Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie kombinatorische Bibliotheken synthetisiert werden können, die Peptid-Tertiär-Amid- oder PTA-Einheiten enthalten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein PTA-Submonomer aus natürlichen Aminosäuren hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Peptid-Linker-Region auf einem festen Träger zu synthetisieren.

Als nächstes wird eine kombinatorische Bibliothek synthetisiert, die PTA- und Peptid-Untereinheiten enthält. Der letzte Schritt besteht darin, die synthetisierte Bibliothek zu charakterisieren, um die Qualität der Synthese sicherzustellen. Letztendlich wird eine kombinatorische Bibliothek synthetisiert, die bestätigte eingeschränkte PTA-Untereinheiten enthält, und eine solche Bibliothek kann für das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden, um Proteinliganden bereitzustellen und zur Entdeckung neuer Wirkstoffe zu führen.

Die Chemie, um die es in diesem Artikel geht, wurde entwickelt, um Moleküle zu finden, die viel steifer sind als einige der Peptide und andere Dinge, mit denen wir zuvor gearbeitet haben. Die Idee ist, dass, wenn man Bibliotheken mit steiferen Molekülen identifiziert, diese an Proteinziele mit viel höheren Affinitäten binden, und wir dachten, dies sei sehr, sehr wichtig für den Versuch, Medikamente für die Zukunft zu entwickeln, oder sogar interessante Sondenmoleküle. Die visuelle Demonstration dieser PTA-Unterordnungssynthese ist von entscheidender Bedeutung, da die Synthese schwer zu erlernen ist, da die Temperatur und die Timing-Steuerung für eine erfolgreiche Synthese sehr wichtig sind.

Zuerst werden 8,9 g Dine und 11,9 g Kaliumbromid in einen 500-Milliliter-Rundkolben mit drei Halsen und einem magnetischen Rührstab gegeben. Geben Sie dann 100 Milliliter einer zuvor vorbereiteten 30%igen Bromwasserstofflösung in den Kolben. Nachdem Sie den Kolben in ein minus 10 Grad Celsius heißes Ethylenglykol gelegt haben, sprudeln Sie Argon im Trockeneisbad 10 Minuten lang durch eine lange Nadel vom Boden des Kolbens.

Die Lösung mit dem Magnetrührstab bei 300 U/min umrühren. Anschließend wird eine zuvor hergestellte Natriumnitritlösung in einen Druckausgleichstrichter gegeben, der an dem Rundkolben mit drei Halsen befestigt ist, und ihn mit einem Septum verschlossen. Das Ventil des Tropftrichters wird langsam geöffnet, so dass die Natriumnitritlösung in den Kolben tropft.

Steuern Sie das Ventil, um die Tropfrate auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde einzustellen. Nachdem die Natriumnitritzugabe abgeschlossen ist, rühren Sie die Lösung weitere drei Stunden lang weiter, sodass sich die Temperatur von minus 10 Grad Celsius auf Raumtemperatur erwärmen kann. Wenn die Farbe der Lösung zu dunkel ist, legen Sie ein Vakuum an, um die überschüssigen Stickoxide und möglicherweise das während der Reaktion entstehende Brom zu entfernen.

Nachdem die Lösung in einen Extraktionstrichter überführt wurde, wird das Produkt dreimal mit 35 Millilitern Dathylether extrahiert. Nach dem Kombinieren der organischen Phase und dem Waschen mit gesättigter Salzlake wird es in einem Kolben gesammelt und sechs Stunden lang über Natriumsulfat getrocknet. Nach der Filtration des Natriumsulfats das Lösungsmittel unter Vakuum verdampfen, um ein klares bis hellgelbes Öl zu erhalten.

Reinigen Sie das Rohprodukt durch Kieselgel-Säulenchromatographie mit drei zu eins Hexanethylacetat für die Isotopenmarkierung, lösen Sie 300 Milligramm Lalanin mit 10 Millilitern deuteriertem Wasser in einem 50-Milliliter-Polyethylenröhrchen. Nachdem Sie 10 Milligramm Alpha-Ketoglutarat als cos-Substrat hinzugefügt haben, erwärmen Sie das Röhrchen auf 37 Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie den pH-Wert mit einer einmolaren Natriumoxidlösung und pH-Teststreifen auf 8,5 bis 8,7 ein.

