Name: Chemisch-induzierte Hautkarzinogenese Modell mit Dimethylbenz a Anthracen und 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetat (DMBA-TPA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 12 s
Description: Erfahren Sie das zweistufige Hautkarzinogenese-Modell mit DMBA und TPA zur Untersuchung von Tumorinitiation, Entzündung und Immunantwort bei Plattenepithelkarzinomen.

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Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands (Stipendien 25013080481 und 25013142041 (I.J.), 286377 und 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki und Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), Päivikki and Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finanzierung des Expertenverantwortungsbereichs des Universitätsklinikums Tampere (Zuschuss 9V049 und 9X044 (M.P.), 9X011 und 9V010 (T.J.)), The Competitive State Research Financing of the Expert Responsibility Area of Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), die Finnish Cultural Foundation (M.V.), die Paulo Foundation (T.P.), Die Cancer Society of Finland (M.P.) und die Emil Aaltonen Foundation (T.P.).

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Finnischen Tierschutzkommission (Protokollnummer ESAVI/23659/2018) genehmigt.
1. Versuchstiere, Reagenzien und Ausrüstung
<ol><li>Verwenden Sie Alter und geschlechtsspezifische Mäuse. Beginnen Sie die Studie im Alter von 7-9 Wochen, da die Haut bei den meisten Mäusen in Telogen (der Ruhephase) um dieses Alter2ist.</li>
	<li>Beobachten Sie das Verhalten der Tiere während des Studiums und wenn sie kämpfen, was oft bei Männchen geschieht, beherbergen sie getrennt. Kämpfe können Schnitte in der Haut verursachen, die die Tumorbildung fördern. Weibliche Mäuse werden aufgrund ihres weniger aggressiven Verhaltens bevorzugt. Die typische Versuchsgruppengröße variiert zwischen 8–20 Tieren pro Gruppe24,25,26,27. ANMERKUNG: Leistungsberechnungen auf der Grundlage der biologischen Varianz, die in früheren Studien beobachtet wurde, helfen, eine ausreichend große Gruppengröße zu wählen. Die Stämme, die in diesem Artikel als Beispiele verwendet werden, sind Balb/c und C57BL/6. Allerdings wurden viele andere Mausstämme wie SENCAR und FVB mit dem DMBA-TPA-Modell sowie Wistar und Sprague-Dawley Ratten2,28,29verwendet. Vor Beginn der Studie ist eine Genehmigung des nationalen oder lokalen Ausschusses für Tierarbeit erforderlich. Neben allgemeinen Wohlfahrtserwägungen sind die modellspezifischen Endpunkte typischerweise Plattenepithelkarzinom (SCC) und eine Infektion der Haut. Kratzer in der Haut durch Juckreiz nach anwendung der tumorigenchemischen Chemikalien in Aceton ist typisch, aber ansonsten sollten die Tiere keine Anzeichen von Beschwerden zeigen. Regelmäßiges Wiegen (z.B. 2x pro Monat) hilft, das Wohlergehen der Tiere zu bewerten.</li>
	<li>Verwenden Sie die DMBA und TPA, beide in Aceton verdünnt. Die Arbeitskonzentration von DMBA beträgt 250 g/L. Eine Dosis für ein Tier beträgt 50 g DMBA in 200 l Aceton. Die Lagerkonzentration von TPA beträgt 125 g/L und die Behandlungskonzentration 25 g/l. Eine TPA-Dosis für ein Tier beträgt 5 g in 200 l Aceton. VORSICHT: DMBA ist schädlich, wenn es geschluckt wird und Kann Krebs verursachen. Aceton verdunstet schnell und ist entzündlich. Es kann Schwindel verursachen und die Augen reizen. Verwenden Sie eine Atemmaske und/oder arbeiten Sie unter einem Vakuumstrom. Wechseln Sie die Handschuhe nach dem Umgang mit einer dieser Chemikalien. Individuell belüftete Käfige verhindern die Ausbreitung der Chemikalien während der Unterbringung der Mäuse. Nach dem Auftragen die Pipettenspitzen für den Umgang mit dem DMBA sammeln und als gefährlichen Abfall entsorgen. HINWEIS:Der DMBA muss vor Licht geschützt sein. Das verdünnte TPA wird in -20 °C gelagert, vorzugsweise lichtgeschützt.</li>
