Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, quantitative Bilder von behandelten Prostatakarzinomzellen zu erhalten, um das Ausmaß und den Umfang der Autophagie zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit Arginin, Dase oder anderen experimentellen Reagenzien behandelt werden, um die Autophagie und/oder den Zelltod auszulösen. Der zweite Schritt besteht darin, zu entscheiden, ob lebende oder fixierte Zellen abgebildet werden sollen, und die Proben entsprechend vorzubereiten.

Als Nächstes gewinnen Sie 3D-Fluoreszenzbilder von lebenden oder fixierten Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit Weitfeld, Dekonvolution oder strukturierter Beleuchtung. Der letzte Schritt besteht darin, statistische Daten zur Größenverteilung von Autophagosomen und deren Kolokalisation mit anderen intrazellulären Strukturen zu sammeln. Mithilfe digitaler 3D-Bildanalyse-Software kann dieser Ansatz Ergebnisse liefern, die nicht nur die Induktion von Autophagie durch Argininase und den daraus resultierenden Zelltod von Prostatakarzinomzellen zeigen, sondern auch, dass diese Zellen strukturelle Veränderungen aufweisen, die morphologisch von Veränderungen im Zusammenhang mit Apoptose und Nekrose verschieden sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen derzeit verfügbaren Methoden liegt darin, dass eine quantitative 3D-Bildgebung zeigen kann, wann und wo ein bestimmtes molekulares Ereignis innerhalb einer lebenden Zelle stattfindet, und dieses anschließend in einem dreidimensionalen Format darstellt. Beginnen Sie damit, humane Prostatakarzinomzellen, die grün fluoreszierendes Protein gekoppelt mit Light Chain 3 exprimieren, auf 35-Millimeter-Kulturschalen mit Poly-D-Lysin-beschichteten Glasböden gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll zu kultivieren. Die Zellen sollten mit ausreichender Dichte ausgesät werden, um eine rasche Proliferation zu ermöglichen, jedoch nicht so dicht, dass sie zum Zeitpunkt der Bildgebung überwachsen und verklumpt sind. Behandeln Sie ausgewählte Zellproben etwa eine Stunde vor der Bildgebung mit Arginase oder einem DI in PBS, um die Zellen von freiem Arginin zu befreien und metabolischen Stress in den Krebszellen auszulösen. Verdünnen Sie 1,5 Mikroliter LysoTracker Red mit 20 Millilitern RPMI, das 10 % FPS und 1 % Antibiotika enthält. Bereiten Sie nach dem Aufwärmen aller Medien auf 37 Grad Celsius Lösungen mit einem DI für die ausgewählten Proben vor, die zuvor behandelt wurden.

Fügen Sie das geeignete Medium jedem Kulturgefäß hinzu und inkubieren Sie die Zellen mit RPMI, das LYO Tracker Rot enthält, für 15 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, etwa 30 Minuten vor der Bildaufnahme. Schalten Sie die Umweltkammer der Wetterstation ein und lassen Sie sie auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid einklimatisieren, waschen Sie die Zellen mit PBS und ersetzen Sie das Medium durch Standard-RPMI, das nur 10 % FBS und 1 % Antibiotika enthält. Geben Sie den Proben, wie angegeben, ein DI hinzu.

Montieren Sie 35-mm-Deckglas-Bodenkulturschalen in einem angepassten Adapter. Verwenden Sie Immersionsöl am Objektiv mit sechsfacher DX-Vergrößerung und numerischer Apertur von 1,42, und platzieren Sie die montierte Kulturschale auf dem Mikroskoptisch. In diesem Video wird die 3D-Mikroskopie anhand des Delta-Vision-Personal-IDV-Systems veranschaulicht, das einen positionsangewandten Entfaltungsmikroskop und die dazugehörige Software-Suite von Applied Soft Works verwendet.

