Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, quantitative Bilder von behandelten Prostatatumorzellen zu erhalten, um den Grad und das Ausmaß der Autophagie zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit Arginin, Dase oder anderen experimentellen Reagenzien behandelt werden, um die Autophagie und/oder den Zelltod zu induzieren. Der zweite Schritt besteht darin, zu entscheiden, ob lebende Zellen oder fixierte Zellen abgebildet werden sollen und die Proben entsprechend vorzubereiten.

Als Nächstes erhalten Sie 3D-Fluoreszenzbilder von lebenden oder fixierten Zellen mit Hilfe von Weitfeld-, Dekonvolutions- oder strukturierter Fluoreszenzmikroskopie. Der letzte Schritt besteht darin, statistische Daten über die Größenverteilung der Autophagosomen und die Kolokalisation mit anderen intrazellulären Strukturen zu sammeln. Mit Hilfe einer digitalen 3D-Bildanalysesoftware können mit diesem Ansatz Ergebnisse erzielt werden, die nicht nur zeigen, dass die Autophagen-Induktion durch Arginin-Dase den Zelltod von Prostatatumoren verursachen kann, sondern auch, dass diese Zellen strukturelle Veränderungen aufweisen, die sich morphologisch von Veränderungen unterscheiden, die mit Apoptose und Nekrose verbunden sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen derzeit existierenden Verfahren besteht darin, dass quantitative 3D-Bildgebung zeigen kann, wann und wo ein spezifisches molekulares Ereignis in einer lebenden Zelle auftritt, und es dann in einem dreidimensionalen Format darstellen kann. Um mit dem Wachstum menschlicher Prostatakrebszellen zu beginnen, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, sollten Zellen mit der gekoppelten Lichtkette drei auf 35 Millimeter Poly de Lycin-beschichteten Glasbodenkulturschalen plattiert werden, wie im Textprotokoll beschrieben in ausreichender Dichte, um eine schnelle Proliferation zu ermöglichen, aber nicht so sehr, dass die Zellen zum Zeitpunkt der Bildgebung überwuchert und verklumpt sind. Behandeln Sie ausgewählte Zellproben mit Arginin-Dase oder einer DI in PBS, um die Zellen von freiem Arginin zu erschöpfen und metabolischen Stress in den Krebszellen zu induzieren, etwa eine Stunde vor der Bildgebung: Verdünnen Sie 1,5 Mikroliter Lyo tracker red mit 20 Millilitern RPMI, die 10 % FPS und 1 % Antibiotika enthalten. Bereiten Sie Lösungen mit einem DI für die ausgewählten Proben vor, die nach dem Erwärmen aller Medien auf 37 Grad Celsius behandelt wurden.

Geben Sie das entsprechende Medium in jede Kulturschale und inkubieren Sie Zellen mit RPMI, die LYO Tracker red enthalten, für 15 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, etwa 30 Minuten vor der Bildgebung. Schalten Sie das Umgebungsgehäuse der Wetterstation ein und ermöglichen Sie eine Äquilibrierung auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Waschzellen mit PBS und ersetzen Sie Medien durch Standard-RPMI, die nur 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthalten. Fügen Sie den Proben wie angegeben einen DI hinzu.

Montieren Sie 35 Millimeter Deckglasboden-Kulturschalen in einem kundenspezifischen Adapter. Verwenden Sie Immersionsöl auf dem Objektiv mit sechs DX-Vergrößerungen und 1,42 numerischer Apertur und positionieren Sie die montierte Kulturschale auf dem Mikroskoptisch. In diesem Video wird die 3D-Mikroskopie mit dem Delta Vision Personal IDV-Anwendungspositionsmikroskop, dem Dekonvolutionsmikroskop und der Associated Soft Works Anwendungssuite demonstriert.