Geben Sie anschließend 0,1 Milligramm Alanin-Transaminase in die Lösung. Legen Sie das Röhrchen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und inkubieren Sie es über Nacht unter leichtem Schütteln bei 10 bis 30 U/min. Zu diesem Zeitpunkt wird ein Gramm 90 Mikron, 10 to Gelkügelchen mit Ram-Linker in 10 Millilitern Dimethylformamid drei Stunden lang in einem 12-Milliliter-Spritzenreaktor unter leichtem Schütteln aufgequollen, das Dimethylformamid aus dem Reaktor ablassen und 10 Milliliter 20%pi Perin-Dimethylformamid-Lösung hinzufügen, um die FOC-Gruppe vor der Eisbahn inmitten des Linkers zu schützen.

Nachdem Sie die Kügelchen 30 Minuten lang mit der 20%igen Pepperdine-Lösung geschüttelt haben, waschen Sie sie fünfmal mit Dimethylforma-Fleisch, um das gesamte Pepperdine zu entfernen. Entfernen Sie anschließend einige Kügelchen aus der Spritze und testen Sie sie mit einem Chloral-Test. Geben Sie zwei Milliliter einer zwei molaren Bromessigsäure-Dimethylformamid-Lösung zu den Kügelchen und schütteln Sie sie leicht.

Geben Sie dann zwei Milliliter einer zwei molaren Diop-Propylcarbodiamin-Dimethylformamid-Lösung zu den Kügelchen. Nachdem Sie die Spritze mit einem Kolben verschlossen haben, schütteln Sie die Kügelchen auf einem Shaker 10 Minuten lang. Nachdem die Kügelchen gründlich mit Dimethylformamid gewaschen wurden, fügen Sie zwei Milliliter einer zuvor hergestellten einmolaren Methoxyethyldimethylformamidlösung hinzu.

Nachdem Sie die Kügelchen geschüttelt und fünfmal mit Dimethylformamid gewaschen haben, überprüfen Sie einige der Kügelchen mit einem Chloral-Test. Geben Sie anschließend 10 Milliliter einer Eins-zu-Eins-Dichloralmethan-Dimethylformamid-Lösung in die zuvor verwendete Spritze. Teilen Sie alle Ein-Gramm-Kügelchen gleichmäßig in drei Fünf-Milliliter-Spritzenreaktoren auf, indem Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze verwenden.

Nachdem Sie die drei Spritzen dreimal mit Chlormethan gewaschen haben, waschen Sie die mit r und s markierten Spritzen dreimal mit wasserfreiem Tet-Hydrofurin und die mit B markierte Spritze dreimal mit Dimethylformamid. Für die Tristin-Kopplung von Brompropan-NOICSÄURE geben Sie etwa 200 mg Trostin in eine Durchstechflasche in einem Abzug. Sobald die Durchstechflasche verschlossen ist, wiegen Sie die Menge an Trostin in der Durchstechflasche.

Geben Sie dann die entsprechende Menge wasserfreies Tetrahydroferran in die Durchstechflasche, um eine Triphosgen-Tetrahydroferran-Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Zur Herstellung des Bromsäure-Triphosgen-Gemisches werden 89 Mikroliter R zwei Brom-Propan-NOINSÄURE und S zwei Brom-Propan-NOIC-säure D vier in zwei kleinen Durchstechflaschen getrennt in jede Durchstechflasche gegeben, fünf Milliliter der Tristin-Tetrahydro-Furan-Lösung zugegeben. Nachdem Sie die Fläschchen verschlossen haben, legen Sie sie für 20 Minuten in einen Gefrierschrank mit minus 20 Grad Celsius.

In der Zwischenzeit werden 1 125 Mikroliter einer Tetrahydrofuran-Diisopropylaminlösung in die Spritzen r und s gegeben. Unabhängig davon werden 356 Mikroliter 2 4 6 Trimethylpurin in jede Durchstechflasche gegeben, die die abgekühlten Bromsäurephosgenmischungen enthalten, die weiße Ausfällungen ergeben. Tragen Sie sofort die entsprechende Suspension direkt auf die ifizierten Kügelchen auf und geben Sie sie dann auf einen Shaker, um sie zwei Stunden lang unter 120 U/min zu schütteln.

Für die Kopplung von Bromessigsäure mit Diisopropylcarbonbodiain geben Sie fünf Milliliter einer zwei molaren Bromessigsäuredimethylformamidlösung in die Spritze B. Nach dem Schütteln geben Sie fünf Milliliter einer zwei molaren Dipropylcarbondiamin-Dimethylformamid-Lösung in dieselbe Spritze und schütteln Sie sie vorsichtig an dieser Stelle, an der Sie Spritze B auf demselben Schüttler wie die Spritze r und s platzieren. Schütteln Sie die Spritzen dann zwei Stunden lang, nachdem Sie die Spritzen gründlich mit Dichlormethan und Dimethylformamid gewaschen haben. Bündeln Sie alle Kügelchen aus den Spritzen R, s und B in einem 12-Milliliter-Spritzenreaktor.