Zunächst schalten Sie das Mikroskopsystem eins, einschließlich der Erfassungsarbeitsstation und der Instrumentensteuerung. Öffnen Sie die 3D-Computersteuerungsanwendung von Resolve, um die Mikroskopbühne zu initialisieren und die Xenon-Lichtquelle einzuschalten. Geben Sie der Lichtquelle 10 Minuten Zeit, um sich aufzuwärmen und stabile Bedingungen zu erreichen.

Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv mit 60-facher Vergrößerung und einer numerischen Apertur von 1,42 und zentrieren Sie die Objektträgerprobe mit Deckglas nach unten über dem Objektiv unter Verwendung von Hellfeld- oder externer Beleuchtung sowie dem Grobjustierknopf. Drehen Sie den Knopf langsam, um das Objektiv anzuheben, bis der Tropfen Immersionsöl mit dem umgekehrten Deckglas in Kontakt kommt. Ab diesem Punkt sollte die Zellschicht innerhalb weniger Umdrehungen des Feinjustierknopfs scharf gestellt werden.

Bei der Arbeit mit fixierten Proben auf den Objektträgern wird empfohlen, Zellen innerhalb oder nahe Bereichen mit Blasen zu vermeiden. Bei der Betrachtung lebender Proben in der Glasbodenkulturschale sollte das Objektiv nicht außerhalb der Grenze des Glasobjektträgers bewegt werden. Wählen Sie das gewünschte Sichtfeld aus.

Im Idealfall sollten die Zellen in allen geeigneten Kanälen ein gutes fluoreszierendes Signal aufweisen und ausreichend an der Deckglasoberfläche angeheftet und ausgebreitet sein, sodass die intrazellulären Inhalte leicht sichtbar sind. Feine Einstellungen in lateraler X-, Y- und Z-Fokusebene können über den Computer mithilfe der 3D-Aufnahme-Schnittstelle gesteuert werden. Stellen Sie das Binning auf eins zu eins oder zwei zu zwei ein, abhängig vom gewünschten Bildausschnitt durch den Zellmittelsektor, und setzen Sie die Belichtungsparameter so, dass die maximale Pixelintensität 3000 Zählungen nicht überschreitet.

Im Allgemeinen sollte die Prozent-Transmission so niedrig wie möglich eingestellt werden, ohne die entsprechende Belichtungszeit zu erhöhen. Die Belichtungszeit sollte über einer Sekunde liegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede abzubildende Fluoreszenzfarbe und für jedes einzelne Sichtfeld.

Um Bilder von höchster Qualität zu erhalten, stellen Sie die oberen und unteren Grenzen des Zack ein, indem Sie den Fokus jeweils leicht über der Ober- und Unterseite der Zellprobe ansetzen. Die Gesamtanzahl der Bilder in einem gegebenen Z-Stack wird somit durch diese Grenzen und den Abstand zwischen den Schichten bestimmt. Um Bewegungsartefakte während der Bildaufnahme zu minimieren, kann der Bildaufnahmemodus auf Wellenlänge eingestellt werden.

Dann ZS-Stapel für fixierte Proben und ZS-Stapel gefolgt von Wellenlänge für lebende Proben. Nachdem alle Parameter eingestellt sind, können die Fluoreszenzbilder aufgenommen werden. Die Fluoreszenzbilder werden anschließend mit Soft Works entfaltet und später mit Velocity analysiert.

Die hier gezeigte Bildsequenz zeigt die physikalischen Veränderungen, die in cwr 22-Zellen während der ersten 80 Minuten der Autophagie-Induktion auftreten. In diesen Bildern stellt die weiße gepunktete Linie den Zellumriss dar und der hell schattierte Bereich markiert die Position des Zellkerns. Im Verlauf von 80 Minuten zeigen die Aufnahmen eine Verlagerung des Kerns weg von der Zellmitte, eine Abnahme der fokalen Adhäsionsstellen sowie eine allgemeine Translokation von Autophagosomen und Lysosomen in Richtung Zellzentrum, die hier zu späteren Zeitpunkten jeweils grün und rot dargestellt sind.

