Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Dieses Protokoll kombiniert die optische Multiplex-Bildgebungsmethode, IBEX und Click-iT EDU-Markierung, um sich teilende Zelltypen in hochdynamischen Prozessen, wie z. B. der Hautreparatur, zu erkennen und zu kategorisieren. Darüber hinaus bieten wir eine neuartige Open-Source-Pipeline für die Bildverarbeitung und -analyse mit hohem Durchsatz an. Bestreichen Sie die 24-Well-Platte mit 200 Mikrolitern Chrom-Aluminiumgelatine und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang auf einem Wippschüttler.

Entfernen Sie dann die Gelatine vollständig und trocknen Sie die beschichteten Vertiefungen 60 Minuten lang in einem 40-Grad-Ofen. Schneiden Sie das in OCT eingebettete Gewebe in einer Dicke von 15 bis 30 Mikrometern am Kryostaten und überführen Sie es schnell in eine beschichtete Vertiefung mit zwei Millilitern PBS. Entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette und zielen Sie darauf ab, den Gewebeschnitt zentriert in der Vertiefung zu halten.

Um dies effektiv zu tun, saugen Sie das PBS langsam von den Rändern der Vertiefung ab und passen Sie die Pipettenposition nach Bedarf an, um eine Verschiebung des Gewebes zu verhindern. Trocknen Sie die Gewebeschnitte eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen. Rehydrieren Sie fünf Minuten lang mit einem Milliliter PBS.

Permeabilisieren Sie das Gewebe mit 500 Mikrolitern 0,5% Triton für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Tuch zweimal kurz mit PBS und führen Sie die Click-iT-Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durch. Bewahren Sie die Proben lichtgeschützt auf.

Waschen Sie das Tuch zweimal kurz mit PBS. Eine Stunde lang mit einem Blockierungspuffer bei Raumtemperatur blockieren. Fügen Sie die primären Antikörper für den ersten Zyklus hinzu.

Und die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dreimal mit PBS waschen. Führen Sie die Sekundärantikörperfärbung durch.

Für den ersten Zyklus werden die Sekundärantikörper für die entkoppelten Primärantikörper zusammen mit einer nuklearen Gegenfärbung aufgetragen. Inkubieren Sie die Proben 60 Minuten lang lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Taschentuch dreimal mit einem Milliliter PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Lassen Sie etwa 500 Mikroliter PBS in jeder Vertiefung und bringen Sie die Platte zum Mikroskop. Klicke in der Meta Express-Software auf "Screening" und dann auf "Akquise einrichten". Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswerfen.

Reinigen Sie den Boden der Platte mit 70% Ethanol und setzen Sie die Platte in das Mikroskop ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Lastplatte. Wählen Sie auf der Registerkarte Objektiv und Kamera die gewünschte Vergrößerung aus.

Wählen Sie als Erfassungsmodus den konfokalen 51-Mikrometer-Spaltmodus. Wählen Sie auf der Registerkarte Platte das Plattenmodell aus. Gehen Sie zur Registerkarte Plates Sites Visit.

Klicken Sie unter Site-Optionen auf eine feste Anzahl von Sites. Legen Sie die Anzahl der Spalten und Zeilen so fest, dass ungefähr die gesamte Vertiefung abgedeckt ist. Klicken Sie auf die Überlappungsstellen 10%Wählen Sie nur die erste Vertiefung für die Erfassung aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Vertiefung auf der Tafelkarte klicken.

Gehen Sie zur Registerkarte Erfassungs-Autofokus. Wählen Sie für den Well-to-Well-Autofokus die Option Platte und Well-Boden. Wählen Sie für den Site-Autofokus die Option Alle Sites aus.

Gehen Sie zur Registerkarte Wellenlängen und wählen Sie die Anzahl der Farbstoffe aus, die im aktuellen Zyklus abgebildet werden sollen. Wechseln Sie zur ersten Registerkarte Wellenlänge. Wählen Sie Laser mit Z-Versatz für die Z-Positionierung und klicken Sie auf die Schaltfläche Versatz berechnen, um die richtige Bildhöhe einzustellen.

Wählen Sie das Bild aus, bei dem die Probe am besten scharf ist. Drücken Sie die Fokus-Taste. Es wird ein scharfes Bild des Gewebes gezeigt.

