Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein mehrschichtiges Zellkulturgerüst zu schaffen. In diesem Video wird gezeigt, wie eine 2D-Zellkulturmatrix hergestellt wird, bei der das Adhäsionspeptid RGDS in abwechselnden Schichten eingebaut wird, um Regionen von C zwei C 12-Zellen zu trennen. Dies wird erreicht, indem zunächst das RGDS-Peptid an ein Acro-loyales Makro gebunden wird.

Die Makropeptidkombination wird dann mit dem LOR-Farbstoff markiert, um eine Visualisierung des Peptids zu ermöglichen, das Schichten der mehrschichtigen Gele enthält. Der zweite Schritt besteht darin, die Formen zu formen, indem sie aus einer Silikonfolie geschnitten und zwischen zwei Glasobjektträgern eingeklemmt werden, wobei die einzelnen Komponenten jeder Schicht gemischt werden. Lösungen von peg di acrl und peg di acrl mit PEG RGDS Alexa three 50 werden abwechselnd innerhalb der Formen geschichtet.

Gele werden durch UV-Bestrahlung polymerisiert. Der letzte Schritt besteht darin, C zwei C 12-Zellen auf mehrschichtige 2D-Gele zu säen, um zu untersuchen, wie sich die Matrixzusammensetzung auf das Wachstum und die Anheftung der Zellen auswirkt. Letztendlich werden Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um das selektive Wachstum von C zwei C 12-Zellen auf den Gerüsten sichtbar zu machen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass es sich um eine einfache und kostengünstige Methode zur Erstellung mehrschichtiger 2D- und 3D-Zellkulturmatrizen handelt. Es ist nicht auf den Bedarf an teuren Instrumenten angewiesen. Während die Grenzflächen zwischen den Schichten zusammenhängend und strukturell integral sind.

Es gibt keine Vermischung zwischen den Komponenten der einzelnen Schichten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, z. B. wie Zellen als Reaktion auf gemusterte biologische, chemische und mechanische Signale wandern und polarisieren. Diese Methode kann einen sanften Einblick in die Zellmigration und -differenzierung geben und kann auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Steuerung des neuen rechten Wachstums und der Synaptogenese von neuronalen Stammzellen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, kombinieren Sie RGDS-Peptid und Acro-Öl-Peg-Succinyl-Carbomethylester in einem molaren Verhältnis von ein bis zwei zu eins molar in trockenem DMSO unter Argonnen. Fügen Sie dann NN-Diop, Propylmethylamin oder D-I-P-E-A in einem molaren Verhältnis von zwei zu eins relativ zum Aquilo PEG SCM hinzu, um die Reaktion zu erleichtern, und bestätigen Sie die Konjugation des Aquilo PEG RGDS-Moleküls mit Hilfe der modrigen TOF-Massenspektrometrie. Geben Sie dazu separat einen Mikroliter der AQUILO PEG RGDS-Reaktionslösung und einen Mikroliter nicht reaktives aquilo PEG SCM an verschiedene Stellen auf dem schimmeligen Ziel.

Lass beide trocknen. Bereiten Sie dann eine Minute lang eine gesättigte Lösung der universellen schimmeligen Matrix im THF-Wirbel vor und fügen Sie einen Mikroliter zu denselben beiden Stellen hinzu. Lass beide trocknen.

Laden Sie als Nächstes die Proben. Führen Sie schimmelige, harte Analysen mit einem 60-Hertz-Laser bei einer Leistung von ca. 19 % durch, indem Sie die Algorithmen SAVIS gole glätten, Top-Hat-Basisliniensubtraktion und OID-Peak-Erkennungsalgorithmen verwenden. Das Molekulargewicht von acro PEG RGDS sollte nach rechts verschoben werden, entsprechend der Massenänderung aufgrund des kovalent gebundenen Peptids.

Der nächste Schritt besteht darin, das Fluor zu konjugieren, indem eine äquimolare Menge von LOR hinzugefügt wird, drei 50er Carbonsäure saugt einen Midalester relativ zum Aquilo PEG SCM in einem minimalen Volumen DMSO zu der Aquilo PEG RGDS-Reaktionslösung unter Argon über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Reinigen Sie dann den Acro-Ölstift RGD S3 50, indem Sie mit einer Dialysekassette mit Molekulargewicht von 3.500 DAU gegen Färbewasser bei vier Grad Celsius dialysieren. Setzen Sie den Dialysator 48 Stunden lang mit einem volumetrischen Verhältnis von 1001 fort und tauschen Sie mindestens zweimal täglich kaltes Dialysat aus.