Eine geringfügige Zunahme der Kolokalisation wurde ebenfalls zwischen Autosomen und Lysosomen beobachtet, wie durch die gelbe Farbe angezeigt. Die Digital Imaging-Anwendungssuite Velocity wurde anschließend verwendet, um markierte Autosomen und Lysosomen in den Bildern der CWR 22-Zellen zu identifizieren, zu zählen und statistische Daten zu sammeln. Hier gezeigt, variieren die Anzahl und Größe der Autosomen nach ihrer anfänglichen Bildung mit der Zeit.

Nach 80 Minuten der Autophagie-Induktion zeigte sich eine allmähliche Abnahme der Anzahl der Autosome bei gleichzeitigem Anstieg der durchschnittlichen Größe der Autosome. Zusätzlich wurde basierend auf der Analyse des Pearson-Korrelationskoeffizienten eine messbare Zunahme der Kolokalisation von Autosomen und Lysosomen festgestellt. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass nach Stimulation der Autophagie zahlreiche kleine Autosome im Laufe der Zeit fusionieren, um größere Autosome zu bilden.

Hier ist ein direkter Vergleich von Bildern dargestellt, die im DV-Modus, bei simulierter Weitfeld-Dekonvolution und im strukturierten Beleuchtungsmodus aufgenommen und rekonstruiert wurden. Mit dem OMX-Mikroskop wurde die laterale Auflösung bis auf 120 Nanometer verbessert, das ist die doppelte Auflösung herkömmlicher, durch Beugung begrenzter Mikroskopie. Kleinmaßstäbliche Kolokalisation von Autosomen und Lysosomen war mit Super-Auflösungs-Mikroskopie deutlich erkennbar, während sie bei herkömmlicher Fluoreszenzabbildung kaum sichtbar war.

Ein Vorteil der Verwendung der Entfaltungsmikroskopie besteht darin, alle Bilder in ein 3D-Modell zu rekonstruieren, das genauere räumliche Informationen zwischen verschiedenen Molekülen offenbart. Gezeigt ist hier eine Gesamtansicht einer Cwr 22 RV1-Zelle, die zu einem späteren Zeitpunkt Autophagie durchläuft, wobei eine erhebliche Kolokalisation zwischen Autophagosomen und Lysosomen beginnt. Die kohärente Färbung, die in Weiß dargestellt ist, zeigt den Umriss der Zielzelle in diesem Film.

Das 3D-rekonstruierte Modell liefert detailliertere räumliche Informationen über die Fusion zwischen Autosomen und Lysosomen. Wie in Gelb dargestellt, ist die Interaktion zwischen den grünen Signalen der leichten Kette drei und den roten Lysosomensignalen anhand der überlappenden Signale, die Gelb ergeben, deutlich erkennbar. Daher wird dieser Ansatz zwei wesentliche Herausforderungen für Forscher, die Autophagie untersuchen, bewältigen.

Zunächst möchten wir mit Hilfe von Mikrofluidik und der Perfusionskammer auf dem Mikroskop eine stressfreie Umgebung schaffen, um den ursprünglichen physiologischen Zustand der Probe beizubehalten. Die zweite Herausforderung besteht darin, statistisch relevante, quantitative Bilddaten zu sammeln. Bei fixierten Zellen machen wir üblicherweise viele Aufnahmen von verschiedenen Zellen und fassen diese zu aussagekräftigen Informationen zusammen. Bei lebenden Zellen hingegen verfolgen wir lediglich eine einzelne Zelle über die Zeit, um vergleichbare Informationen zu gewinnen.

Daher glauben wir, dass diese Technik es anderen Forschern ermöglichen wird, die Funktion und Rolle der Autophagie in verschiedenen Organen und verschiedenen Krankheiten zu untersuchen.