Nachdem die Kügelchen fünfmal mit Dimethylformamid gewaschen wurden, geben Sie 10 Milliliter einer Eins-zu-Eins-Dichlormethan-Dimethylformamid-Lösung in die Spritze. Alle Kügelchen werden gleichmäßig in sieben einzelne Zwei-Milliliter-Spritzen aufgeteilt, wobei eine 1000-Mikroliter-Pipette mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze zur Emanation verwendet wird, und fünf Milliliter von sieben zuvor hergestellten zweimolaren Aminlösungen in die entsprechende Spritze geben. Inkubieren Sie alle sieben Spritzen in einem 60 Grad Celsius Inkubator mit Schütteln über Nacht Nach der Inkubation.

Waschen Sie die Kügelchen, die fünfmal gespalten werden müssen, mit Dichloralmethan. Nachdem Sie die Kügelchen 15 Minuten geschüttelt und erneut mit Di-Chlormethan gewaschen haben, lassen Sie das Di-Chlormethan aus der Spritze ab. Übertragen Sie dann jede einzelne Perle in eine 96-Well-Platte.

Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem Lichtmikroskop und einer Pipette mit abgeschnittener Spitze mit einem Deckglas ab und legen Sie sie für 15 Minuten in den Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Nachdem die Platte aus dem Gefrierschrank genommen wurde, fügen Sie 20 Mikroliter einer zuvor vorbereiteten abgekühlten Eins-zu-Eins-TFA-DI-Chlormethanlösung in jede der Vertiefungen hinzu, die eine Perle enthält. Setzen Sie den Deckglas wieder auf und stellen Sie die Wandplatte 96 auf einen Shaker zurück in den Gefrierschrank mit minus 20 Grad Celsius.

Nehmen Sie nach 20-minütigem Schütteln die Wandplatte 96 aus dem Gefrierschrank und ziehen Sie den Deckglas ab. Föhnen Sie das Di-Chlormethan aus jeder Vertiefung, indem Sie Luft darüber blasen. Bei der Spaltung bei Raumtemperatur mit einer 50%igen TFA DI-CHLOR-Methanlösung wird eine signifikante Degradation beobachtet.

Die Peaks 593 und 484 entsprechen dem Linker- bzw. PTA-Trimer und zeigen, dass das gesamte Molekül erfolgreich auf der Kügelchen synthetisiert, aber während der Spaltung abgebaut wurde. Bei der Spaltung unter niedrigen Temperaturbedingungen, wie oben beschrieben, wird die Menge der TFA-induzierten Degradation stark unterdrückt. Der Spaltungsmechanismus wurde in der früheren Literatur beschrieben und es wird angenommen, dass er durch eine Olaine verläuft. PTA-Zwischenmoleküle können durch Ms.MS sequenziert werden, und das Fragmentierungsmuster ist ähnlich wie bei Peptiden und Peptiden.

PTA-Moleküle, die mit S zwei synthetisiert werden, Brom, Propolsäure D vier, ergeben im Allgemeinen breitere Peaks bei MS und msm. Aufgrund des Vorhandenseins unvollständiger Dauerprodukte wie S zwei Brompropan, NOICSÄURE D drei könnte dies als Hinweis auf das Vorhandensein des R chiralen Zentrums während des Sequenzierungsverfahrens verwendet werden, PTA-Moleküle neigen auch dazu, ein stärker atiertes Addukt als Peptidpeptid zu bilden. Daher werden natriumarmes Wasser und Kunststoffgeräte bevorzugt.

Ein weiteres potenzielles Nebenprodukt ist das Acrylamid, das bei der Aminierung von Brom gebildet wird. Sobald das Acrylamid gebildet ist, wird die Sequenz beendet. Dies kann gelöst werden, indem die primäre Aminkonzentration auf einen Molaren gesenkt wird, um die Lösung zu reduzieren.

Basicity Einmal gemeistert, kann eine Bibliothek in guter Größe in zwei Tagen erstellt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Jetzt, da diese Chemie vollständig entwickelt ist und die Synthese recht effektiv ist, hoffe ich, dass andere Forscher diese leistungsstarke Technologie übernehmen werden, um konformationsbeschränkte Peptidmimetika für die Arzneimittelentwicklung und Sondenentwicklung herzustellen.