Name: Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die glomeruläre Permeabilität fluoreszierender Makromoleküle mit 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Filtration in vivo.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Silvia B Campos-Bilderback und George J Rhodes für den Abschluss chirurgische Verfahren, die Platzierung von venösen Zugang Linien danken. Sie möchte auch Sara E Wean für die Aufrechterhaltung der Munich-Wistar Kolonien, bestehend aus den beiden Simonsen und Frömter Stämme danken.

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red) <ol><li> Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C. </li><li> In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek. </li><li> Vortex RSA Lösung auf mittlere und fügen Sie die gelösten TRSC. </li><li> Wrap 50 ml konischen in Folie (Parafilm kann verwendet werden, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten werden gebildet), statt horizontal im Eiskübel w / Eis nur und auf Wippe Lösung langsam rühren (Bildung von Blasen zu vermeiden), erlauben Reaktion bei 0 weiter bis 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Mache 5 L von 0,9% iger Kochsalzlösung, und befeuchten Sie ein 50 kDa Molekulargewicht off Kammer geschnitten, die entweder a) Dialysemembran mit Clips sein kann, b) dialysis-Schlauchmaterial nach einem Schwimmer-a-analysator, oder c) Slide-a-lysator Kassette (alle geeignet für die Entfernung unkonjugierten TRSC). </li><li> Platz Reaktionsmischung im Dialysekammer und Platz in der 5 L Kanister w / der 0,9% iger Kochsalzlösung, Dialyse über Nacht bei 4 ° C mit einem leichtem Rühren mit einem Rührstab. </li><li> Ändern Sie den 5 L Dialysierlösung morgens und am späten Nachmittag bis eine Inkubation über Nacht Ergebnisse in praktisch keiner Farbänderung (Dies dauert in der Regel 48 ~ hr mit mindestens 4 Austausch). Zusätzlich mit der MWCO von 50 kDa, so nah an der MW von RSA, 66 kDa, es ist möglich, niemals eine klare Lösung, dies hängt von der Verteilung der Porengröße der Membran; 60 Stunden und 5 Austausch ist mehr als ausreichend Zeit. </li><li> Measure Volumen und teilen die Einwaage von 100 mg von der Lautstärke auf ungefähre Konzentration von TR-RSA geben, in der Regel Konzentrationen reichen von 10 bis 13 mg / ml. Die endgültige Farbstoff: Albumin-Verhältnis sollte ~ 4:1 1 Fluorophor je 15,00 sein0 Dalton Protein MW. Lagerung bei 4 ° C; NIE frieren die TR-RSA-Lösung, wie sie sich die Fragmentierung, die auftreten können Permeabilitätswerte verändern wird. </li></ol> 2. Vorbereiten des Inverses Mikroskop Bühne Imaging / Microscope Einstellungen <ol><li> Platz ~ 4-7 Stücke Autoklavenband (etwa ¾ &quot;long) perfekt übereinander in einem 50-mm-Schale mit 40 mm Deckglas Boden (Deckglas unteren Schale) gestapelt. Diese sollten näher zu einem der Ränder angeordnet werden, so dass die Rand des Bandes wird mit dem Rand der Krümmung der Niere zu machen, aber nicht blockieren Ziel Lichtweg (1A und 1B), größere Ratten mehr Raum zwischen dem Band und der Rand Schale erfordern. </li><li> Platz 2 Repti-therm Pads neben der Bühne neben dem 50 mm-Schale (Abbildung 1A). Legen Sie eine Erwärmung Wassermantel Decke über der Bühne. </li><li> Maximieren Sie die Effizienz beim Erfassen von Bildern durch die Gewährleistung der Objektivrevolver hat eine 10x Luft or 20x (Luft oder Wasser Immersion) und eine höhere angetriebene Wasserimmersionsobjektiv, um Bilder für die Quantifizierung zu sammeln. </li><li> Bei der Bebilderung der effizienteste Weg, um Wasser zu den Zielen hinzuzufügen ist, um sie zur Seite drehen und Wasser unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit einem langen Stück PE-200 Rohr, das die Spitze der Ziele erreichen kann. </li><li> Stellen Sie die Intensität der Anregung 10watt Laser zu ~ 15-20% mit den Graufilter auf der Software. Die Gallium-Arsenid-Phosphid nichtdescannten Photodetektoren auf 750 eingestellt, um grün-Emissionen und 625 sammeln, um rot-Emissionen zu sammeln. Blau-Emission (wie Nuklearfarbstoff Hoechst 33342) gesammelt unter Verwendung eines Standard-non descanned multialkaline Detektor mit einem Wert zwischen 750-800. </li><li> Um die korrekte Erhebung der geringen Intensität Emissionen innerhalb der Bowman-Raum zu gewährleisten, stellen Sie sicher, die unteren Grenzen