Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Filtrationseinheit des Nephrons erfolgreich zu visualisieren und die Filtration von fluoreszierenden Makromolekülen über die Filtrationsbarriere in den Harnraum in vivo zu quantifizieren. Dazu wird zunächst der Mikroskoptisch für das lebende Tier vorbereitet. Als nächstes wird die Niere freigelegt und die Ratte auf den Tisch gelegt.

Dann werden einzelne Glomeruli identifiziert und kartiert und Hintergrund-3D-Bilder aufgenommen. Zum Schluss wird fluoreszierendes Albumin infundiert. Es werden 3D-Volumina einzelner Glomeruli erfasst und die Permeabilität quantifiziert.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Filtrationskoeffizienten von Makromolekülen über die Glomeruli in der Niere durch den Einsatz von Intra-Vial-Zwei-Photonen-Mikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil der Zwei-Photonen-Mikroskopie besteht darin, dass sie die gleichzeitige Quantifizierung sowohl der glomerulären Filtration als auch der proximalen tubulären Reabsorption und Transzytose im Tier ermöglicht. Gleichzeitig erstrecken sich die Implikationen der Technik über das Mechanistische hinaus auf diagnostische und therapeutische Aspekte, da es wichtig ist, sowohl die Rolle der glomerulären Filtration als auch des proximalen Tubulären zu verstehen.

Die Reabsorption von Albumin ist entscheidend für die Bestimmung der Zielausrichtung der Therapie. Nachdem Sie die Ratte betäubt haben, führen Sie einen venösen Verweilzugang entweder durch die Halsvene oder die Oberschenkelvene ein und rasieren Sie die linke Flanke von knapp unterhalb des Brustkorbs bis knapp über den linken Oberschenkel. Dies ist eine Operation, die nicht überleben kann.

Lege die Ratte flach auf die rechte Seite, so dass die linke rasierte Seite nach oben zeigt. Achte darauf, dass er flach auf der Bank steht, seine Haltung gestreckt hat und nicht in der Hocke sitzt, wobei sich die Vorderpfoten berühren und die Hinterpfoten sich sehr sanft berühren. Palpieren Sie, um die Niere zu fühlen, um festzustellen, wo sie sich von Natur aus innerhalb des Retroperitoneums befindet, und zeichnen Sie mit einem Edding mit einer Zahnzange eine gerade Linie parallel zum Körper.

Nehmen Sie die Haut auf und kneifen Sie die Haut mit einem Paar Hämostaten entlang der gezeichneten Linie zusammen, um das Gewebe zu zerquetschen und Blutungen mit einer chirurgischen Schere zu verhindern. Entlang des Schnittes schneiden. Verwenden Sie das gleiche Verfahren zum Schneiden der äußeren Muskelschicht, die bei Bedarf dünn ist.

Verwenden Sie Hämostatika, um Blutungen für den Schnitt in die innere Muskelschicht zu verhindern, der das Peritoneum freilegt. Palpieren Sie die Niere erneut, um die Größe zu schätzen. Kneifen Sie eine Schnittlinie zusammen, die kleiner als die Niere ist, um sicherzustellen, dass der Schnitt direkt über der Niere liegt.

Es ist am besten, diesen Schnitt zu klein zu machen und ihn bei Bedarf größer zu machen. Lokalisieren Sie die Niere und greifen Sie mit einer Pinzette das umgebende Fett, das sich mit der Hand in Richtung des unteren Pols der Niere bewegt. Sobald der untere Pol der Niere erreicht ist, ziehen Sie die Niere vorsichtig durch den Schnitt, während Sie sehr vorsichtig unter die Niere drücken, um sie nach außen zu drücken.

Wenn der Schnitt zu klein ist, quetschen Sie die Muskelschicht und schneiden Sie, um sie zu erweitern. Wiederholen Sie den Vorgang, um die Niere nach außen zu veräußeren, nachdem Sie die Niere der Ratte nach außen gebracht und die Ratte zur Bildgebung auf den Mikroskoptisch gelegt haben. Wenn Ihr Mikroskop mit einem motorisierten Tisch ausgestattet ist, der in der Lage ist, Positionen zu markieren, indem Sie einen Dual-Pass-Fluoreszeinstab, einen Domine-Filter und ein Objektiv mit geringer Leistung verwenden, suchen und zentrieren Sie einzelne Glomeruli, die als leere kreisförmige Strukturen erscheinen, die von proximalen Tubuli umgeben sind.

Mit einer inhärenten gelb-orangefarbenen Autofluoreszenzmarkierung für jeden Ort können Sie den Turm auf ein Wasserimmersionsobjektiv mit höherer Leistung umschalten und 3D-Datensätze von jedem Glomeruli aufnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Kapillarschlaufen und der Bowman-Raum gut sichtbar sind. Die Verwendung einer Pseudofarbpalette hilft, diese Strukturen zu visualisieren.

