Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu demonstrieren, wie kombinatorische Bibliotheken, die Peptid-Tertiarylamid- oder PTA-Einheiten enthalten, synthetisiert werden. Dies wird zunächst durch die Herstellung eines PTA-Submonomers aus natürlichen Aminosäuren erreicht. Der zweite Schritt besteht in der Synthese eines peptidischen Linkerbereichs auf einer festen Trägersubstanz.

Anschließend wird eine kombinatorische Bibliothek synthetisiert, die PTA- und Peptid-Untereinheiten enthält. Der letzte Schritt besteht darin, die synthetisierte Bibliothek zu charakterisieren, um die Qualität der Synthese sicherzustellen. Letztendlich wird eine kombinatorische Bibliothek hergestellt, die konformationell eingeschränkte PTA-Untereinheiten enthält, und eine solche Bibliothek kann für Hochdurchsatz-Screenings verwendet werden, um Proteinliganden zu erhalten und zur Entdeckung neuer Wirkstoffe beizutragen.

Die Chemie, die Gegenstand dieses Artikels ist, wurde entwickelt, um Moleküle zu finden, die deutlich steifer waren als einige der Peptide und anderen Substanzen, mit denen wir zuvor gearbeitet hatten. Die Idee dabei ist, dass, wenn man Bibliotheken steiferer Moleküle identifiziert, diese mit viel höherer Affinität an Proteine binden werden, und wir hielten dies für äußerst wichtig bei der Entwicklung zukünftiger Arzneimittel oder auch interessanter Sondenmoleküle. Die visuelle Demonstration dieser PTA-Teilsynthese ist besonders wichtig, da die Synthese schwer zu erlernen ist, weil Temperatur- und Zeitsteuerung entscheidend für eine erfolgreiche Synthese sind.

Zunächst 8,9 Gramm Dine und 11,9 Gramm Kaliumbromid in einen 500-Milliliter-Dreihals-Rundkolben mit einem Magnetrührstab geben. Dann 100 Milliliter einer zuvor hergestellten 30 %igen Bromwasserstoffsäure-Lösung zum Kolben hinzufügen. Nachdem der Kolben in ein Ethylenglykol-Trockeneis-Bad mit einer Temperatur von minus 10 Grad Celsius gestellt wurde, zehn Minuten lang Argon über eine lange Nadel von unten durch die Lösung blubbern lassen.

Rühren Sie die Lösung mit dem Magnetrührstab bei 300 U/min um. Danach geben Sie eine zuvor hergestellte Natriumnitrit-Lösung in einen Druckausgleichstropftrichter, der an den dreihalsigen Rundkolben angeschlossen ist, und verschließen Sie ihn mit einem Septum. Öffnen Sie langsam das Ventil des Tropftrichters, sodass die Natriumnitrit-Lösung tropfenweise in den Kolben fließt.

Steuern Sie das Ventil, um die Tropfgeschwindigkeit auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde einzustellen. Nachdem die Zugabe von Natriumnitrit abgeschlossen ist, rühren Sie die Lösung weitere drei Stunden lang um, wobei die Temperatur von minus 10 Grad Celsius auf Raumtemperatur ansteigen kann. Falls die Farbe der Lösung zu dunkel ist, ziehen Sie ein Vakuum an, um überschüssige Stickoxide und eventuell während der Reaktion gebildetes Brom zu entfernen.

Nachdem die Lösung in einen Trenntrichter überführt wurde, extrahieren Sie das Produkt dreimal mit jeweils 35 Milliliter Diethylether. Nach dem Vereinigen der organischen Phase und Waschen mit gesättigter Kochsalzlösung sammeln Sie diese in einem Kolben und trocknen sie sechs Stunden über Natriumsulfat. Nach der Filtration des Natriumsulfats verdampfen Sie das Lösungsmittel im Vakuum, um ein farbloses bis blassgelbes Öl zu erhalten.

Reinigen Sie das Rohprodukt durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit drei zu eins Hexan/Essigsäureethylester. Für die isotopische Markierung lösen Sie 300 Milligramm L-Alanin mit 10 Milliliter Deuteriumoxid in einem 50-Milliliter-Polyethylenrohr. Nach Zugabe von 10 Milligramm α-Ketoglutarat als Cofaktorsubstrat erwärmen Sie das Rohr auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie nach Beendigung den pH-Wert mit einer einmolarigen Natriumdeuteroxidlösung und pH-Teststreifen auf 8,5 bis 8,7 ein.