der Detektoren so eingestellt sind, wie diese Werte nicht zu auszuschließen. Visuelle Warnung Marker zeigt an, ob die Empfindlichkeitist zu niedrig, und diese Werte werden eine Intensität von Null gegeben. </li><li> Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit ~ 5-8 mg des fluoreszierenden Albumin-Lösung mit 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um das Gesamtvolumen auf 1 cc. </li></ol> 3. Freilegen der Nieren in einer Münchner Wistar Ratte für Intravital 2-Photon Imaging <ol><li> Beginnen Sie mit einem Pre-narkotisierten Ratten mit Pentabarbitol (50 mg / ml Lösung, 120 μl/100 g Körpergewicht), Inactin (130 mg / ml Lösung, 120 μ/100 g Körpergewicht) oder Isofluran (5% Induktion, 1.5 auf 2,5% Wartung), eine innewohnende venösen Zugang Linie (entweder Vena femoralis oder venöse) und die linke Flanke von knapp unterhalb des Brustkorbs bis knapp über den linken Oberschenkel rasiert. </li><li> Legen Sie die Ratte flach auf der rechten Seite, so dass die linke, rasiert Seite nach oben; sicherzustellen, dass es flach auf dem Tisch, mit seiner Haltung länglich und nicht geduckt, mit den Vorderpfoten berühren einander und hinteren Pfoten berühren einander (Abbildung 2A). </li&gt; <li> Sehr vorsichtig abtasten, um die Niere zu bestimmen, wo sie legt natürlich im Retroperitoneum und zeichnen Sie eine gerade Linie parallel zum Körper (vom Brustkorb bis zum Oberschenkel) mit einem Sharpie (2A) fühlen. </li><li> Pick-up die Haut mit einem Paar Hakenpinzette, und nehmen Sie die Haut entlang der gezeichneten Linie mit einem Paar hemostats, um das Gewebe zu vernichten und zu verhindern, Blutungen. Schneiden Sie entlang der Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Zerkleinern der Außenhaut und die Muskelschichten vor dem Schneiden wird drastisch reduziert und in der Regel beseitigt Blutungen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für die äußere Muskelschicht, die dünn ist. </li><li> Für den Einschnitt in das innere Muskelschicht, die das Bauchfell freilegt, re-tasten die Niere zu schätzen. Pinch einen Einschnitt Linie kleiner als der Niere; Sicherstellung der Schnitt ist nur über die Niere. Es ist am besten, um diesen Schnitt zu klein und es bei Bedarf vergrößert. Wenn dies wird zu groß, wird Naht erforderlich.Dieser letzte Schnitt ist kritisch, zu weit in jede Richtung über die Stabilität auf der Bühne beeinflussen und induzieren entweder Bewegungsartefakte von der Atmung (best case-Szenario) oder die Nieren Stiel und negativ die renale Perfusion (worst case scenario) dehnen. </li><li> Suchen Sie die Niere (wie in 2B gezeigt) und Griff die umliegende Fett mit einer Pinzette, arbeiten in Richtung der unteren Pol der Niere in der Hand über Hand-Mode. </li><li> Sobald die unteren Pol der Niere erreicht ist, ziehen die Niere durch den Einschnitt zwar sehr leicht zusammendrücken unterhalb der Niere zu exteriorisieren. Wenn der Schnitt ist zu klein, zerdrücken die Muskelschicht und geschnitten, um es zu erweitern, wiederholen Sie den Vorgang, um Nieren exteriorisieren. </li></ol> 4. Platzieren des München Wistar Ratte auf der Bühne für Imaging <ol><li> Zeigen die Niere zum Rand des Deckglases Schale mit der Niere leicht gedreht in Richtung der dorsalen (Rückseite) der Ratte so der Bauchseite der Niere is in Kontakt mit der unteren Schale Deckglas (Abbildung 1A). Fügen Sie einen erwärmten, sterile 09.% Iger Kochsalzlösung in die Schale. </li><li> Schauen Sie durch den 10x oder 20x-Objektiv und überprüfen Sie die Bewegung. Wenn eine Bewegung erkannt wird, rollen die Ratte über etwas so der Brustkorb ist weit weg von dem Deckglas unteren Schale, sicherzustellen, dass die Niere ist wie an den Rand der Schale zu schließen, ohne Dehnung der renalen Stiel (Abbildung 1B). </li></ol> 5. Aufnehmen von Bildern zu Renal Permeabilität von Albumin Quantify <ol><li> Berechnung der glomerulären Permeabilität (Glomeruluar Siebkoeffizienten; GSC) jeder Makromolekül erfordern unter Bezugnahme Hintergrund Bilder der einzelnen Glomeruli vor der Infusion des fluoreszierenden Moleküls. Wenn Ihr Mikroskop mit einem motorisierten Bühne fähig Kennzeichnung Standorte ausgestattet ist, finden und in der Mitte einzelne Glomeruli mit der unteren angetriebenen Ziel und markieren jeden Standort. Ein Dual-Pass Fluorescein / Rhodamin Epifluoreszenz filter ist ideal für dieses Verfahren zwar entweder Emission Filter funktionieren wird (Phasenkontrast oder andere Nicht-Fluoreszenz-Lichtquellen, wird nicht funktionieren). Glomeruli wird als leere kreisförmige Strukturen von proximalen Tubuli mit einer inhärenten gelb-orange autoflourescence wenn durch die Dual Tiefpassfilter angesehen umgeben erscheinen. </li><li> Wenn Ihr Mikroskop keinen motorisierten Tisch, scannen die Niere in einem Raster-Muster mit der Low-Power-Ziel und eine rudimentäre Karte, wo die einzelnen Glomeruli befinden; sich auf die natürlichen Sehenswürdigkeiten wie große oberflächliche Blutgefäße oberhalb der Nierenkapsel entfernt Fett oder Patches. </li><li> Schalten Sie den Revolver an die höhere Macht Wasserimmersionsobjektiv und nehmen 3D-Datensätze der einzelnen Glomeruli sicherstellen, dass die Kapillarschlingen und Bowman-Raum sind deutlich sichtbar. Mit einem Pseudo-Palette (etwas anderes als B / W) wird dazu beitragen, diese Strukturen zu visualisieren. </li><li> Fokussierung in auf einer oberflächlichen Blutgefäße langsam in t ziehener fluoreszierende Albumin dafür, dass Zeit gegeben wird, um für die systemische Verteilung zu ermöglichen. Bei Substanzen mit niedrigem GSC ist es wichtig, die Intensitätswerte in dem Plasma zu maximieren, jedoch nicht auf ein Niveau, das die Photodetektoren in dem Mikroskop zu erreichen sättigen. Dies erhöht Nachweisbarkeit filtriert Moleküle. Hinweis: Es ist in der Regel ein 5-7 sec Ablauf zwischen dem Zeitpunkt der fluoreszierenden Albumin zur Zeit eingeführt wird, erscheint es auf dem Bildschirm (Erwerb Vollbilder bei ~ 1 Bild / Sekunde). </li><li> Lassen Sie ca. 10 min, um eventuelle kleine Molekulargewicht Fragmente vor dem Erwerb 3D-Volumen bei 1 &amp;mgr; m-Abständen zur Berechnung Albumin GSC verwendet werden löschen. Typischerweise wird die Simonsen Stamm von München Wistarratten weit weniger Oberfläche Glomeruli hat, so dass alle, die visualisiert werden kann abgebildet und quantifiziert werden. Die Frömter Stamm weist eine weitaus größere Zahl, so dass wir die Zahl quantifiziert, um ~ 10 zu begrenzen. </li><li> Am Ende der Studie wurde die Ratte ist über eine Überdosis des anesthet euthanasiertic verwendet in der Studie. Ein Dual pneumothoracotamy wird durchgeführt, um Sterbehilfe zu versichern. </li></ol> 6. Berechnung GSC für Leuchtstofflampen Albumin aus 3D-Volumes <ol><li> Mit Metamorph Bildverarbeitungssoftware laden Sie die 3D-Datensätze für die einzelnen Glomeruli, sowohl die Hintergrund-Set und Set genommen nach der Infusion des fluoreszierenden Albumin. </li><li> In dem Band mit dem fluoreszierenden Albumin suchen eine oberflächliche Capillarschlinge mit genügend Platz leeren Raum zwischen den definierten Rändern und dem Rand der Bowman-Kapsel. </li><li> Im Hintergrund das gleiche Volumen lokalisieren Brennebene, die alle visuellen Hinweisen der eiweißhaltigen Bild enthalten sollte. Wählen Sie eine Region innerhalb des Capillarschlinge von Interesse und beachten Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Weiter wählen Sie eine Region innerhalb der Bowman-Raum und notieren Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Diese werden als Hintergrund-Werte verwendet werden. </li><li> Zur Quantifizierung, wählen Sie das ähnlich Region innerhalb der Bowman-Raum in der Albumin-containing Bild. Tun Sie dies für mindestens zwei anderen Regionen, um einen Durchschnittswert für die durchschnittliche Intensität innerhalb Bowman-Raum zu nehmen. </li><li> Wählen Sie die Capillarschlinge mit dem hellsten Plasma Intensität und zeichnen Sie eine Region um ihn herum. Weiter mit dem Schwellenwert-Funktion, markieren die hellen Werte innerhalb des zirkulierenden Plasma, die Vermeidung der dunkle Streifen, die zirkulierenden RBC werden. Beachten Sie die durchschnittliche Intensität Werte des ausgewählten Plasma Raum. Es ist wichtig, bevorzugt aus den hellen Bereichen des Plasmas, weil Faktoren im Blut nur dazu dient, um zu bewirken, und Unterschätzung der Plasma Fluoreszenz Ebenen. </li><li> Mit einem Microsoft Excel-Tabelle die Werte, um die GSC wo berechnen: </li></ol><img alt="Abbildung 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen: <ol><li> Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilität der Inte...