Wenn Sie sich dann auf ein oberflächliches Blutgefäß konzentrieren, das langsam mit fluoreszierendem Albumin infundiert wird, um sicherzustellen, dass Zeit für die systemische Verteilung von Molekülen mit einem niedrigen glomerulären cing-Koeffizienten oder GSC vorhanden ist, ist es wichtig, die Intensitätswerte im Plasma zu maximieren, aber nicht Werte zu erreichen, die die Photodetektoren im Mikroskop sättigen. Dies erhöht die Detektierbarkeit der gefilterten Moleküle. Nachdem Sie etwa 10 Minuten gewartet haben, bis sich potenzielle Fragmente mit kleinem Molekulargewicht entfernt haben, erfassen Sie 3D-Volumina in Abständen von einem Mikrometer, die bei der Berechnung von Albumin mit Hilfe der Metamorph-Bildverarbeitungssoftware verwendet werden können. Laden Sie die 3D-Datensätze zusammen mit den Hintergrundbildern für jedes Glomeruli in dem Volumen, das das fluoreszierende Albumin enthält.

Lokalisieren Sie eine oberflächliche Kapillarschlaufe mit genügend Leerraum zwischen den definierten Rändern und dem Rand der Bowman-Kapsel. In der Hintergrundlautstärke. Suchen Sie dieselbe Brennebene, die alle visuellen Hinweise des albuminhaltigen Bildes enthalten sollte.

Wählen Sie einen Bereich innerhalb der interessierenden Kapillarschleife aus und notieren Sie sich den Messwert der durchschnittlichen Intensität. Wählen Sie als Nächstes einen Bereich im Bowman-Bereich aus und notieren Sie sich den durchschnittlichen Intensitätsmesswert. Diese werden als Hintergrundwerte für die Quantifizierung verwendet.

Wählen Sie den ähnlichen Bereich innerhalb des Bowman-Bereichs in dem Albumin aus, das das Bild enthält. Tun Sie dies für mindestens zwei weitere Regionen, um einen Wert für die durchschnittliche Intensität innerhalb des Bowman-Raums zu erhalten. Wählen Sie die Kapillarschleife mit der hellsten Plasmaintensität aus und zeichnen Sie eine Region um sie herum.

Markieren Sie anschließend mit der Schwellenwertfunktion die hellen Werte im zirkulierenden Plasma und vermeiden Sie die dunklen Streifen, die rote Blutkörperchen zirkulieren. Notieren Sie sich die durchschnittlichen Intensitätswerte des ausgewählten Plasmaraums. Es ist wichtig, bevorzugt die hellen Bereiche des Plasmas auszuwählen, da Faktoren im Blut nur zu einer Unterschätzung der Plasmafluoreszenzwerte führen.

Geben Sie die Werte in eine Excel-Tabelle ein, um den GSC zu berechnen, wobei GSC der Differenz des rohen Bogenraums entspricht. Intensität minus Hintergrund Intensität des Bowman-Raums geteilt durch die Differenz der Intensität der Rohkapillarschleife minus der Intensität der Hintergrundkapillarschleife. Die Aufnahme von gefiltertem fluoreszierendem Albumin erfolgt überwiegend im frühen Segment der proximalen Tubuli.

Das S-Eins-Bild zeigt einen Querschnitt durch einen Glomerulus und ein S-Eins-Segment, das von einer Münchner Wistar-Souffleur-Ratte entnommen wurde, etwa 20 Minuten nach der Infusion eines anfänglichen texanischen roten RSA-Bolus. Die Öffnung des Bowman-Raums und die begeisterte Aufnahme des Albumins in Rot ist im Segment S eins zu sehen. Dieses Panel zeigt eine flache 20-Mikron-3D-Projektion desselben Datensatzes, und hier ist eine Projektion mit geringerer Leistung zu sehen, die etwa 60 Minuten nach der Infusion aufgenommen wurde.

Diese Bilder zeigen, dass die Intravitalmikroskopie eine Visualisierung des Verbleibs von infundiertem Material nach der Filtration ermöglichen kann, was bis zu einem gewissen Grad bestätigt, dass der hier beobachtete Filtrationskoeffizient Bilder aus dem Oberflächenglmerulus sind. Dieses Bild ist ein Hintergrundbild und wurde etwa 12 Minuten nach der Infusion von Texas Red Ratte Serumalbumin aufgenommen. Diese beiden Felder sind in Pseudofarbe gezeichnet.

Drei kleine interessante Regionen, die in Bowmans Raum gezeichnet sind, werden verwendet, um die durchschnittliche Intensität von fluoreszierendem Albumin zu berechnen, das sich über die Filtrationsbarriere bewegt hat. Die durchschnittlichen Intensitätswerte für die einzelnen Regionen wurden im hervorgehobenen Bereich innerhalb des Dialogfelds Statistik der Region anzeigen angezeigt. Der GSC-Wert für Albumin von 0,0111, der für diesen individuellen Glomerulus abgeleitet wurde, liegt in diesem Stamm von Münchner Sternratten im gefütterten Zustand innerhalb der Bereichsszene.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. quantitative und qualitative Analysen, an anderen Nierenstrukturen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. den eventuellen Transport des Makromoleküls nach der Filtration in den Harnraum nach seiner Entwicklung. Diese Technik ermöglichte es Forschern in der Nierenphysiologie, dynamische physiologische und pathophysiologische Prozesse nicht nur einmal, sondern im Längsschnitt zu untersuchen. Im Laufe der Zeit war es so.