Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben
October 31st, 2025
Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.
Dieses Protokoll kombiniert die optische Multiplex-Bildgebungsmethode, IBEX und Click-iT EDU-Markierung, um sich teilende Zelltypen in hochdynamischen Prozessen, wie z. B. der Hautreparatur, zu erkennen und zu kategorisieren. Darüber hinaus bieten wir eine neuartige Open-Source-Pipeline für die Bildverarbeitung und -analyse mit hohem Durchsatz an. Bestreichen Sie die 24-Well-Platte mit 200 Mikrolitern Chrom-Aluminiumgelatine und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang auf einem Wippschüttler.
Entfernen Sie dann die Gelatine vollständig und trocknen Sie die beschichteten Vertiefungen 60 Minuten lang in einem 40-Grad-Ofen. Schneiden Sie das in OCT eingebettete Gewebe in einer Dicke von 15 bis 30 Mikrometern am Kryostaten und überführen Sie es schnell in eine beschichtete Vertiefung mit zwei Millilitern PBS. Entfernen Sie das PBS vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette und zielen Sie darauf ab, den Gewebeschnitt zentriert in der Vertiefung zu halten.
Um dies effektiv zu tun, saugen Sie das PBS langsam von den Rändern der Vertiefung ab und passen Sie die Pipettenposition nach Bedarf an, um eine Verschiebung des Gewebes zu verhindern. Trocknen Sie die Gewebeschnitte eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen. Rehydrieren Sie fünf Minuten lang mit einem Milliliter PBS.
Permeabilisieren Sie das Gewebe mit 500 Mikrolitern 0,5% Triton für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Tuch zweimal kurz mit PBS und führen Sie die Click-iT-Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durch. Bewahren Sie die Proben lichtgeschützt auf.
Waschen Sie das Tuch zweimal kurz mit PBS. Eine Stunde lang mit einem Blockierungspuffer bei Raumtemperatur blockieren. Fügen Sie die primären Antikörper für den ersten Zyklus hinzu.
Und die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Dreimal mit PBS waschen. Führen Sie die Sekundärantikörperfärbung durch.
Für den ersten Zyklus werden die Sekundärantikörper für die entkoppelten Primärantikörper zusammen mit einer nuklearen Gegenfärbung aufgetragen. Inkubieren Sie die Proben 60 Minuten lang lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Taschentuch dreimal mit einem Milliliter PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Lassen Sie etwa 500 Mikroliter PBS in jeder Vertiefung und bringen Sie die Platte zum Mikroskop. Klicke in der Meta Express-Software auf "Screening" und dann auf "Akquise einrichten". Klicken Sie auf die Schaltfläche Auswerfen.
Reinigen Sie den Boden der Platte mit 70% Ethanol und setzen Sie die Platte in das Mikroskop ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Lastplatte. Wählen Sie auf der Registerkarte Objektiv und Kamera die gewünschte Vergrößerung aus.
Wählen Sie als Erfassungsmodus den konfokalen 51-Mikrometer-Spaltmodus. Wählen Sie auf der Registerkarte Platte das Plattenmodell aus. Gehen Sie zur Registerkarte Plates Sites Visit.
Klicken Sie unter Site-Optionen auf eine feste Anzahl von Sites. Legen Sie die Anzahl der Spalten und Zeilen so fest, dass ungefähr die gesamte Vertiefung abgedeckt ist. Klicken Sie auf die Überlappungsstellen 10%Wählen Sie nur die erste Vertiefung für die Erfassung aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die entsprechende Vertiefung auf der Tafelkarte klicken.
Gehen Sie zur Registerkarte Erfassungs-Autofokus. Wählen Sie für den Well-to-Well-Autofokus die Option Platte und Well-Boden. Wählen Sie für den Site-Autofokus die Option Alle Sites aus.