	<li>Beschaffen Sie sich folgendes Gerät: eine Waage, ein gewöhnlicher Rasierer für das Fell, Pipetten und Spitzen einer entsprechenden Größe, ein gewöhnliches Lineal, eine Digitalkamera, einen Notizblock und einen Stift oder einen Computer zur Aufnahme der Papillome, ein inhaliertes Anästhesiesystem oder ein Maus-Restrainer mit einer Öffnung auf der Rückseite und einem Kohlendioxid-Narkosesystem zum Opfern von Mäusen.</li>
</ol>2. Haut Papilloma Induktion und Förderung
<ol><li>Rasieren Sie die Rückenhaut und wiegen Sie das Tier. Später rasieren Sie die Haut, wann immer nötig, aber nicht zum Zeitpunkt der chemischen Exposition. HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie sich um die Papillome rasieren und vermeiden Sie Schnitte auf der Haut. Wiegen Sie jedes Tier alle 2 Wochen, um mögliche Gewichtsverlust zu bemerken.</li>
	<li>Mit einer Pipette 48 h nach dem Rasieren des Fells 50 g DMBA in 200 l Aceton topisch auf die rasierte Fläche auftragen. Halten Sie das Tier bei Bedarf mit einer leichten Inhalationsanästhesie oder einem Maus-Restrainer zurück.</li>
	<li>Geben Sie nach 7 Tagen die erste TPA-Dosis. Tragen Sie 5 g TPA in 200 l Aceton topisch mit einer Pipette 2x pro Woche auf, vorzugsweise Montag und Donnerstag oder Dienstag und Freitag.</li>
	<li>Zählen, aufzeichnen und fotografieren Sie die Papillome jede Woche. Eine fühlbare Masse von mehr als 1 mm Durchmesser gilt als Papilloma, wenn sie länger als 1 Woche bleibt. Markieren Sie jedes einzelne Papilloma auf einer Karte und listen Sie seine Größe jede Woche auf. Speichern Sie digitale Fotos.</li>
</ol>3. Tieropfer und Probensammlung
<ol><li>Setzen Sie die Behandlung fort, bis die Tumorreaktion ein Plateau erreicht. Im Allgemeinen wird erwartet, dass die Papillomabelastung 10 bis 20 Wochen nach der Initiation zunimmt, abhängig von der verwendeten Mausdehnung. Das Plateau wird in 15 bis 20 Wochen erwartet. Ein kleiner Teil der Papillome (unter 3%) kann sich innerhalb von 20–50 Wochen zu SCCs entwickeln2.</li>
	<li>Opfern Sie die Tiere 24 h nach der letzten TPA-Anwendung. Verwenden Sie Kohlendioxid-Narkose mit Zervixdislokation oder einer anderen geeigneten Methode.</li>
	<li>Je nach Forschungsfrage, sammeln Sie geeignetes Probenmaterial von den Tieren30,31.<ol>
<li>Nehmen Sie beispielsweise Blutproben vor dem Opfern und trennen Sie das Plasma.</li>
		<li>Schneiden Sie Hautstücke für die Immunhistochemie (IHC) Färbung (z. B. Hämatoxylin und Eosin, vermehrende oder entzündliche Zellen).</li>
		<li>Verwenden Sie Biopsie-Punchs, um Hautstücke mit Papillomagewebe oder Nicht-Papilloma (behandelte) Haut für die Genexpression (z. B. qPCR) und/oder Proteinanalysen (z. B. Western Blot oder ELISA) zu sammeln.</li>
		<li>Sammeln Sie ein Stück der Milz und hautabtropfenden Lymphknoten für die Analyse der Durchflusszytometrie, wenn eine detailliertere Analyse der Immunzellpopulationen gewünscht wird. Sie können auch epidermale und dermale Schichten für weitere Analysen trennen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Statistik
<ol><li>Zeichnen Sie eine Kaplan-Meier-Überlebenskurve der papillomafreien Zeit und verwenden Sie den Mantel-Cox-Log-Rank-Test für das Überleben. Zeichnen Sie eine lineare Kurve der Anzahl der Papillome pro Woche. Da es sich um Zähldaten handelt, verwenden Sie ein nichtlineares Regressionsmodell. Wenden Sie sich bei Bedarf an einen Statistiker.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

DMBA-TPA-induzierter Hautkrebs ist eines der am häufigsten verwendeten Krebsmodelle, da er sehr reproduzierbar ist und Informationen über die Tumorprogression von der Initiation bis zur Malignität liefert. Die wichtigste Ergebnismaßnahme, die Papillomabildung, ist einfach und zuverlässig quantitativ. Das Modell befasst sich sowohl mit der Tumorinitiation (tumorfreies Überleben) als auch mit der Progression (Tumorzahlen und -größen) gleichzeitig. Das Modell eignet sich zur Untersuchung verschiedener Verbindungen, wie z. B...

Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen in der Welt. Daher besteht die Forderung, zuverlässige experimentelle Krankheitsmodelle zu entwickeln, um ein besseres Verständnis der Krankheit zu erhalten und mögliche therapeutische Ansätze zu erforschen. Eines der am häufigsten verwendeten experimentellen In-vivo-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung von Hautkrebs ist das chemisch induzierte zweistufige Hautkarzinogenesemodell1,2. Das Modell bietet ein Werkzeug, um Tumorinitiierung, Förderung und Progression zusätzlich zu bestimmten Ereignissen wie Immunzellinfiltration und Angiogenese zu untersuchen.
Um das zweistufige Hautkarzinogenesemodell zu verwenden, wird die Rückenhaut von Mäusen mit zwei verschiedenen Chemikalien behandelt, die zusammen eine Tumorbildung induzieren. Das Modell wird mit einer niedrigen Dosis der Mutagene, DMBA, gefolgt von einer längeren Exposition gegenüber dem Tumorpromotor, TPA3 (Abbildung 1) initiiert. DMBA mutiert DNA nach dem Zufallsprinzip, indem sie kovalente Addukte mit der DNA von epidermalen Zellen und primären Keratinozytenstammzellen4,5,6,7bildet. Einige dieser zufälligen Mutationen finden in einem Proto-Onkogen statt, wie Hras1 (Mutationen in Kras und Nras werden ebenfalls nachgewiesen) und die Umwandlung von Proto-Onkogenen in Onkogene treibt die Tumorbildung unter richtigen Reizen an. TPA wiederum ist das am häufigsten verwendete tumorwachstumsfördernde Mittel. Sein molekulares Ziel ist die Proteinkinase C (PKC)8. TPA aktiviert auch die Wnt/-Catenin-Signalisierung, die für die Tumorbildung im Modell9entscheidend ist. Wiederholte und längere Exposition gegenüber dem fördernden Mittel führt zu einer verbesserten Zellsignalisierung, erhöhter Produktion von Wachstumsfaktoren und einer lokalen Entzündungsreaktion, die aufgrund einer erhöhten DNA-Synthese und entzündlicher Zellinfiltration in der behandelten Haut offensichtlich sind.
Die wichtigsten Entzündungsmediatoren im DMBA-TPA-Modell wurden identifiziert10. Interleukin-17A (IL-17A) ist im DMBA-TPA Modell11,12als besonders tumorigen bekannt. Es arbeitet in Synergie mit Interleukin 6 (IL-6) und nimmt an Makrophagen und Neutrophilrekrutierung13,14. Darüber hinaus haben sich im DMBA-TPA-Modell gezeigt, dass CD4+ T-Zellen und Neutrophile tumoriogen sind. Schließlich können Makrophagen auch die Tumorgenese im Modell15,16,17fördern.
Während der Promotionsphase wird die Zellproliferation der mutierten Zellen verbessert und eine anhaltende Hyperplasie der Epidermis beibehalten1. Dies führt zu einer Papilloma-Entwicklung in der Haut in 10-20 Wochen, nach dem die Papillome beginnen, in bösartige Tumoren, Plattenepithelkarzinome (SCCs)2umzuwandeln. Allerdings kommen weniger als 10% der Papillome zu maligner Art, obwohl dieser Prozentsatz auch vom genetischen Hintergrund der Mäuse abhängt2,18. Jahrzehntelang war nicht bekannt, welche Art von Zellen zunächst in den Tumoren mutiert wurden, was zu Malignität führte, obwohl einige Studien deutlich ausgeprägte Merkmale in den bösartigen Tumoren im Vergleich zu gutartigen Papillomen19,20berichtet hatten. Neuere Studien haben jedoch unser Verständnis über den klonalen Ursprung der Tumorbildung im DMBA-TPA-Modell21starkverbessert. 22. 23. Es wurde nachgewiesen, dass sowohl knochenmarkabgeleitete Epithelzellen als auch Haarfollikelstammzellen zur Tumorbildung beitragen22. Stufenspezifische Linienverfolgungsstudien haben enthüllt, dass gutartige Papillome monoklonalen Ursprungs sind, aber sie rekrutieren neue Epithelzellpopulationen21,23. Allerdings fungiert nur einer der Zellklone als Fahrer für die Karzinogenese; es enthält eine Hras-Mutation23. Der Verlauf der Karzinombildung ist mit einem klonalen Sweepverbunden 23.
