Name: Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Analyse von Autophagie in Prostata-Tumorzellen mittels 3D-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Autophagosomen und Lysosomen für Krebsforschung.

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Zuschüsse: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Zentrum für Biophotonik Science &amp; Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Bold), das Forschungszentrum Council of Norway, Leiv Eiriksson Reisestipendium 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung erkennt auch die Unterstützung der Gemeinschaft Auburn Cancer Endowment Fund. RJ Bold erkennt auch die Unterstützung der J. McDonald Stiftung. Wir danken Dr. Jenny Wei-Jen Kung und Dr. Bor-wen Wu bei DesigneRx für die großzügige Bereitstellung von ADI.

1. Teil 1: Zellkultur und Immuno-Fluoreszenz-Labeling <ol><li> Wachsen CWR22 Rv1 menschlichen Prostata-Tumorzellen auf Deckgläschen (# 1.5 bzw. 170 um Dicke) in 6-well Platten mit RPMI (Mediatech, VA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Glutamin. </li><li> Induce Autophagie durch Behandlung mit ausgewählten Proben Arginindeiminase (ADI, 0,3 ug / ml) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Fix-Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA, Fisher Scientific, NH) in PBS verdünnt; 100 ul pro Deckglas für 10 min bei RT. </li><li> Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA. </li><li> Durchdringbar Zellen mit 0,05% Saponin (Sigma, MO) in HEPES (HBS) / BSA, 100 ul pro Deckglas 15 min bei RT. </li><li> Vor der Immuno-Kennzeichnung, Block Proben mit 2,5% Casein (Sigma, MO) in HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas für 1 h bei RT. </li><li> Inkubieren fixierten Zellen mit primären Antikörpern in 2,5% Casein / HBS / BSA, 100 ul pro coversl verdünntip, O / N bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA. </li><li> Inkubieren fixierten Zellen mit sekundären Antikörpern in 2,5% Kasein / HBS / BSA, 100 ul pro Deckglas verdünnt, 1 h bei RT. </li><li> Waschen der Zellen 3x mit 1 ml HBS / BSA. </li><li> Montieren vorbereiteten Deckgläser auf reguläre Glas Objektträger mit SlowFade Gold-oder Gold-Verlängern antifade Reagenz (Invitrogen, CA) mit 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI). </li><li> Seal Deckglas Kanten mit Nagellack. Für beste Bildergebnisse, damit sie rechtzeitig (idealerweise O / N) für anti-fade Medien gründlich durchdringen Zellen. </li><li> Saubere Deckglas mit Methanol und / oder Chloroform. </li><li> In Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 bei der Bildgebung bei 37 ° C oder 1,516 bei der Bildgebung bei RT) an die 60X 1,42 NA Objektiv (Olympus, Japan). </li><li> Position gleiten auf der Bühne und schaffen Mikroskop Fokus mit den Zellen von Interesse. </li></ol> 2. Teil 2: Herstellung von Zellen, für Live-Imaging <ol><li> Wachsen CWR22 Rv1 Zellen, die grün fluoreszierendes Protein-gekoppelten Light Chain 3 (LC3-GFP) in RPMI Kulturmedium, enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika auf 35 mm Poly-D-Lysin beschichteten Glasboden Kulturschalen (MatTek, MA). Die Zellen sollten in ausreichender Dichte beschichtet werden, um eine schnelle Verbreitung zu erleichtern, aber nicht so viel, dass die Zellen überwachsen und verklumpt durch die Zeit der Bildgebung sind. </li><li> Gönnen ausgewählt Zellproben mit ADI (0,3 ug / ml) in PBS. </li><li> Etwa 1 Stunde vor der Bildgebung, verdünnte 1,5 ul LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) mit 20 ml RPMI. enthaltend 10% FBS und 1% Antibiotika. Mit Lösungen, die ADI für ausgewählte Proben. Halte alle Medien auf 37 ° C vor der Zugabe in der Kulturschale. </li><li> Inkubieren Zellen mit RPMI mit LysoTracker Red DND-99 für 15-45 min bei 37 ° C </li><li> Etwa 30 min vor der Bildgebung auf der WeatherStation Schutzgehäuse drehen und ermöglichen bis 37 ° C ins Gleichgewicht und 5% CO 2 (mit Humidified Luft). </li><li> Waschen der Zellen mit PBS gewaschen und ersetzen Medien