Fügen Sie anschließend 0,1 Milligramm Alanin-Transaminase zur Lösung hinzu. Stellen Sie das Gefäß in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator und inkubieren Sie über Nacht bei leichtem Schütteln mit 10 bis 30 U/min. Schwellen Sie zu diesem Zeitpunkt ein Gramm 90-Mikron-10- bis Gelkügelchen mit Ram-Linker in 10 Milliliter Dimethylformamid für drei Stunden in einem 12-Milliliter-Spritzenreaktor bei leichtem Schütteln an, lassen Sie das Dimethylformamid aus dem Reaktor ab und geben Sie 10 Milliliter einer 20 %igen Pi-Perin-Dimethylformamidlösung zu, um die FOC-Gruppe vom Rink-Amid-Linker zu entfernen.

Nachdem die Kügelchen 30 Minuten lang mit der 20 %igen Pepperdine-Lösung geschüttelt wurden, werden sie fünfmal mit Dimethylformamid gewaschen, um sämtliches Pepperdine zu entfernen. Anschließend entnimmt man einige Kügelchen aus der Spritze und testet sie mit einem Chloraltest. Gibt man zwei Milliliter einer zwei Molaren Bromessigsäure-Dimethylformamid-Lösung zu den Kügelchen und schüttelt vorsichtig.

Anschließend zwei Milliliter einer zwei Molaren Diop-Propylcarbodiamin-Dimethylformamidlösung zu den Kügelchen geben. Nach dem Verschluss der Spritze mit einem Kolben die Kügelchen 10 Minuten lang auf einem Schüttler schütteln. Nachdem die Kügelchen gründlich mit Dimethylformamid gewaschen wurden, zwei Milliliter einer zuvor hergestellten einmolaren Methoxyethyl-Dimethylformamidlösung hinzufügen.

Nachdem die Kügelchen geschüttelt und fünfmal mit Dimethylformamid gewaschen wurden, überprüfen Sie einige der Kügelchen mit einem Chloraltest. Danach geben Sie 10 Milliliter einer eins-zu-eins-Lösung aus Dichlormethan und Dimethylformamid in die zuvor verwendete Spritze. Verteilen Sie alle ein Gramm Kügelchen gleichmäßig auf drei Fünf-Milliliter-Spritzenreaktoren unter Verwendung einer 1000-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittener Pipettenspitze.

Nachdem die drei Spritzen dreimal mit Chloromethan gewaschen wurden, die mit r und s beschrifteten Spritzen dreimal mit wasserfreiem Tetrahydrofuran und die mit B beschriftete Spritze dreimal mit Dimethylformamid gewaschen. Für die Tristin-Kupplung von Brompropannonsäure etwa 200 Milligramm Tristin in ein Gefäß in einem Abzug geben. Sobald das Gefäß verschlossen wurde, die Menge an Tristin im Gefäß wiegen.

Geben Sie dann die geeignete Menge wasserfreies Tetrahydroferran in das Gefäß, um eine 20 Milligramm pro Milliliter Triphosgen-Tetrahydroferran-Lösung herzustellen. Um die Mischung aus Bromosäuren und Triphosgen vorzubereiten, geben Sie 89 Mikroliter R-2-Brompropansäure und S-2-Brompropansäure-D4 in zwei kleine Gefäße getrennt; geben Sie dann in jedes Gefäß 5 Milliliter der Tristin-Tetrahydrofuran-Lösung. Nach dem Verschließen der Gefäße stellen Sie sie 20 Minuten lang in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius.

Unterdessen 1.125 Mikroliter einer 2:1-Tetrahydrofuran-Diisopropylamin-Lösung in die Spritzen r und s geben. Separat jeweils 356 Mikroliter 2,4,6-Trimethylpurin zu den Röhrchen mit den gekühlten Bromosäure-Phosgen-Gemischen hinzufügen, wodurch weiße Niederschläge entstehen. Unverzüglich die entsprechende Suspension direkt auf die aktivierten Harzperlen auftragen und anschließend auf einen Schüttler stellen, um sie zwei Stunden lang bei 120 U/min zu schütteln.

Für die Kopplung von Bromessigsäure mit Diisopropylcarbodiimin geben Sie fünf Milliliter einer zwei Molaren Lösung von Bromessigsäure in Dimethylformamid in Spritze B. Nach dem Schütteln geben Sie fünf Milliliter einer zwei Molaren Lösung von Dipropylcarbodiimin in Dimethylformamid derselben Spritze hinzu und schütteln vorsichtig. Danach stellen Sie Spritze B auf denselben Schüttler wie die Spritzen R und S. Schütteln Sie die Spritzen anschließend zwei Stunden lang, nachdem Sie die Spritzen gründlich mit Dichlormethan und Dimethylformamid gewaschen haben. Vereinigen Sie alle Kügelchen aus den Spritzen R, S und B in einem 12-Milliliter-Spritzenreaktor.

