TOF Vergleich APEG-SCM APEG-RGDS nach Konjugation RGDS Peptid erhalten. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Schematische Darstellung DGMP Gelherstellung. Nachdem die Gradienten geschichtet sind, können sie gestattet, um die verschiedenen Zeiträume (t s) zur abgestuften Schnittstellen, durch Photopolymerisation gefolgt erstellen begleichen. Geschichtete DGMP Gele können leicht aus der Form zur weiteren Verwendung entnommen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. A) 2D vielschichtigen Gelen nach Photopolymerisation erhalten abgebildet mit 350 nm und weißes Licht Kanäle VersaDoc Gel-Dokumentation Einheit. Das Graustufenbild zeigt abwechselnden Schichten mit RGDS in weiß. B) Insertion von DGMP Gel in 48-Well-Zellkulturschalen. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Merged Phasenkontrast und Epifluoreszenz Bild von C2C12 Myoblasten auf DGMP Gele (Maßstab 50 um) gewachsen. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Wirkung von Iodixanol auf Geloberfläche Elastizität. Atomic force microscopy Messungen von statischen Proben von vernetzten PEG Substraten unter Verwendung von bereits etablierten Methoden mit einem 2 nN Kraft Trigger 12. * P &lt;0,05 und ** p &lt;0,01.

Hier beschreiben wir ein einzigartiges Strategie zur Erzeugung biokompatiblen, schichtförmige Matrices mit kontinuierlicher Schnittstellen zwischen unterschiedlichen Schichten für das Tissue Engineering. Ein solches Gerüst könnte eine ideale anpassbare Umgebung zu modulieren Zellverhalten durch verschiedene biologische, chemische oder mechanische Signale