mit Standard-RPMI mit nur 10% FBS und 1% Antibiotika. In ADI um Proben wie angegeben. </li><li> Berg 35 mm Deckglas-bottom Kulturschalen in kundenspezifische Adapter (Applied Precision, Inc., WA), und die Position auf dem Mikroskop Bühne. Verwenden Immersionsöl (Brechungsindex 1,520) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv, und positionieren Sie den montierten Kulturschale auf der Bühne. </li></ol> 3. Teil 3: Dekonvolution Microscopy and Analysis Das Protokoll in diesem Abschnitt wird vorausgesetzt, die Verwendung des DV DeltaVision Persönliche Entfaltung Mikroskop und zugehörigen SoftWorX Application Suite (Applied Precision, Inc., WA). <ol><li> Schalten Sie Mikroskop-System, einschließlich der Akquisitions-Workstation und Instrument-Controller. Öffnen Resolve3D Anwendung das Mikroskop Bühne und wiederum auf der Xenon-Lichtquelle zu initialisieren. Warten Sie 10 min für Lichtquelle, um sich aufzuwärmen und erreichen einen stabilen Bedingungen. </li><li> HinzufügenTropfen Immersionsöl (Brechungsindex 1,520 für lebende Proben, die bei 37 ° C oder 1,516 für feste Proben bei RT) auf der 60X 1,42 NA Objektiv und Zentrum Gewebeprobe (Deckglas nach unten) über die Objektivlinse. </li><li> Entweder mit Hellfeld-oder Außenbeleuchtung und Grobfokus Einstellknopf langsam erhöhen Objektivlinse bis der Wulst Immersionsöl Kontakt mit dem invertierten Deckglas. (Von diesem Punkt die Zellschicht sollten in den Fokus innerhalb von ein paar Windungen der feinen Schärfe einzustellen Knopf kommen). Bei der Arbeit mit festen Proben auf den Objektträgern, ist es empfehlenswert, Zellen innerhalb oder in der Nähe von Gebieten mit Blasen zu vermeiden. Bei der Anzeige mit Live-Proben auf dem Glasboden-Gericht, zu vermeiden Bewegen der Objektivlinse außerhalb der Grenze des Deckglas. </li><li> Autophagosomen kann durch eGFP-Signal (grün) identifiziert werden. Lysosomen sind von LysoTracker Red (live Probe) oder anti-Lamp1 Fluoreszenz-Antikörper (feste Probe) identifiziert. Zellkerne sind durch DAPI st identifiziertaining (feste Probe). </li><li> Wählen Sie die gewünschte Sichtfeld. Im Idealfall sollten die Zellen gut Fluoreszenzsignal in allen geeigneten Kanäle aufweisen und ausreichend befestigt und auf dem Deckglas Oberfläche, so dass die intrazelluläre Inhalte einfach zu visualisieren sind verteilt. Kleine Änderungen in seitlicher x-, y-und z-Ausrichtung kann durch den Computer unter Verwendung des Acquire3D Schnittstelle gesteuert werden. Setzen Binning 1x1 bis 2x2 oder, je nach gewünschter Sichtfeld (mehr Zellen können in das Feld, wenn Binning auf 2x2 gesetzt ist zu sehen). </li><li> Für ein gegebenes Bild durch den Mittelteil einer Zelle, die Belichtung Parameter (zB% Sendeleistung und Belichtungszeit), so dass die maximale Pixelintensität nicht überschreitet 3000 zählt. Im Allgemeinen sollte% Transmission so niedrig wie möglich eingestellt werden, ohne Erhöhung der entsprechenden Belichtungszeit länger als 1 Sekunde. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Fluoreszenz Farbe abgebildet werden und für jeden einzelnen Bereich der Blick auf die Bilder von höchster Qualität zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die upper und unteren Grenzen des Z-Stapel durch Einstellen des Fokus nur geringfügig über die oberen und unteren Ende der Zellprobe sind. Die Gesamtzahl der Bilder in einer bestimmten Z-Stapel wird somit durch diese Grenzwerte und durch den Abstand zwischen den Schichten (: 0,2 um Voreinstellung) bestimmt werden. </li><li> Um Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme zu minimieren, empfehlen wir, die Bildaufnahme-Modus auf &quot;Wellenlänge dann z-Stapel&quot; für feste Proben, und &quot;z-Stapel dann Wellenlänge&quot; für Live-Proben. </li><li> Fluoreszenz-Bilder werden mit entfalteten SoftWorX (Applied Precision, WA) und später unter Verwendung Volocity (Improvision, jetzt Perkin Elmer, MA). </li></ol> 4. Teil 4: Super-Auflösung, Structured-Beleuchtung (OMX) Mikroskopie Das Protokoll in diesem