Schalten Sie zunächst das Mikroskopsystem ein, einschließlich der Erfassungs-Workstation und der Instrumentensteuerung. Öffnen Sie die Anwendung resolve 3D computer control, um den Mikroskoptisch zu initialisieren und die Xenon-Lichtquelle einzuschalten. Warten Sie 10 Minuten, bis sich die Lichtquelle erwärmt und stabile Bedingungen erreicht hat.

Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die Objektivlinse mit sechsfacher DX-Vergrößerung und numerischer Apertur von 1,42 und zentrieren Sie das Objektträgerexemplar mit dem Deckblatt nach unten über der Objektivlinse, wobei Sie entweder Hellfeld- oder externe Beleuchtung sowie den Grobfokus verwenden. Einstellknopf anheben, die Objektivlinse langsam anheben, bis der Schlag des Immersionsöls das umgedrehte Deckglas berührt. Von diesem Punkt aus sollte die Zellschicht innerhalb weniger Umdrehungen nach dem Feinfokus-Einstellknopf scharf gestellt werden.

Bei der Arbeit mit fixierten Proben auf den Objektträgern wird empfohlen, Zellen innerhalb oder in der Nähe von Bereichen mit Blasen zu vermeiden. Wenn Sie mit lebenden Proben auf der Glasbodenschale betrachten, vermeiden Sie es, die Objektivlinse außerhalb der Begrenzung des Glasabdeckglases zu bewegen. Wählen Sie das gewünschte Sichtfeld aus.

Im Idealfall sollten die Zellen in allen entsprechenden Kanälen ein gutes Fluoreszenzsignal aufweisen und ausreichend an der Deckglasoberfläche befestigt und verteilt sein, so dass der intrazelluläre Inhalt leicht sichtbar ist. Kleine Anpassungen des seitlichen X-, Y- und Z-Fokus können vom Computer über die Acquire 3D-Schnittstelle gesteuert werden. Stellen Sie die Beschneidung auf eins zu eins oder zwei mal zwei ein, je nachdem, welches Sichtfeld für ein bestimmtes Bild durch den mittleren Bereich einer Zelle verwendet werden soll, und stellen Sie die Belichtungsparameter so ein, dass die maximale Pixelintensität 3000 Zählungen nicht überschreitet.

Generell sollte die prozentuale Transmission so niedrig wie möglich angesetzt werden, ohne die entsprechende Exposition zu erhöhen. Zeit über eine Sekunde. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Fluoreszenzfarbe, die abgebildet werden soll, und für jedes einzelne Sichtfeld.

Um Bilder in höchster Qualität zu erhalten, legen Sie die obere und untere Grenze des Zack fest, indem Sie den Fokus nur geringfügig über dem oberen bzw. unteren Rand der Zellprobe einstellen. Die Gesamtzahl der Bilder in einem bestimmten Z-Stapel wird also durch diese Grenzen und durch den Abstand zwischen den Ebenen bestimmt. Um Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme zu minimieren, kann der Bildaufnahmemodus auf Wellenlänge eingestellt werden.

Dann ZS-Stack für feste Samples und ZS-Stack dann Wellenlänge für Live-Samples. Nachdem alle Parameter eingestellt sind, können die Fluoreszenzbilder aufgenommen werden. Fluoreszenzbilder werden dann mit Softworks dezentralisiert und später mit Hilfe der Geschwindigkeit analysiert.

Die hier gezeigte Bildsequenz zeigt die physikalischen Veränderungen, die in cwr 22-Zellen während der ersten 80 Minuten der Autophagie-Induktion auftreten. In diesen Bildern stellt die weiße gepunktete Linie den Umriss der Zelle und der leicht schattierte Bereich die Position des Zellkerns dar. Im Laufe von 80 Minuten zeigen die Bilder eine Verschiebung des Zellkerns weg vom Zellzentrum, eine Verringerung der fokalen Adhäsionspunkte und eine generelle Translokation von Autosomen und Lysosomen in Richtung des Zellzentrums, die hier zu späteren Zeitpunkten grün bzw. rot dargestellt sind.