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein mehrschichtiges Zellkulturgerüst zu schaffen. In diesem Video wird gezeigt, wie eine 2D-Zellkulturmatrix hergestellt wird, bei der das Adhäsionspeptid RGDS in abwechselnden Schichten eingebaut wird, um Regionen von C zwei C 12-Zellen zu trennen. Dies wird erreicht, indem zunächst das RGDS-Peptid an ein Acro-loyales Makro gebunden wird.Die Makropeptidkombination wird dann mit dem LOR-Farbstoff markiert, um eine Visualisierung des Peptids zu ermöglichen, das Schichten der mehrschichtigen Gele enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die Formen zu formen, indem sie aus einer Silikonfolie geschnitten und zwischen zwei Glasobjektträgern eingeklemmt werden, wobei die einzelnen Komponenten jeder Schicht gemischt werden. Lösungen von peg di acrl und peg di acrl mit PEG RGDS Alexa three 50 werden abwechselnd innerhalb der Formen geschichtet.Gele werden durch UV-Bestrahlung polymerisiert. Der letzte Schritt besteht darin, C zwei C 12-Zellen auf mehrschichtige 2D-Gele zu säen, um zu untersuchen, wie sich die Matrixzusammensetzung auf das Wachstum und die Anheftung der Zellen auswirkt. Letztendlich werden Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um das selektive Wachstum von C zwei C 12-Zellen auf den Gerüsten sichtbar zu machen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass es sich um eine einfache und kostengünstige Methode zur Erstellung mehrschichtiger 2D- und 3D-Zellkulturmatrizen handelt. Es ist nicht auf den Bedarf an teuren Instrumenten angewiesen. Während die Grenzflächen zwischen den Schichten zusammenhängend und strukturell integral sind.Es gibt keine Vermischung zwischen den Komponenten der einzelnen Schichten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, z. B. wie Zellen als Reaktion auf gemusterte biologische, chemische und mechanische Signale wandern und polarisieren. Diese Methode kann einen sanften Einblick in die Zellmigration und -differenzierung geben und kann auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Steuerung des neuen rechten Wachstums und der Synaptogenese von neuronalen Stammzellen.Um dieses Verfahren zu beginnen, kombinieren Sie RGDS-Peptid und Acro-Öl-Peg-Succinyl-Carbomethylester in einem molaren Verhältnis von ein bis zwei zu eins molar in trockenem DMSO unter Argonnen. Fügen Sie dann NN-Diop, Propylmethylamin oder D-I-P-E-A in einem molaren Verhältnis von zwei zu eins relativ zum Aquilo PEG SCM hinzu, um die Reaktion zu erleichtern, und bestätigen Sie die Konjugation des Aquilo PEG RGDS-Moleküls mit Hilfe der modrigen TOF-Massenspektrometrie. Geben Sie dazu separat einen Mikroliter der AQUILO PEG RGDS-Reaktionslösung und einen Mikroliter nicht reaktives aquilo PEG SCM an verschiedene Stellen auf dem schimmeligen Ziel.Lass beide trocknen. Bereiten Sie dann eine Minute lang eine gesättigte Lösung der universellen schimmeligen Matrix im THF-Wirbel vor und fügen Sie einen Mikroliter zu denselben beiden Stellen hinzu. Lass beide trocknen.Laden Sie als Nächstes die Proben. Führen Sie schimmelige, harte Analysen mit einem 60-Hertz-Laser bei einer Leistung von ca. 19 % durch, indem Sie die Algorithmen SAVIS gole glätten, Top-Hat-Basisliniensubtraktion und OID-Peak-Erkennungsalgorithmen verwenden. Das Molekulargewicht von acro PEG RGDS sollte nach rechts verschoben werden, entsprechend der Massenänderung aufgrund des kovalent gebundenen Peptids.Der nächste Schritt besteht darin, das Fluor zu konjugieren, indem eine äquimolare Menge von LOR hinzugefügt wird, drei 50er Carbonsäure saugt einen Midalester relativ zum Aquilo PEG SCM in einem minimalen Volumen DMSO zu der Aquilo PEG RGDS-Reaktionslösung unter Argon über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Reinigen Sie dann den Acro-Ölstift RGD S3 50, indem Sie mit einer Dialysekassette mit Molekulargewicht von 3.500 DAU gegen Färbewasser bei vier Grad Celsius dialysieren. Setzen Sie den Dialysator 48 Stunden lang mit einem volumetrischen Verhältnis von 1001 fort und tauschen Sie mindestens zweimal täglich kaltes Dialysat aus.Das Produkt wird durch Filtersterilisation durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter weiter gereinigt. Schließlich aliquotieren Sie in einer sterilen Umgebung das steril gereinigte Acro-Ölpeg RGD S3 50 in sterile vorgewichtete Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die offenen Mikrozentrifugenröhrchen mit sterilen Entlüftungsschläuchen.Gefriergetrocknet werden die Proben und mit Paraffinfilm versiegelt bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Die Objektträger in 100 % Methanol vorwaschen und im Ofen bei 80 Grad Celsius trocknen, bis die Flüssigkeit verdampft ist. Stellen Sie dann eine Schale mit den Glasobjektträgern in einen Abzug und fügen Sie 250 Mikroliter Sigma Coat zu jedem Objektträger hinzu.Schütteln Sie die Rutschen 30 Sekunden lang vorsichtig, um die gesamte Oberfläche zu beschichten. Spülen Sie anschließend die beschichteten Objektträger gründlich mit 100 % Methanol ab, gefolgt von Wasch- und destilliertem Wasser, indem Sie sie zweimal fünf Minuten lang in mindestens 10 Millilitern Wasser einweichen. Lassen Sie die Objektträger nach dem Spülen an der Luft trocknen.Bereiten Sie 0,8 Millimeter dicke Silikonräume vor, indem Sie eine Silikonplatte auf die gleichen Abmessungen wie die Objektträger zuschneiden. Bohren Sie dann mit Biopsiestanzen 10 oder acht Millimeter große Löcher in das Silikon, um die Gerüste mit einer Rasierklinge zu halten. Machen Sie etwa zwei Millimeter Kanäle an der Oberseite der Form, um die Zugabe des Gerüstmaterials zu ermöglichen.Autoklavieren Sie dann die Silikonräume und beschichten Sie die mit Sigma beschichteten Objektträger, um sie zu sterilisieren. Sterilisieren Sie auch zusätzliche Materialien zum Gießen der Gele wie Einor-Röhrchen und Pinzetten. In einem Gewebekultur-Haubenfilter wird eine Stammlösung von Peg di aquil mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze und einem 0,2-Mikron-Filter sterilisiert.Beginnen Sie mit der Formulierung von PEG-Präpolymerlösungen mit einem Gewichts-Volumen-Verhältnis von 15 % für jede jeweilige Schicht in einzelnen bernsteinfarbenen Mikroabfallröhrchen, indem Sie das 50 %ige PEG D acrl mit verschiedenen Mengen steriler 60 %IO DAL-Stammlösung PBS und Photoinitiator kombinieren, um unterschiedliche Endkonzentrationen von 10 %, 20 %, 30 % und 40 % I zu erhalten. Mischen Sie die Lösungen gründlich, um die fluoreszenzmarkierte 15 %ige PEG-Präpolymerlösung herzustellen. 