Abschnitt gilt für die Nutzung der OMX Structured Illumination Microscope (Applied Precision, WA). <ol><li> Schalten Sie den Netzschalter aus und gewünschte Laser (410 nm, 488 nm und / oder 532 nm). Warten Sie, bis 20 kmn für die Laser thermisch stabilisiert werden. </li><li> In Immersionsöl (Brechungsindex 1,516 für feste Proben bei RT) auf dem 60X 1,42 NA Objektiv. Wenn Blasen in der Öltropfen zu sehen sind, reinigen Sie das Ziel und Öl wieder. </li><li> Zeigen Probenobjektträger auf der Bühne und bei Bedarf lassen Sie 10 min für Zellen auf Deckglas begleichen. </li><li> Initialisieren die Akquisition Programm. Verwenden Fluoreszenzbeleuchtung um den Fokus einzustellen, bis eine scharfe Kontur der Zelle zu sehen. (Es sollte zu allen Zeiten, um die Exposition von Zellen gegenüber Fluoreszenzanregung zu minimieren, bis die tatsächliche Bildaufnahme). </li><li> Eine Spirale Mosaik Scan kann erworben, um größere Bereiche der Probe Vorschau auf Zellen oder Bereiche von Interesse auszuwählen. Es wird empfohlen, kurze Belichtungszeiten (1-10 ms) und niedrigen Anregungsenergie (0,1-1% Transmission) verwenden, während Abtasten der Probe oder der Suche nach Zielen. </li><li> Identifizieren Autophagosomen von GFP-LC3 Fluoreszenz. Identifizieren Lysosomen von Alexa Fluor 555 anti-LAMP(Lysosom-assoziiertes Membranprotein) und Zellkerne mit DAPI (feste Proben). </li><li> Wählen experimentellen Bedingungen einschließlich Anregungswellenlänge Bildbereich (zB 512x512), Stapeldicke, Belichtungszeit und Laserübertragung Prozentsatz. Für Super aufgelöste Bilder, sicherzustellen, dass die strukturierte Beleuchtung Option aktiviert ist. Für Entfaltung Mikroskopie an der OMX, wählen Sie die Option konventioneller Beleuchtung. </li><li> Für die besten Ergebnisse Rekonstruktion Wählen experimentellen Bedingungen, so dass die maximale Intensität Zahl zwischen 10.000 und 15.000 ist während der Aufnahme. Wenn Bleichen ist ein Anliegen, kann Bildgebung bei einer niedrigeren Exposition (zählt zwischen 5.000 und 10.000) verwendet werden. Idealerweise sollte die Zählungen nicht um mehr als den Faktor zwei über die gesamte Erfassung und verringert sich um mehr als einen Faktor von vier zu vermeiden. Falls erforderlich, reduzieren Sie die Stapeldicke eine nachhaltige Intensität Zählung zu gewährleisten. Die Kamera sättigt mit 64.000 zählt, also maximal inIntensität sollte nie mehr als diese. Für eine gute Proben, fanden wir die experimentellen Bedingungen zu 10 sein ~ 50 ms Belichtungszeit mit 1% Laserübertragung. Helle und photostabil Proben, die immer wieder abgebildet werden können, werden bevorzugt. Eine stabile Fleck für Zeitraffer, super aufgelöste Bilder erforderlich. </li><li> Um das Rauschen, ein 95MHz Auslesegeschwindigkeit (Medium Speed ​​Option) und den Erwerb von 2 ms oder mehr reduzieren wird empfohlen. Erhöhte Artefakte werden in der rekonstruierten abgebildeten, wenn die Probe während der Aufnahme bewegt erhalten. Aufgrund dieser Wirkung werden kurze Belichtungszeiten für nicht haftende oder sich schnell bewegende Zellen empfohlen. </li><li> Mehrkanal-Bildgebung kann gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. Modus Sequential Renditen weniger Übersprechen und wird daher empfohlen. </li><li> Zur Reduzierung Bleichen, ist es im Allgemeinen dem Bild mit mehr Anregungswellenlängen ersten (532 nm, 488 nm, und 410 nm) empfohlen. Für den experimentellen Ergebnissen in Fig. 3 gezeigt, war das Rückwärtsd (dh 48 nm, 532 nm und 410 nm) auf die Photostabilität von diesem bestimmten Probe. </li><li> Stellen Sie den oberen / unteren Grenze des Z-Stapel durch das Mikroskop zu bewegen, bis die Bühne oben / unten der Zellen ist etwas unscharf. Der gewünschte Abstand zwischen jedem Bild sollte konstant gehalten werden, um bei 0,125 für Super-Resolution Imaging, als Rekonstruktion Software nehmen diesen Wert als Standard. </li><li> Rekonstruieren Bildstapeln mit SoftWorX (Applied Precision, WA) und analysieren mit Volocity 6.0 (Perkin Elmer, MA). </li></ol>