Gehen Sie zur Registerkarte Wellenlängen und wählen Sie die Anzahl der Farbstoffe aus, die im aktuellen Zyklus abgebildet werden sollen. Wechseln Sie zur ersten Registerkarte Wellenlänge. Wählen Sie Laser mit Z-Versatz für die Z-Positionierung und klicken Sie auf die Schaltfläche Versatz berechnen, um die richtige Bildhöhe einzustellen.
Wählen Sie das Bild aus, bei dem die Probe am besten scharf ist. Drücken Sie die Fokus-Taste. Es wird ein scharfes Bild des Gewebes gezeigt.
Stellen Sie die Beleuchtungsstärke auf 50 % ein. Stellen Sie die maximale Zielintensität auf 2000 ein und drücken Sie Auto Expose. Wählen Sie für die Z-Serie die Option Z-Serie und 2D-Projektionsbild aus, und wählen Sie für die Schattierungskorrektur nur FL-Schattierung aus. Wiederholen Sie die Schritte für andere Wellenlängen, aber wählen Sie anstelle von Laser mit Z-Versatz Z-Versatz von W1 und dann Null.
Gehen Sie zum Schritt der Z-Serie und geben Sie die gewünschte Schrittweite ein. Klicken Sie auf die Taste "Fokus". Ziehen Sie den Pfeil für die aktuelle Position, bis der untere Rand des Gewebes erreicht ist, und klicken Sie auf die Schaltfläche B festlegen.
Ziehen Sie den Positionspfeil an den oberen Rand des Gewebes und klicken Sie auf die Schaltfläche T setzen. Klicken Sie auf F2, Stopp, drücken Sie erneut Start Live. Stellen Sie sicher, dass sich die Phase in der ersten Vertiefung befindet, indem Sie mit der linken Maustaste darauf klicken.
Suchen Sie den Rand des Gewebes und markieren Sie alle Stellen, die Gewebe für die Aufnahme enthalten, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken. Gehen Sie zur Registerkarte Ausführen, und geben Sie den Namen der Platte ein. Klicken Sie auf Protokoll speichern.
Richten Sie die Erfassungsregion für alle anderen Bohrlöcher ein. Führen Sie Control (Steuerung), "Journal" aus, "Aufzeichnung starten" und dann sofort "Steuerung", "Journal", "Aufzeichnung" beenden. Speichern Sie das erstellte Journal und öffnen Sie es wieder über Steuerung, Journal, Journal bearbeiten.
Gehen Sie im linken Bereich zu Plattenerfassung, Protokoll aus Datei laden und klicken Sie auf Plattenerfassung, um diese Schritte zum Journal hinzuzufügen. Doppelklicken Sie auf Plattenerfassung bearbeiten, Protokoll aus Datei laden und wählen Sie das Protokoll aus, das für die erste Vertiefung gespeichert wurde. Wiederholen Sie die Schritte für jede Vertiefung, die erfasst werden soll, und stellen Sie sicher, dass Sie immer das jeweilige Protokoll laden.
Klicken Sie auf Journal ausführen, um die Erfassung zu starten. Beginnen Sie 30 Minuten vor Ende des Tagebuchs mit der Vorbereitung des Bleichreagenzes. 10 Milligramm Lithiumborhydrid in 10 Millilitern doppelt destilliertem H2O auflösen und durch einen 0,22-Mikrometer-Filter passieren.
10 Minuten einwirken lassen. Die Lösung sollte anfangen, Blasen zu bilden. Um ein effizientes Bleichen zu gewährleisten, verwenden Sie das Bleichreagenz innerhalb von vier Stunden nach der Vorbereitung.
Geben Sie die Bleichlösung zu den Proben und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang, während die Proben dem Umgebungslicht ausgesetzt sind. Auf dem Gewebe sollten kleine Bläschen erscheinen. Waschen Sie die gebleichten Proben dreimal mit einem Milliliter PBS für jeweils fünf Minuten, jeweils bei Raumtemperatur.