<table><tbody><tr><td>Olympus Floview 1000 Konfokal-/Multiphotonenmikroskop</td><td>Olympus America</td><td></td><td>Filter für Detektoren: Blau 430/100, Grün 525/50, Rot 605/90</td></tr><tr><td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Abstimmbare Anregungswellenlängen: ~750-1150 nm</td></tr><tr><td>Galliumarsenid-Phosphid-Photodetektoren</td><td>Hamamatsu Corp</td><td></td><td>Hinweis: Front- oder Seitenmontagekonfigurationen verfügbar.</td></tr><tr><td>Metamorph Bildverarbeitungssoftware</td><td>Molekulardynamik</td><td></td><td>Hinweis: Version 6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>2007 Version</td></tr><tr><td>Umgang mit Pinzetten</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>Kat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Präparierschere</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>Kat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA Mikroschere Modell 1C300</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hämostatische Pinzette (gerade)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Wassermantel Decke + Heizkissen</td><td>Gaymar</td><td></td><td>T/Pumpe PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td></tr><tr><td>Repti-Therm Untertankheizung</td><td>ZooMed</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>Texas Rotes Sulfonylchlorid</td><td>Invitrogen / Molekulare Sonden</td><td>Cat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>Rattenserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>Hochwertiges wasserfreies DMF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# 270547</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line Autoklavenband</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Willco-Schale Deckglas Bodenschalen (50 mm/40 mm Deckglas)</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung glomeruläre permeabilität von fluoreszierenden makromoleküle verwendung von 2-photonen-mikroskopie in münchen wistar ratten