Das karzinogene DMBA initiiert die Papillomabildung und TPA fördert das Tumorwachstum. Daher kann die Tumorinitiation getrennt von der Förderung untersucht werden, indem das Experiment vor der TPA-Behandlungsphase unterbrochen wird. Da die Tumorprogression wöchentlich untersucht wird, bietet es eine große Chance für eine detaillierte Tumorwachstumsanalyse während der gesamten Studie. Da die Tumoren durch externe Chemikalien erzeugt werden, ist eine onkogene Mutation in der Keimbahn unnötig. Daher ist die Untersuchung der Auswirkungen eines genetischen Hintergrunds (z.B. Knockout/Transgen vs. Wildtyp) auf die Tumorgenese einfach2. Zusammenfassend ist das DMBA/TPA-Hautkrebsmodell ein besonders nützlicher Ansatz zur Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Tumorprogression sowie zur Bewertung von Tumorinitiations- und Förderschritten unabhängig oder voneinander abhängig.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60445/60445fig1a.jpg"> Abbildung 1: DMBA-TPA-induzierte Hautkarzinogenese Modell umriss. Das karzinogene DMBA wird topisch angewendet, um DNA-Mutationen in der Initiationsphase des Modells zu induzieren. Das wachstumsfördernde Mittel TPA wird 2x pro Woche verabreicht, um die Zellproliferation während der Promotionsphase zu verbessern, was zur Entwicklung von Papillomen in der Haut führt. Tiere werden geopfert, nachdem die Papilloma-Reaktion ein Plateau erreicht hat, in der Regel innerhalb von Wochen 15–20, abhängig vom genetischen Hintergrund der Mäuse. Ein kleiner Teil der Papillome kann sich innerhalb von 20 bis 50 Wochen zu SCCs weiterentwickeln. Um frühe Ereignisse in der Initiations- und Frühförderungsphase zu untersuchen, können Proben entnommen werden (z. B. kurz nach der zweiten TPA-Anwendung). Ein repräsentatives Foto und Hämatoxylin und Eosin gebeizten Querschnitt von Papillomen auf einer C57BL/6 Maushaut nach 19 Wochen Behandlung werden gezeigt. Maßstabsleiste = 0,1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60445/60445fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>1000 ul RPT XL Verlaufsfilterspitze (steril), Nachfüllung</td><td>Starlab</td><td>S1182-1730-C</td><td></td></tr><tr><td>300 ul RTP Verlaufsfilterspitze (steril), Nachfüllung</td><td>Starlab</td><td>S1180-9710-C</td><td></td></tr><tr><td>7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA)</td><td>Sigma</td><td>D3254-100MG</td><td>Gesundheitsschädlich beim Verschlucken und kann Krebs verursachen. Lichtgeschützt lagern.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>1000141011</td><td>Verdunstet schnell und ist brennbar.</td></tr><tr><td>Attane vet 1000 mg/g</td><td>Piramal Critical Care Limited</td><td></td><td>Flüssiges Isofluran zur Inhalation</td></tr><tr><td>Batteriebetriebener Clipper Isis</td><td>Albert Kerlb GmbH</td><td>GT421</td><td>Zum Rasieren des Fells</td></tr><tr><td>CONTRAfluran-Restgasfilter</td><td>ZeoSys GmbH</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Linex Nature N1030 Lineal 30 cm</td><td>Staples Business Advantage</td><td>60383</td><td>Zum Messen von</td></tr> <tr><td>PapillomenMedium CO2 Kammer 300 x 200 x 200mm - Rot</td><td>VetTech Solutions Ltd</td><td>AN045AR</td><td>Zum Opfer</td></tr><tr><td>Mekasoft</td><td>Mekalasi</td><td>23008</td><td>Tischabdeckung</td></tr><tr><td>Mäuse (Balb/c JRj)</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>Andere Stämme auch möglich</td></tr><tr><td>Mäuse (C57BL/6JRj)</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>Andere Stämme auch möglich</td></tr><tr><td>Panasonic Lumix DMC-FS5 Digitalkamera</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td>Für Histologieproben</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)</td><td>Enzo</td><td>BML-PE160-0001</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswaage PLJ-C/PLJ-G</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>PLJ 600-3CM</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Gehäuse</td><td>VetTech Solutions Ltd</td><td>AN044BX</td><td>Für</td></tr><tr><td>Opfer-RNAlater</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Für Nukleinsäureproben</td></tr><tr><td>Tacta-Pipette 100-1000 ul</td><td>Sartorius</td><td>LH-729070</td><td></td></tr><tr><td>Tacta-Pipette 20-200 ul</td><td>Sartorius</td><td>LH-729060</td><td></td></tr><tr><td>UNO Anaesthetic Key Filler</td><td>Scintica Instrumentation Inc.</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>UNO Gesichtsmaske für Maus</td><td>Scintica Instrumentation Inc.</td><td></td><td>Für Anästhesie</td></tr><tr><td>UNO FM2200 Durchflussmesser</td><td>Scintica Instrumentation Inc.</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>UNO Gas Exhaust Unit</td><td>Scintica Instrumentation Inc.</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>UNO Induction Box</td><td>Scintica Instrumentation Inc.</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr><tr><td>UNO200VAP Vaporizer</td><td>Scintica Instrumentation Inc.</td><td></td><td>Für die Anästhesie</td></tr></tbody></table>