Das Produkt wird durch Filtersterilisation durch einen 0,22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter weiter gereinigt. Schließlich aliquotieren Sie in einer sterilen Umgebung das steril gereinigte Acro-Ölpeg RGD S3 50 in sterile vorgewichtete Mikrozentrifugenröhrchen. Verschließen Sie die offenen Mikrozentrifugenröhrchen mit sterilen Entlüftungsschläuchen.

Gefriergetrocknet werden die Proben und mit Paraffinfilm versiegelt bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Die Objektträger in 100 % Methanol vorwaschen und im Ofen bei 80 Grad Celsius trocknen, bis die Flüssigkeit verdampft ist. Stellen Sie dann eine Schale mit den Glasobjektträgern in einen Abzug und fügen Sie 250 Mikroliter Sigma Coat zu jedem Objektträger hinzu.

Schütteln Sie die Rutschen 30 Sekunden lang vorsichtig, um die gesamte Oberfläche zu beschichten. Spülen Sie anschließend die beschichteten Objektträger gründlich mit 100 % Methanol ab, gefolgt von Wasch- und destilliertem Wasser, indem Sie sie zweimal fünf Minuten lang in mindestens 10 Millilitern Wasser einweichen. Lassen Sie die Objektträger nach dem Spülen an der Luft trocknen.

Bereiten Sie 0,8 Millimeter dicke Silikonräume vor, indem Sie eine Silikonplatte auf die gleichen Abmessungen wie die Objektträger zuschneiden. Bohren Sie dann mit Biopsiestanzen 10 oder acht Millimeter große Löcher in das Silikon, um die Gerüste mit einer Rasierklinge zu halten. Machen Sie etwa zwei Millimeter Kanäle an der Oberseite der Form, um die Zugabe des Gerüstmaterials zu ermöglichen.

Autoklavieren Sie dann die Silikonräume und beschichten Sie die mit Sigma beschichteten Objektträger, um sie zu sterilisieren. Sterilisieren Sie auch zusätzliche Materialien zum Gießen der Gele wie Einor-Röhrchen und Pinzetten. In einem Gewebekultur-Haubenfilter wird eine Stammlösung von Peg di aquil mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze und einem 0,2-Mikron-Filter sterilisiert.

Beginnen Sie mit der Formulierung von PEG-Präpolymerlösungen mit einem Gewichts-Volumen-Verhältnis von 15 % für jede jeweilige Schicht in einzelnen bernsteinfarbenen Mikroabfallröhrchen, indem Sie das 50 %ige PEG D acrl mit verschiedenen Mengen steriler 60 %IO DAL-Stammlösung PBS und Photoinitiator kombinieren, um unterschiedliche Endkonzentrationen von 10 %, 20 %, 30 % und 40 % I zu erhalten. Mischen Sie die Lösungen gründlich, um die fluoreszenzmarkierte 15 %ige PEG-Präpolymerlösung herzustellen. 50%PEG di aquil und aquilo PEG RGD S3 50 bei einer Endkonzentration von acht Millimolar mit IO Dal Stammlösung PBS und Photoinitiator in bernsteinfarbenen Microview-Röhrchen kombinieren, um Konzentrationen von 15%25% und 35%IO IAL zu erhalten, die Lösungen gründlich mischen. Bauen Sie als Nächstes die vorbereitete Form zusammen, indem Sie einen vorgestanzten Abstandshalter zwischen zwei mit Sigma Co-behandelten Glasobjektträgern platzieren und mit Klammern sichern. Sobald die Form zusammengebaut ist, gießen Sie ein geschichtetes Gel, indem Sie zuerst 10 Mikroliter der 40%igen Lösung hinzufügen, gefolgt von 10 Mikrolitern der fluoreszenzmarkierten 35%igen Lösung.