50%PEG di aquil und aquilo PEG RGD S3 50 bei einer Endkonzentration von acht Millimolar mit IO Dal Stammlösung PBS und Photoinitiator in bernsteinfarbenen Microview-Röhrchen kombinieren, um Konzentrationen von 15%25% und 35%IO IAL zu erhalten, die Lösungen gründlich mischen. Bauen Sie als Nächstes die vorbereitete Form zusammen, indem Sie einen vorgestanzten Abstandshalter zwischen zwei mit Sigma Co-behandelten Glasobjektträgern platzieren und mit Klammern sichern. Sobald die Form zusammengebaut ist, gießen Sie ein geschichtetes Gel, indem Sie zuerst 10 Mikroliter der 40%igen Lösung hinzufügen, gefolgt von 10 Mikrolitern der fluoreszenzmarkierten 35%igen Lösung.Wiederholen Sie die abwechselnde Schichtung, um mehrere Schichten zu erhalten. Bestrahlen Sie anschließend die Form drei Minuten lang mit 365-Nanometer-Licht. Lassen Sie die polymerisierten Hydrogele mit einer tragbaren UVR 9.000-Lampe fünf Minuten lang aushärten.Entfernen Sie dann die Klammern und heben Sie den oberen Glasschieber und die Form vorsichtig an. Der geschichtete Dichtegradient. Multilaid Polymerisations- oder DG MP Gele verbleiben auf den Objektträgern.Nehmen Sie die Gele vorsichtig mit einem sterilen Spatel aus der Form und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sterilem DMEM. Waschen Sie die polymerisierten Gele 48 Stunden lang mit einem Volumenverhältnis von 1000 zu eins DMEM mit zwei Pufferwechseln pro Tag. Dadurch werden alle Dichte, Modifikatoren, Photoinitiatoren und On-React-Prepolymere entfernt.Lagern Sie dann die DGMP-Gele in DMEM, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin. Um alternierende Schichten sichtbar zu machen, ordnen Sie das DGMP-Gel entlang eines Lineals auf dem Probentablett eines Gel-Dokumentationsgeräts an. Belichten und abbilden Sie dann die Gele mit Alexa: Drei 50 abwechselnd dunkle und blaue Banden im DGMP-Hydrogel zeigen die Bildung diskreter Schichten mit unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung.Um die DGMP-Gele für die Zellkultur vorzubereiten, führen Sie sie vorsichtig in die Vertiefungen einer 48-Well-Zellkulturplatte ein. Verwenden Sie einen sterilen Zellschaber und spülen Sie sie dreimal in Zellkulturmedium aus. Als nächstes ernten Sie C zwei C 12-Myoblasten aus einer 100-Millimeter-Zellkulturplatte, wenn sie zu 60 % konfluent sind.Spülen Sie dazu die Platte dreimal mit vorgewärmtem PBS aus. Fügen Sie dann einen Milliliter 0,25%-Trips in EDTA hinzu und inkubieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie einen Milliliter vorwärmtes Kulturmedium hinzu und geben Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Nachdem die Zellen pelletiert wurden, halten Sie sie in Wachstumsmedium und zählen Sie die lebenden Zellen durch Zugabe von Triamblau und Verwendung eines TC 10-Zellzählers. Besiedeln Sie dann das DG MP-Gerüst mit C, zwei C 12-Myoblasten und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Bestätigen Sie die Bindung von C zwei C 12-Myoblasten auf dem RGDS, das Schichten von DGMP-Gelen enthält, mittels Epi-Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie.Die abwechselnden Schichten der DGMP-Gele können verschiedene Peptide enthalten, wie z. B. das rechts gezeigte RGDS, das die zelluläre Anheftung und das Wachstum unterstützt. Die Schicht auf der linken Seite enthielt jedoch keine zellulären Anheftungspeptide und die Zellen überlebten in dieser Region nicht. IO-Diol kann die Steifigkeit des Gels beeinflussen.Hier wurde der Elastizitätsmodul mittels Rasterkraftmikroskopie gemessen. Bei der Verwendung von 30%IAL in dieser Gelformulierung wurde eine 60%ige Erhöhung der Steifigkeit beobachtet, die Wirkung von IAL auf die Gelsteifigkeit kann je nach den verwendeten Materialien variieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die Reihenfolge der Schichten zu erinnern. Die Schicht mit der höchsten Menge an IEX-NULL befindet sich am unteren Rand, während die Schicht mit der geringsten Menge an IEX-NULL oben angezeigt wird.Denken Sie immer daran, den Fotoinitiator am Ende hinzuzufügen, um eine Polymerisation durch Umgebungslicht zu verhindern. Gemeinsam mit unseren Mitarbeitern passen wir diese Technik an, um das Wachstum von Neuriten in 3D zu organisieren. Dies wird den Vergleich von Neurovorläuferzellen von gesunden Personen und denen von Patienten mit neurologischen Entwicklungsstörungen ermöglichen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht gefährlich sein kann. Tragen Sie eine UV-Schutzbrille, während Sie den Vernetzungsschritt durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nutzung der inhärenten Fähigkeit von Stammzellen zu Stichwort von der sie umgebenden extrazellulären Matrix induziert nehmen und in mehrere Phänotypen zu unterscheiden. Dieses Verfahren erweitert unser Manuskript Beschreibung und Charakterisierung eines Modells unter Verwendung einer zweischichtigen Hydrogel, von PEG-Fibrin und Kollagen zusammen, um gleichzeitig Co-differenzieren Fettgewebe gewonnene...