<ol><li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li>
<li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li>
<li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li>
<li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li>
<li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2%2FBcl-X%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li>
<li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRAM%2C+a+p53-induced+modulator+of+autophagy%2C+is+critical+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li>
<li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers%3A+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li>
<li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li>
<li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Während die direkte Beobachtung von Zellen mit fluoreszierenden Sonden gegen LC3 beschriftet wird weithin als Standard-Methode, um autophagic Antwort 6, quantitative 3D-Bildgebung des gleichen Systems (wie wir getan haben) bietet beispiellose Informationen und Details über den komplexen Prozess der zellulären Autophagie bestätigen akzeptiert . Insbesondere beobachten wir, dass Hunderte (wenn nicht Tausende) von Autophagosomen in lebenden Zellen innerhalb von 80 min Induktion der Autophagie gebildet werden. Eb...

<table><tbody><tr><td>Arginin Deiminase (ADI)</td><td>DesigneRx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anti-Maus 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anti-Kaninchen 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rot DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lamp1</td><td>DSHB</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cadherin</td><td>Cell Signaling</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Poly-D-Lysin beschichtete Glasbodenplatte</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-1.4-C</td><td></td></tr><tr><td>Nr.1, 22 mm Deckglas</td><td>Corning</td><td>#2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Globe Scientific</td><td>1324G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyse von autophagie mit advanced 3d fluoreszenzmikroskopie

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostatakrebs ist die führende Form von malignen Erkrankungen bei Männern in den USA Während der Operation trägt ein erhebliches Risiko von Impotenz und Inkontinenz, haben traditionelle chemotherapeutische Ansätze weitgehend erfolglos. Hormontherapie ist in einem frühen Stadium wirksam, aber oft nicht mit dem späteren Entwicklung von Hormon-resistentem Tumoren. Wir haben in die Entwicklung von Therapeutika für bestimmte metabolische Mangel von Tumorzellen interessiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Prostata-Tumorzellen spezifisch fehlt ein Enzym (Argininosuccinatsynthase oder ASS) für die Synthese der Aminosäure Arginin 1 beteiligt. Dieser Zustand bewirkt, dass die Tumorzellen abhängig zu werden exogenen Arginin, und sie unterziehen metabolischen Stress, wenn der freie Arginin durch Arginindeiminase (ADI) 1,10 aufgebraucht ist. In der Tat haben wir gezeigt, dass die menschliche Prostata-Krebszellen CWR22 Rv1 effektiv durch ADI mit Caspase-unabhängige Apoptose und aggressive autopha getötetgy (oder Makroautophagie) 1,2,3. Autophagie ist ein evolutionär konservierten Prozess, Zellen zu verstoffwechseln unerwünschte Proteine ​​durch lysosomalen Abbau während Ernährungs Hunger 4,5 ermöglicht. Obwohl die wesentlichen Komponenten dieses Weges gut charakterisierten 6,7,8,9 sind, sind viele Aspekte der molekularen Mechanismus noch unklar - insbesondere, was ist die Rolle der Autophagie in den Tod-Reaktion von Prostata-Krebszellen nach Behandlung ADI ? Um diese Frage zu beantworten, benötigten wir ein experimentelles Verfahren, um das Niveau und den Umfang der autophagic Reaktion in Zellen zu messen - und da es keine bekannten molekularen Markern, die genau verfolgen können diesen Prozess sind, entschieden wir uns für ein bildgebendes Ansatz zu entwickeln, mit quantitative 3D Fluoreszenzmikroskopie 11,12. Mit CWR22Rv1 Zellen mit fluoreszierenden Sonden für Autophagosomen und Lysosomen speziell markierten, zeigen wir, dass 3D-Bild Stapel entweder mit wi erworbendefield Entfaltung Mikroskopie (und später, mit Super-Auflösung, strukturierte Illumination Microscopy) eindeutig erfassen die frühen Phasen der Autophagie Induktion. Mit kommerziell verfügbaren digitalen Bildanalyse, können wir leicht zu bekommen statistische Informationen über Autophagosom und Lysosomen Anzahl, Größe, Verteilung und Grad der Kolokalisation von jedem abgebildeten Zelle. Diese Informationen ermöglichen es uns, genau zu verfolgen den Fortschritt der Autophagie in lebenden Zellen und ermöglicht unseren fortgesetzten Untersuchung in die Rolle der Autophagie in Krebs-Chemotherapie.