Nachdem die Kügelchen fünfmal mit Dimethylformamid gewaschen wurden, 10 Milliliter einer 1:1-Lösung aus Dichlormethan und Dimethylformamid in die Spritze geben. Alle Kügelchen mithilfe einer 1000-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittener Pipettenspitze zur Entnahme gleichmäßig auf sieben einzelne 2-Milliliter-Spritzen verteilen und jeweils 5 Milliliter der zuvor hergestellten 2-molaren Aminlösungen den entsprechenden Spritzen hinzufügen. Alle sieben Spritzen anschließend über Nacht bei 60 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren.

Waschen Sie die Kugeln, die gespalten werden müssen, fünfmal mit Dichlormethan. Nachdem Sie die Kugeln 15 Minuten geschüttelt und sie erneut mit Dichlormethan gewaschen haben, lassen Sie das Dichlormethan aus der Spritze ab. Überführen Sie dann jede einzelne Kugel in eine 96-Loch-Platte.

Unter Verwendung eines Lichtmikroskops und einer Pipette mit abgeschnittener Spitzenabdeckung wird die 96-Well-Platte mit einem Deckglas abgedeckt und für 15 Minuten in den minus 20 Grad Celsius kalten Gefrierschrank gestellt. Sobald die Platte aus dem Gefrierschrank entnommen wurde, werden 20 Mikroliter einer zuvor hergestellten gekühlten 1:1-TFA-DI-Chlormethan-Lösung in jedes der Wells, die eine Kugel enthalten, gegeben. Das Deckglas wird erneut aufgesetzt, und die 96-Well-Platte wird auf einen Schüttler im minus 20 Grad Celsius kalten Gefrierschrank zurückgestellt.

Nach 20-minütigem Schütteln die 96er-Platte aus dem Gefrierschrank nehmen und den Deckel abziehen. Das Dichlormethan aus jedem Loch durch Überblasen mit Luft austrocknen. Bei Spaltung unter Raumtemperatur mithilfe einer 50 %igen TFA-Dichlormethan-Lösung wird eine erhebliche Degradation beobachtet.

Die Peaks bei 593 und 484 entsprechen dem Linker bzw. dem PTA-Trimer und zeigen, dass das gesamte Molekül erfolgreich auf der Harzkügelchen synthetisiert, jedoch während der Spaltung degradiert wurde. Bei der Spaltung unter niedrigen Temperaturen, wie oben beschrieben, wird die durch TFA verursachte Degradation stark unterdrückt. Der Spaltungsmechanismus wurde bereits in früherer Literatur beschrieben und soll über ein olainisches Zwischenprodukt ablaufen. PTA-Moleküle können mittels MS/MS sequenziert werden, und das Fragmentierungsmuster ähnelt dem von Peptiden und Peptiden.

PTA-Moleküle, die mit S zwei Brompropionsäure D vier synthetisiert werden, zeigen im MS- und MS/MS-Spektrum aufgrund unvollständiger Reaktionsprodukte wie S zwei Brompropionsäure D drei im Allgemeinen breitere Peaks. Diese könnten als Hinweis auf das Vorhandensein des R-chiralen Zentrums während des Sequenzierungsverfahrens dienen. PTA-Moleküle neigen außerdem dazu, stärker adduktbildend als Peptid-Peptid zu wirken. Daher werden natriumarme Wasser und Plastikapparaturen bevorzugt.

Ein weiteres potenzielles Nebenprodukt ist das Acrylamid, das durch die Bromeliminierung während der Aminierung gebildet wird. Sobald das Acrylamid entstanden ist, wird die Sequenz beendet. Dies kann gelöst werden, indem die Konzentration des primären Amins auf einmolare Konzentration gesenkt wird, um die Lösung zu reduzieren.

Basizität Sobald man eine Bibliothek guter Größe beherrscht, kann diese in zwei Tagen vorbereitet werden, wenn das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird. Da diese Chemie nun vollständig entwickelt ist und die Synthese äußerst effektiv ist, hoffe ich, dass andere Forscher diese leistungsfähige Technologie übernehmen, um konformationell eingeschränkte Peptidmimetika für die Arzneimittelentwicklung und die Entwicklung von Sonden herzustellen.