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Wir beschreiben die Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogelplatten mit einem einfachen Prozess, der in einer freistehenden Form zusammengesetzt und manipuliert werden kann. Unter Verwendung dieser modularen Hydrogel-Platten kann ein einfaches makroskaliertes 3D-Zellkultursystem mit einer kontrollierten zellulären Mikroumgebung erzeugt werden.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

In dieser Arbeit wurden Gerüste aus Poly(milchsäure)/Polyethylenglykol (PLA/PEG) mit einer Kombination aus Schmelzemischen und selektiver Laugung hergestellt. Das hierin diskutierte Verfahren ermöglichte die Entwicklung von dreischichtigen Gerüsten durch hochgradige Kontrolle sowohl der Porosität als auch der Porengröße. Die mechanischen Eigenschaften wurden auch in einer physiologischen Umgebung bewertet.

Ein Facile und umweltfreundliche Weg zu fabrizieren Poly (Milchsäure) Scaffolds mit Graded Porengröße

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Aktuelle Bilayer Kultur Modelle erlauben nicht funktioneller in-vitro- Studien, die in Vivo Mikroumgebungen zu imitieren. Mit Polyethylenglykol und Zinkoxid Template Methode, beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung der eine ultradünne biomimetische Basalmembran mit einstellbaren Steifigkeit, Porosität und biochemische Zusammensetzung, die eng in Vivo imitiert extrazellulären Matrizen.

Ultradünne derzei-elastischen Hydrogele als eine biomimetische Basalmembran für Dual Zellkultur

Mikrogelstäbchen mit komplementären reaktiven Gruppen werden durch Mikrofluidik mit der Fähigkeit hergestellt, sich in wässriger Lösung zu vernetzen. Die anisometrischen Mikrogele klemmen und verbinden sich zu stabilen Konstrukten mit größeren Poren im Vergleich zu sphärischen Systemen. Mit GRGDS-PC modifizierte Mikrogele bilden makroporöse 3D-Konstrukte, die für die Zellkultur verwendet werden können.

Vernetzte makroporöse 3D-Gerüste aus Mikrogelstäben

Erfahren Sie die DGMP-Technik zur Herstellung mehrschichtiger, biokompatibler Zellkultur-Scaffolds für Tissue Engineering. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise Untersuchungen des Zellverhaltens.

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

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