Eine geringe Zunahme der Kolokalisation wurde auch zwischen Autosomen und Lysosomen beobachtet, was durch die gelbe Farbe angezeigt wird. Die Bildgebungsapplikation velocity Digital wurde dann verwendet, um markierte Autosomen und Lysosomen in den Bildern der CWR 22-Zellen zu identifizieren, zu zählen und statistische Daten zu sammeln. Wie hier gezeigt, variieren die Anzahl und Größe der Autosomen nach ihrer anfänglichen Bildung beim Auftreten mit der Zeit.

Nach 80 Minuten Autophagie-Induktion kam es zu einer allmählichen Abnahme der Anzahl der Autosomen mit einer entsprechenden Zunahme der durchschnittlichen Größe der Autosomen. Darüber hinaus gab es eine messbare Zunahme der Kolokalisation der Autosomen und Lysosomen basierend auf der Korrelationskoeffizientenanalyse von Pearson. Zusammengenommen deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass nach Stimulation der Autophagie zahlreiche kleine Autosomen im Laufe der Zeit zu größeren Autosomen fusionierten.

Hier sehen Sie einen direkten Vergleich von Bildern, die im DV-Modus aufgenommen und rekonstruiert wurden, mit simulierter Weitfeld-Dekonvolution und strukturierter Beleuchtung. Mit dem OMX-Mikroskop wurde die laterale Auflösung auf bis zu 120 Nanometer verbessert, die doppelt so hoch ist wie bei der herkömmlichen beugungsbegrenzten Mikroskopie. Kleinräumige Kolokalisationen von Autosomen und Lysosomen waren mit der hochauflösenden Mikroskopie deutlich sichtbar, während sie mit der konventionellen Fluoreszenzbildgebung kaum sichtbar waren.

Einer der Vorteile der Dekonvolutionsmikroskopie besteht darin, alle Bilder in ein 3D-Modell zu rekonstruieren, das genauere räumliche Informationen zwischen verschiedenen Molekülen liefert. Hier sehen Sie ein Gesamtbild einer Cwr 22 RV-Zelle, die zu einem späteren Zeitpunkt einer Autophagie unterzogen wird, zu einem späteren Zeitpunkt, an dem eine signifikante Kolokalisation zwischen Autosomen und Lysosomen auftritt. Die kohärente Färbung, wie sie in weißer Farbe angedeutet ist, zeigt den Umriss der Zielzelle in diesem Film.

Das 3D-rekonstruierte Modell liefert mehr räumliche Details der Verschmelzung zwischen Autosomen und Lysosomen. Wie in gelber Farbe angedeutet, ist die Wechselwirkung zwischen den Signalen der grünen Lichtkette drei und den roten Lysosomensignalen in Gegenwart der verschmolzenen Signale zur Erzeugung von Gelb offensichtlich. Dieser Ansatz wird also zwei große Herausforderungen für Forscher angehen, die sich mit Autophagie befassen.

Zunächst einmal wollen wir eine stressfreie Umgebung aufrechterhalten, indem wir Mikroflüssigkeit, die Profusionskammer, verwenden, um ihren ursprünglichen physiologischen Zustand auf den Mikroskoptischen zu erhalten. Die zweite Herausforderung besteht darin, statistisch relevante quantitative Bilddaten zu sammeln, und für die fixierten Zellen nehmen wir in der Regel viele Bilder von verschiedenen Zellen und fügen sie zu nützlichen Informationen zusammen. Bei einer lebenden Zelle folgen wir jedoch nur einer Zelle über die Zeit, um gleichwertige Informationen zu erhalten.

Wir glauben also, dass diese Technik es anderen Forschern ermöglichen wird, die Funktion und die Rolle der Autophagie bei verschiedenen Organen und verschiedenen Krankheiten zu untersuchen.