Die Bildsequenz in 1 gezeigt sind die körperlichen Veränderungen, die in CWR22-Zellen auftreten, während der ersten 80 min der autophagy Induktion. In dieser und anderen Studien (nicht gezeigt) wir konsequent beobachtet: (1) Verschiebung des Kerns vom Zentrum der Zelle, (2) Reduktion der fokalen Adhäsion Punkte, und (3) allgemeine Translokation Autophagosomen und Lysosomen in Richtung der Mitte des Zelle. Darüber hinaus haben wir auch beobachtet einen leichten Anstieg in Kolokalisation (gelb) zwischen A...

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, quantitative Bilder von behandelten Prostatakarzinomzellen zu erhalten, um das Ausmaß und den Umfang der Autophagie zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit Arginin, Dase oder anderen experimentellen Reagenzien behandelt werden, um die Autophagie und/oder den Zelltod auszulösen. Der zweite Schritt besteht darin, zu entscheiden, ob lebende oder fixierte Zellen abgebildet werden sollen, und die Proben entsprechend vorzubereiten.Als Nächstes gewinnen Sie 3D-Fluoreszenzbilder von lebenden oder fixierten Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Weitfeld, Dekonvolution oder strukturierter Beleuchtung. Der letzte Schritt besteht darin, statistische Daten zur Größenverteilung von Autophagosomen und deren Kolokalisation mit anderen intrazellulären Strukturen zu sammeln. Mithilfe digitaler 3D-Bildanalyse-Software kann dieser Ansatz Ergebnisse liefern, die nicht nur die Induktion von Autophagie durch Argininase und den daraus resultierenden Zelltod von Prostatakarzinomzellen zeigen, sondern auch, dass diese Zellen strukturelle Veränderungen aufweisen, die morphologisch von Veränderungen i

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

In diesem Video demonstrieren wir die auf Arginin-Deiminase basierende Autophagie-Induktion in Prostatakrebszellen. Darüber hinaus kann die fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Veränderungen zu visualisieren, die mit der Autophagie-Induktion verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen und ihrer Fusion zu Autolysosomen.

ADI-basierte Autophagie-Induktion in Prostatakrebszellen: Eine enzymbasierte Technik zur Messung der Autophagiereaktion in Zellen

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

Wir beschreiben unser Protokoll zur Messung biologischer Rhythmen im Proteinkatabolismus über Autophagie und das Proteasom in der Mausleber.

Messung von diurnalen Rhythmen in autophagischen und proteasomalen Flux

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Hier stellen wir die Methodik zur prägnanten Bestimmung des Autophagosomenmarkers LC3-II-Spiegel in extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Immunblotting vor. Die Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs, der Autolysosomenbildung und der Omegasomenbildung deutet auf die neue Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs hin, wenn die Autophagosomen-Lysosomenfusion gehemmt wird.

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie die quantitative Analyse von Autophagie in Prostata-Tumorzellen mittels 3D-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Autophagosomen und Lysosomen für Krebsforschung.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

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