Wiederholen Sie die abwechselnde Schichtung, um mehrere Schichten zu erhalten. Bestrahlen Sie anschließend die Form drei Minuten lang mit 365-Nanometer-Licht. Lassen Sie die polymerisierten Hydrogele mit einer tragbaren UVR 9.000-Lampe fünf Minuten lang aushärten.

Entfernen Sie dann die Klammern und heben Sie den oberen Glasschieber und die Form vorsichtig an. Der geschichtete Dichtegradient. Multilaid Polymerisations- oder DG MP Gele verbleiben auf den Objektträgern.

Nehmen Sie die Gele vorsichtig mit einem sterilen Spatel aus der Form und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sterilem DMEM. Waschen Sie die polymerisierten Gele 48 Stunden lang mit einem Volumenverhältnis von 1000 zu eins DMEM mit zwei Pufferwechseln pro Tag. Dadurch werden alle Dichte, Modifikatoren, Photoinitiatoren und On-React-Prepolymere entfernt.

Lagern Sie dann die DGMP-Gele in DMEM, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin. Um alternierende Schichten sichtbar zu machen, ordnen Sie das DGMP-Gel entlang eines Lineals auf dem Probentablett eines Gel-Dokumentationsgeräts an. Belichten und abbilden Sie dann die Gele mit Alexa: Drei 50 abwechselnd dunkle und blaue Banden im DGMP-Hydrogel zeigen die Bildung diskreter Schichten mit unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung.

Um die DGMP-Gele für die Zellkultur vorzubereiten, führen Sie sie vorsichtig in die Vertiefungen einer 48-Well-Zellkulturplatte ein. Verwenden Sie einen sterilen Zellschaber und spülen Sie sie dreimal in Zellkulturmedium aus. Als nächstes ernten Sie C zwei C 12-Myoblasten aus einer 100-Millimeter-Zellkulturplatte, wenn sie zu 60 % konfluent sind.

Spülen Sie dazu die Platte dreimal mit vorgewärmtem PBS aus. Fügen Sie dann einen Milliliter 0,25%-Trips in EDTA hinzu und inkubieren Sie die Platte zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie einen Milliliter vorwärmtes Kulturmedium hinzu und geben Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Nachdem die Zellen pelletiert wurden, halten Sie sie in Wachstumsmedium und zählen Sie die lebenden Zellen durch Zugabe von Triamblau und Verwendung eines TC 10-Zellzählers. Besiedeln Sie dann das DG MP-Gerüst mit C, zwei C 12-Myoblasten und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Bestätigen Sie die Bindung von C zwei C 12-Myoblasten auf dem RGDS, das Schichten von DGMP-Gelen enthält, mittels Epi-Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie.

Die abwechselnden Schichten der DGMP-Gele können verschiedene Peptide enthalten, wie z. B. das rechts gezeigte RGDS, das die zelluläre Anheftung und das Wachstum unterstützt. Die Schicht auf der linken Seite enthielt jedoch keine zellulären Anheftungspeptide und die Zellen überlebten in dieser Region nicht. IO-Diol kann die Steifigkeit des Gels beeinflussen.

Hier wurde der Elastizitätsmodul mittels Rasterkraftmikroskopie gemessen. Bei der Verwendung von 30%IAL in dieser Gelformulierung wurde eine 60%ige Erhöhung der Steifigkeit beobachtet, die Wirkung von IAL auf die Gelsteifigkeit kann je nach den verwendeten Materialien variieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die Reihenfolge der Schichten zu erinnern. Die Schicht mit der höchsten Menge an IEX-NULL befindet sich am unteren Rand, während die Schicht mit der geringsten Menge an IEX-NULL oben angezeigt wird.

Denken Sie immer daran, den Fotoinitiator am Ende hinzuzufügen, um eine Polymerisation durch Umgebungslicht zu verhindern. Gemeinsam mit unseren Mitarbeitern passen wir diese Technik an, um das Wachstum von Neuriten in 3D zu organisieren. Dies wird den Vergleich von Neurovorläuferzellen von gesunden Personen und denen von Patienten mit neurologischen Entwicklungsstörungen ermöglichen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht gefährlich sein kann. Tragen Sie eine UV-Schutzbrille, während Sie den Vernetzungsschritt durchführen.