chemisch-induzierte hautkarzinogenese modell mit dimethylbenz[a]anthracen und 12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (dmba-tpa)

Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Krebs ist eine der verheerendsten menschlichen Krankheiten. Experimentelle Krebsmodelle sind wichtig, um Einblicke in das komplexe Zusammenspiel verschiedener Zelltypen und Gene bei der Förderung der Tumorprogression zu gewinnen und eine Plattform zu bieten, um die Wirksamkeit verschiedener therapeutischer Ansätze zu testen. Eines der am häufigsten verwendeten experimentellen entzündlichen Krebsmodelle ist das zweistufige Modell der zweistufigen Hautkarzinogenese DMBA-TPA. Die Tumorbildung wird in diesem Modell durch die topische Anwendung von zwei verschiedenen Chemikalien induziert, 7,12-Dimethylbenz[a]anthracen (DMBA) und 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA), die zusammen eine Papillomabildung in der Haut verursachen. Da das primäre Ergebnis die Papillomabildung in der Haut ist, ist das Modell eine ideale, zuverlässige und reproduzierbare Möglichkeit, sowohl die Tumorinitiierung (tumorfreies Überleben) als auch die Tumorprogression (Anzahl und Größe der sichtbaren Tumoren) anzugehen. Die Wirkung der DMBA-TPA-Behandlung wird über einen Entzündungsmechanismus übertragen, wodurch sich dieses Modell besonders für die Untersuchung der Rolle des Immunsystems bei der Tumorbildung eignet. Dieses Modell ist jedoch auf die Haut und andere Oberflächen beschränkt, auf denen die Chemikalien aufgetragen werden können. In diesem Artikel finden Sie ein detailliertes Protokoll, um das Modell erfolgreich zu verwenden.

Das Hauptergebnis ist das Überleben (d.h. Papilloma frei) Zeit zwischen der Behandlung oder Genotyp-Gruppen. Das sekundäre Ergebnis ist die Anzahl der Papillome pro Woche in jeder Gruppe (Abbildung 2). Die erwarteten Ergebnisse sind ein statistisch signifikanter Unterschied in der Papilloma-Freizeit und in der Anzahl der Papillome zwischen den experimentellen (zwei oder mehr) Gruppen. Es wird empfohlen, die Anzahl der Papillome zu zählen und während der Promotion-Phase (TPA) eine Kurve zu ze...