Stellen Sie die Beleuchtungsstärke auf 50 % ein. Stellen Sie die maximale Zielintensität auf 2000 ein und drücken Sie Auto Expose. Wählen Sie für die Z-Serie die Option Z-Serie und 2D-Projektionsbild aus, und wählen Sie für die Schattierungskorrektur nur FL-Schattierung aus. Wiederholen Sie die Schritte für andere Wellenlängen, aber wählen Sie anstelle von Laser mit Z-Versatz Z-Versatz von W1 und dann Null.

Gehen Sie zum Schritt der Z-Serie und geben Sie die gewünschte Schrittweite ein. Klicken Sie auf die Taste "Fokus". Ziehen Sie den Pfeil für die aktuelle Position, bis der untere Rand des Gewebes erreicht ist, und klicken Sie auf die Schaltfläche B festlegen.

Ziehen Sie den Positionspfeil an den oberen Rand des Gewebes und klicken Sie auf die Schaltfläche T setzen. Klicken Sie auf F2, Stopp, drücken Sie erneut Start Live. Stellen Sie sicher, dass sich die Phase in der ersten Vertiefung befindet, indem Sie mit der linken Maustaste darauf klicken.

Suchen Sie den Rand des Gewebes und markieren Sie alle Stellen, die Gewebe für die Aufnahme enthalten, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken. Gehen Sie zur Registerkarte Ausführen, und geben Sie den Namen der Platte ein. Klicken Sie auf Protokoll speichern.

Richten Sie die Erfassungsregion für alle anderen Bohrlöcher ein. Führen Sie Control (Steuerung), "Journal" aus, "Aufzeichnung starten" und dann sofort "Steuerung", "Journal", "Aufzeichnung" beenden. Speichern Sie das erstellte Journal und öffnen Sie es wieder über Steuerung, Journal, Journal bearbeiten.

Gehen Sie im linken Bereich zu Plattenerfassung, Protokoll aus Datei laden und klicken Sie auf Plattenerfassung, um diese Schritte zum Journal hinzuzufügen. Doppelklicken Sie auf Plattenerfassung bearbeiten, Protokoll aus Datei laden und wählen Sie das Protokoll aus, das für die erste Vertiefung gespeichert wurde. Wiederholen Sie die Schritte für jede Vertiefung, die erfasst werden soll, und stellen Sie sicher, dass Sie immer das jeweilige Protokoll laden.

Klicken Sie auf Journal ausführen, um die Erfassung zu starten. Beginnen Sie 30 Minuten vor Ende des Tagebuchs mit der Vorbereitung des Bleichreagenzes. 10 Milligramm Lithiumborhydrid in 10 Millilitern doppelt destilliertem H2O auflösen und durch einen 0,22-Mikrometer-Filter passieren.

10 Minuten einwirken lassen. Die Lösung sollte anfangen, Blasen zu bilden. Um ein effizientes Bleichen zu gewährleisten, verwenden Sie das Bleichreagenz innerhalb von vier Stunden nach der Vorbereitung.

Geben Sie die Bleichlösung zu den Proben und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang, während die Proben dem Umgebungslicht ausgesetzt sind. Auf dem Gewebe sollten kleine Bläschen erscheinen. Waschen Sie die gebleichten Proben dreimal mit einem Milliliter PBS für jeweils fünf Minuten, jeweils bei Raumtemperatur.

Fügen Sie die primären Antikörper für den nächsten Zyklus hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Multiplex-IBEX-Bildgebung in Kombination mit der Click-iT EDU-Markierung zeigt unterschiedliche Strukturen und proliferierende Zelltypen in der verwundeten Haut. Die EDU-Markierung an kryokonservierten Proben zeigt sich ähnlich bei der Antikörper-Immunfluoreszenzmarkierung für KI-67 an paraffineingebetteten Gewebeschnitten sowie bei der Markierung von Zellen mit KI 67 mittels Durchflusszytometrie.

Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht den genauen Nachweis der Zellproliferation in komplexen biologischen Prozessen. Darüber hinaus erfordert die Open-Source-Pipeline für die Bildverarbeitung keine Programmierkenntnisse und generiert Dateien, die mit nicht-kommerzieller Software wie Fiji und quPath verarbeitet werden können. Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll keine teure Ausrüstung und kann daher in den meisten Forschungsumgebungen durchgeführt werden.