Fügen Sie die primären Antikörper für den nächsten Zyklus hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Die Multiplex-IBEX-Bildgebung in Kombination mit der Click-iT EDU-Markierung zeigt unterschiedliche Strukturen und proliferierende Zelltypen in der verwundeten Haut. Die EDU-Markierung an kryokonservierten Proben zeigt sich ähnlich bei der Antikörper-Immunfluoreszenzmarkierung für KI-67 an paraffineingebetteten Gewebeschnitten sowie bei der Markierung von Zellen mit KI 67 mittels Durchflusszytometrie.
Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht den genauen Nachweis der Zellproliferation in komplexen biologischen Prozessen. Darüber hinaus erfordert die Open-Source-Pipeline für die Bildverarbeitung keine Programmierkenntnisse und generiert Dateien, die mit nicht-kommerzieller Software wie Fiji und quPath verarbeitet werden können. Darüber hinaus erfordert dieses Protokoll keine teure Ausrüstung und kann daher in den meisten Forschungsumgebungen durchgeführt werden.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Kombination der iterative-bleaching-extends-multiplexity (IBEX) und Click-iT EdU-Markierung zur Erkennung und Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen, insbesondere bei der murinen Hautreparatur. Die entwickelte Open-Source-Bildverarbeitungspipeline ermöglicht eine Hochdurchsatz-Bilderfassung und -analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellteilung und Kategorisierung
- Dynamische biologische Prozesse
- Hochdurchsatz-Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Bedeutung der Bildgebung zum Verständnis der Zellproliferation
- Bedarf an effektiven Gewebeverarbeitungsmethoden
- Frühere Einschränkungen in Multiplex-Bildgebungsansätzen
Verwendete Methoden
- Multiplex-optische Bildgebungsmethode und Click-iT EdU-Markierung
- Feste gefrorene murine Gewebeschnitte
- Hochdurchsatz-Bilderfassungstechnologie
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erkennung sich differenzierender Zelltypen, die an der Hautreparatur beteiligt sind
- Genaue Darstellung der Zellproliferation mithilfe neuartiger Techniken
- Vergleich mit traditionellen Antikörper-Immunfluoreszenzmethoden
Schlussfolgerungen
- Demonstriert einen effektiven Ansatz zum Studium der Zellproliferation in komplexen biologischen Kontexten
- Bietet ein wertvolles Werkzeug für die biologische Forschung ohne Programmierkenntnisse
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-throughput multiplexed imaging of skin tissue enables precise evaluation of cell phenotypes and proliferation states, addressing a critical gap in regenerative biology and tissue repair research. The integration of IBEX with Click-iT EdU chemistry and automated confocal imaging enhances predictive confidence in cell state characterization and supports robust target validation in early discovery. This workflow positions biopharma teams to make informed, risk-adjusted decisions in regenerative medicine and tissue engineering portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of regenerative cell populations and their proliferation dynamics.
- Supports functional target validation by distinguishing actively dividing cell types in situ.
- Improves predictive confidence for pathway analysis in tissue repair models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue sections for multiplexed imaging assays.
- Standardizes quantitative assessment of proliferation markers across multiple cell types.
- Enables scalable, reproducible imaging workflows suitable for high-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant regenerative processes in preclinical models.
- Provides continuity from discovery-stage cell state analysis to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports risk-adjusted advancement of regenerative medicine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through preclinical research, enabling iterative hypothesis testing and robust cell state quantification in tissue samples.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by clarifying cell proliferation and phenotype changes during tissue repair.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content, multiplexed readouts for comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissue contexts.
- Enterprise Reuse: Offers an open-source, adaptable imaging and analysis pipeline for broad R&D deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in regenerative cell state analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in regenerative medicine.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue repair and cell therapy programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and tissue handling.
- Needs access to automated spinning disk confocal microscopy and compatible imaging software.
- Demands cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various tissue types and regenerative models with protocol optimization.
- Limited by the need for careful reagent handling and iterative imaging cycles.