Die zweistufige Hautkarzinogenese wird durch zwei topisch aufgetragene Chemikalien induziert. Ein Mutagen7,12-Dimethylbenz[a]anthracen) verursacht Mutationen in den epidermalen Zellen und eine kontinuierliche Anwendung des allgemeinen Wachstumsstimulators 12-O-Tetradecanoyl phorbol-13-Acetat beschleunigt die Bildung von Hautpapilloma.

Chemisch-induzierte Hautkarzinogenese Modell mit Dimethylbenz[a]Anthracen und 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetat (DMBA-TPA)

Cancer is one of the most devastating human diseases. Experimental cancer models are important to gain insight into the complex interplay of different ...

Dieses zweistufige Hautkrebsmodell ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Entzündungen bei Hautkrebs und ermöglicht die Untersuchung der Tumorinitiation als separater Prozess von der Tumorprogression. Die Tumorbildung in diesem Modell ist chemisch induziert und ermöglicht die Verwendung von Knockout-Stämmen, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren oder therapeutischen Kandidaten zu untersuchen. Das Modell eignet sich gut für die Untersuchung der Rolle des Immunsystems und der Angiogenese bei Krebs.Es zeigt eine ähnliche Krankheitspathologie wie Plattenepithelkarzinom bei menschlichen Patienten. Obwohl diese Methode relativ einfach durchzuführen ist, ist ein genaues Timing unerlässlich. Es ist auch wichtig, geeignete Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen, wenn Sie mit DMBA umgehen, das ein karzinogenes ist.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, beherbergen Sie alle aggressiven sieben bis neun Wochen alten Mäuse in separaten Käfigen, um Kämpfe und Hautläsionen zu vermeiden. Für die Haut-Papilloma-Induktion, rasieren Sie zuerst die Rückenhäute der Versuchstiere und wiegen Sie die Mäuse einzeln. 48 Stunden nach der Rasur, verwenden Sie eine Pipette, um 50 Mikrogramm DMBA in 200 Mikroliter Aceton auf den rasierten Bereich jeder anästhesierten Maus aufzutragen.Zur Förderung des Hautpapillomas, sieben Tage nach der DMBA-Anwendung behandeln Sie die Haut mit fünf Mikrogramm TPA in 200 Mikroliter Aceton zweimal pro Woche bis zum Ende des Experiments. Untersuchen Sie die Tiere auf Papillome und fotografieren und erfassen Sie jede Woche die Größe jedes einzelnen Papillomas auf einer Karte. Eine fühlbare Masse von mehr als einem Millimeter Durchmesser gilt als Papilloma, wenn sie länger als eine Woche bleibt.Wenn die Tumorreaktion ein Plateau erreicht, ernten Sie das entsprechende Probenmaterial von den Tieren 24 Stunden nach der letzten TPA-Anwendung und sammeln Sie die Haut stücke mit voller Dicke für die immunhistochemische Analyse. Verwenden Sie einen Biopsie-Punch, um Hautstücke aus Papilloma- und Non-Papilloma-Hautproben für die Genexpression und Protein-Anaylsen zu sammeln und mit einem Skalpell Stücke aus Papilloma und Nicht-Papilloma-Haut für die immunhistochemische Analyse zu sammeln. Dann sammeln Sie die Haut entwässernden Lymphknoten und ein Stück der Milz für die Strömung zytometrische Analyse wie gewünscht.Ein statistisch signifikanter Unterschied in der Papilloma-Freizeit und in der Anzahl der Papillome zwischen den experimentellen Gruppen wird typischerweise im DMBA TPA-Tumormodell beobachtet. Histologische Analysen eignen sich zur Untersuchung der Struktur der Papillome, der Morphologie der Haut oder der Infiltration von Immunzellen von Interesse. Es ist wichtig, die DMBA und TPA gleichmäßig auf die Haut aufzutragen und TPA in konsistenten Intervallen aufzutragen.Es ist auch wichtig, die Papillome regelmäßig zu zählen. Die Mechanismen, die die Anzahl und Die Zeit der Tumorbildung beeinflussen, können mit verschiedenen Methoden untersucht werden, einschließlich Immunhistochemie, Durchflusszytometrie, quantitative PCR und Proteinanalyse. Diese konventionelle Technik kann leicht angepasst und angewendet werden, um die Auswirkungen verschiedener Gene, Umweltfaktoren oder Heilmittel von Interesse auf die Tumorinitiierung und -progression zu untersuchen.Bei der Ausführung der Technik ist Vorsicht geboten, da DMBA krebserregend ist und Aceton schnell verdunstet. Eine geeignete Atemmaske und die Verwendung des Durchflussschranks werden empfohlen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir demonstrieren ein Protokoll, bei dem Verabreichung des genotoxischen Agens Azoxymethan (AOM) durch drei Zyklen des pro-entzündliches Mittel Dextransulfat-Natrium (DSS) rasch und konsequent befolgt erzeugt Dickdarmtumoren in Mäusen mit morphologischen und molekularen Ähnlichkeiten mit den in menschlichen ulcerosa angesehen -assoziierten Krebserkrankungen.