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) 1,2, 3. Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt 4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit 5. Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose 6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden 2 angegeben. Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand 3 gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführung von Befe...

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Filtrationseinheit des Nephrons erfolgreich zu visualisieren und die Filtration von fluoreszierenden Makromolekülen über die Filtrationsbarriere in den Harnraum in vivo zu quantifizieren. Dazu wird zunächst der Mikroskoptisch für das lebende Tier vorbereitet. Als nächstes wird die Niere freigelegt und die Ratte auf den Tisch gelegt.Dann werden einzelne Glomeruli identifiziert und kartiert und Hintergrund-3D-Bilder aufgenommen. Zum Schluss wird fluoreszierendes Albumin infundiert. Es werden 3D-Volumina einzelner Glomeruli erfasst und die Permeabilität quantifiziert.Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Filtrationskoeffizienten von Makromolekülen über die Glomeruli in der Niere durch den Einsatz von Intra-Vial-Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil der Zwei-Photonen-Mikroskopie besteht darin, dass sie die gleichzeitige Quantifizierung sowohl der glomerulären Filtration als auch der proximalen tubulären Reabsorption und Transzytose im Tier ermöglicht. Gleichzeitig erstrecken sich die Implikationen der Technik über das Mechanistische hinaus auf diagnostische und therapeutische Aspekte, da es wichtig ist,

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Dieses Video zeigt die Flüssigkeitsaspiration von Mausglomeruli mit der Zwei-Photonen-vermittelten Mikropunktionstechnik. Die Technik ermöglicht den Zugang zu den Glomeruli der lebenden Maus und hilft so, Einblicke in die Nierenphysiologie zu gewinnen.

Flüssigkeitsaspiration aus Maus-Glomeruli: Eine Methode zum Aspirieren von glomerulärer Flüssigkeit aus der Maus mittels Zwei-Photonen-vermittelter Mikropunktur

Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard für die Beurteilung der Nierenfunktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die die Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen unter Verwendung einer einzigen Bolusinjektion Bestimmung Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Inulin in Plasma und Berechnung der GFR durch eine Zwei-Phasen-exponentiellen Modell ermöglicht.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

Die isolierten durchbluteten Lungenpräparat macht es möglich, Mikrogefäßnetzwerken auf der Lungenoberfläche zu visualisieren. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Durchlässigkeit der einzelnen Mikrogefäße in isolierten Lungen quantifizieren mit Echtzeit-Fluoreszenz-Bildgebung.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

Kombination von 2 grundlegenden Techniken der renalen Physiologie präsentieren wir Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie, einer Mikropipette Bowmans Harn Raum bei Mäusen zu platzieren. Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie überwindet kritische Grenzen der konventionellen Mikroskopie für mikropunktion renal Physiology Studien.

Mikropunktion Bowmans Platz bei Mäusen durch die 2-Photonen-Mikroskopie

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) in dem Bewusstsein, frei beweglichen Mäuse mit einem transdermalen GFR Monitor.

Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Prüfung der glomerulären Permeabilität bei Mäusen mit einem hochempfindlichen, nicht radioaktiven Tracer vor. Diese Methode ermöglicht repetitive Urinanalysen mit kleinen Urinvolumina.

Hochempfindliche Messung der Glomerularpermeabilität bei Mäusen mit Fluorescein-Isothiocyanat-Polysukrose 70

Hier präsentieren wir ein Protokoll mit 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Fromter Ratten mit Oberflächenglomeruli, um die Auswirkungen einer verlängerten Harnleiterobstruktion auf die glomeruläre Dynamik und Funktion zu quantifizieren.

Mit der 2-Photonen-Mikroskopie die Auswirkungen einer chronischen einseitigen Harnleiterobstruktion auf glomeruläre Prozesse quantifizieren

Diese Studie stellt eine einfach anzuwendende, vollständige und einfache Reihe von Methoden zur Markierung und Analyse von Glomeruli aus CUBIC-geräumten Mäusenieren vor. Daten wie Glomeruluszahl und -volumen können einfach und zuverlässig mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran, Lichtblattfluoreszenzmikroskopie (LSFM) oder gängiger konfokaler Mikroskopie und Software wie Imaris gewonnen werden.

Eine effiziente und schnelle Methode zur Markierung und Analyse von Mausglomeruli

Erfahren Sie, wie Sie die glomeruläre Permeabilität fluoreszierender Makromoleküle mit 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Filtration in vivo.

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten (Video) | JoVE Journal

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

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