Modeling Colitis-assoziierten Krebs mit Azoxymethan (AOM) und Dextransulfat Natrium (DSS)

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. In diesem Protokollvideo wird eine PDT-basierte Methode verwendet, um das phototoxische Potenzial eines potenziellen Photosensibilisators in Lungenkrebszellen zu bewerten.

In vitro Phototoxizitäts-Assay: Eine PDT-basierte Methode zur Bewertung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators in Lungenkrebszellen

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Induktion einer zweistufigen Hautkarzinogenese, um die Tumorinitiierung durch topische Anwendung von Chemikalien zu untersuchen. Im ersten Schritt wird ein Mutagen, DMBA, auf die Haut eines Mausmodells aufgetragen, das die Tumorbildung einleitet, indem es Mutationen in den Stammzellen verursacht, gefolgt von der Anwendung eines Wachstumsstimulators, TPA, der die Bildung von Hautpapillomen beschleunigt.

Chemisch induziertes zweistufiges Modell der Hautkarzinogenese: Ein experimentelles In vivo Mausmodell für Hautkrebs

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Messung der UV-Empfindlichkeit in einem humanisierten Mausmodell – einem Mausmodell, das die menschliche Haut nachahmt. Wir bestimmen die minimale erythematöse Dosis (MED) der UV-Strahlung, die Erytheme oder Ödeme auf der Haut verursachen kann. Die Methode kann helfen, die Wirksamkeit von Medikamenten herauszufinden, die zur Verringerung der UV-Empfindlichkeit eingesetzt werden.

Minimaler erythematöser Dosis-Assay: Eine Methode zur Messung der UV-Empfindlichkeit in Mausmodellen

Die Karzinogenese ist ein Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Krebs Mikroumgebung. Um die molekularen Ereignisse sezieren, muss man verschiedenen Zellpopulationen in verschiedenen Stadien während der Entwicklung von Krebs zu isolieren. Mit einem Maus-Modell für Basalzellkarzinom, beschreiben wir ein Protokoll für die Zell-Analysen bei der Krebsentstehung.

Handy Bevölkerung Analysen Während Hautcarcinogenese

Epidermal Melanin wird durch die topische Anwendung von Forskolin in einem murinen Modell der hellhäutigen UV-empfindliche Menschen verursachte. Pharmakologische Manipulation von cAMP-Konzentrationen in der Haut und Epidermis stark verdunkelt Schutz gegen UV-vermittelte Entzündungen (Sonnenbrand), wie durch die minimale erythematöse Dosis (MED)-Assay gemessen.

Pharmakologische Induktion der epidermalen Melanin und Schutz vor Sonnenbrand in einem humanisierten Mausmodell

Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.

Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die vorübergehende In-vivo-Produktion von nicht-letalen Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen zu induzieren und so die physiologischen Reaktionen im Gewebe weiter zu fördern.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung vorzeitiger Alterung bei HNM mittels tBHP, standardisierte Protokolle zur Analyse wichtiger Senezenzmarker, einschließlich Wachstumsstillstand, SA-β-Galaktosidase-Aktivität und SASP-Faktoren.

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz in primären menschlichen Melanozyten mittels Tert-Butylhydroperoxid

Erfahren Sie das zweistufige Hautkarzinogenese-Modell mit DMBA und TPA zur Untersuchung von Tumorinitiation, Entzündung und Immunantwort bei Plattenepithelkarzinomen.

Chemisch-induzierte Hautkarzinogenese Modell mit Dimethylbenz[a]Anthracen und 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetat (DMBA-TPA)

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