Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Stellen der ACAP-LBC-Interaktion mit PDE vier D drei zu kartieren. Durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität von biomolekularen, Fluoreszenz-, Komplementations- oder BC-Werten mittels Durchflusszytometrie. Zu diesem Zweck werden die Zellen mit ACAP, LBC und PDE, vier D, drei Fragmenten, transfiziert, die mit dem N- oder C-terminalen Teil des fluoreszierenden Reporterproteins fusioniert sind.

Anschließend wird eine Venus-Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Fluoreszenz zu beurteilen, ob die Proteinfragmente interagieren, Venus ist abgeschlossen und die Fluoreszenz ist abgeschlossen. Wenn die Proteinfragmente nicht interagieren, wird keine Fluoreszenz nachgewiesen. Eine ergänzende westliche Blutanalyse wird durchgeführt, um die relativen Proteinexpressionsniveaus zu bestimmen.

Die Stärke der Protein-Protein-Wechselwirkungen wird dann berechnet, indem die mittlere Fluoreszenzintensität des YFP mit den Proteinexpressionsniveaus normalisiert wird. Die daraus resultierenden Daten deuten darauf hin, dass die Bindung von PDE 43 an ACAP-LBC durch mehrere Regionen innerhalb von PDE 43 vermittelt wird, hauptsächlich durch die stromaufwärts gelegene konservierte Region eins oder UCR eins. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Co-Immunpräzipitation und BP C unter dem Mikroskop sind, dass sie relativ einfach ist, empfindlich ist und das schnelle Screening einer großen Anzahl von Zellen ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in Protein-Protein-Wechselwirkungen geben kann, kann sie auch verwendet werden, um nach Faktoren zu suchen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen für die Wirkstoffforschung regulieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da eine lineare B-Reaktion bestimmt werden muss. Eine Expression des Konstrukts sollte ähnlich sein, so dass bei der Verwendung verschiedener Proteinfragmente miteinander verglichen werden können.

In den hier beschriebenen Experimenten wurden die Zellen mit dem N-terminalen Fragment des YFP-Derivats transfiziert, Venus fusionierte mit ACAP LBC in voller Länge und das C-terminale Fragment der Venus mit einer der folgenden, PDE E 43 in voller Länge, die stromaufwärts konservierte Region eins UCR eine von PDE E 43 oder die stromaufwärts konservierte Region zwei plus katalytische Region UCR R zwei plus CAT von PDE 43 am Tag vor der Transfektion in Sechs. Nun, Gewebekulturplatten säen 1,2 mal 10 bis zur fünften HEC 2 9 3 T-Zellen pro Vertiefung in zwei Millilitern vollständigem Wachstum. Mittleres Saatgut, drei Kontrollvertiefungen plus drei Vertiefungen für jeden Test.

Cotran inkubieren über Nacht bei 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag bereiten Sie sich auf die Transfektion der BC-Plasma-DNA-Konstrukte und des CFP-Vektors vor, der mit BS C-Konstrukten als Marker transfiziert wird. Geben Sie für jede Bedingung die entsprechende Menge DNA in 250 Mikroliter Optum M1 Serum Free Medium.

In einem sterilen Röhrchen reicht ein Röhrchen aus, um drei Vertiefungen zu transfizieren. Geben Sie dann drei Mikroliter Transit-LT, ein Reagenz pro Mikrogramm in die verdünnte DNA-Mischung und pipettieren Sie vorsichtig, um sie zu mischen, zu inkubieren und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach der Inkubation bei 250 Mikrolitern Transfektionsmischung tropfenweise zu den Zellen inkubieren und dann bei 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, 24 Stunden, inkubieren.

Nach der Transfektionskontrolle unter einem Epi-Fluoreszenzmikroskop sollten die Zellen gelbe Fluoreszenz für das BC-Signal und CFP-Fluoreszenz für die Berichterstattung über die Transfektionseffizienz exprimieren. Um die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse vorzubereiten, waschen Sie sie zunächst mit zwei Millilitern eiskaltem PBS und lösen Sie die Zellen dann durch Zugabe von 250 Mikrolitern 0,05%igem Trypsin, inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend mit einem Mikroskop auf Zellablösung prüfen.

Sobald sich die Zellen abgelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit einem Milliliter DMEM. Übertragen Sie als Nächstes einen Milliliter Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und dann 0,25 Milliliter Zellen in ein zweites Mikrozentrifugenröhrchen. Schleudern Sie die Tuben bei 500 Käsesorten fünf Minuten lang.

Die 250 Mikroliter große Probe wird für die Durchflusszytometrie weiterverarbeitet. Legen Sie die eine Milliliter-Probe auf Eis für die westliche Blutanalyse beiseite, die parallel zur Spin-Resus durchgeführt werden sollte. Suspendieren Sie die Zellen in 250 Mikroliter Faxpuffer und legen Sie sie auf Eiszellen kann auch in 1% Paraformaldehyd in PBS fixiert werden Wenn die Durchflusszytometrie-Analyse hier nicht sofort erfolgen wird, wird die Durchflusszytometrie mit einem Beckman-Coulter-Cyan durchgeführt, einem DP, das mit 488-Nanometer-, 405-Nanometer- und 642-Nanometer-Festkörperlasern ausgestattet ist. Die Summit-Software wird für die Erfassung und Analyse nach der Kalibrierung des Durchflusszytometers mit Standardkügelchen verwendet. Plotten Sie die Vorwärtsstreuung oder FSC im Vergleich zur Seitwärtsstreuung SSC auf einer linearen Skala und den Gang auf der lebenden Zellpopulation.

Als nächstes stellen Sie SSC im Vergleich zur Spannung, Pulsbreite und zum Gang auf der nicht aggregierten lebenden Zellpopulation dar. Dann plotten Sie FSC auf einer linearen Skala im Vergleich zur CFP-Fluoreszenz bei 405 FL sechs auf diesem Instrument auf einer logarithmischen Skala und gehen Sie auf den nicht aggregierten lebenden CFP-positiven Zellen. Schließlich wird FSC auf einer linearen Skala im Vergleich zur YFP-Fluoreszenz bei 488 Nanometern FL und auf diesem Instrument auf einer logarithmischen Skala aufgetragen, um die BC-Intensität zu visualisieren.

Führen Sie als Nächstes das Y-F-P-C-F-P-Doppel-Negativ-Sample aus und stellen Sie die Spannung der F-S-C-S-S-C FL one und FL sechs Photomultiplier-Röhre oder PMT ein, um den Schwellenwert für jedes Signal einzustellen. Führen Sie als Nächstes sowohl YFP- als auch CFP-Einzelpositivproben für die zukünftige Offline-Kompensation durch. Stellen Sie sicher, dass Sie mindestens 10.000 Gated Events erwerben.

Sammeln Sie schließlich Daten für experimentelle Proben nach der Datenerfassung. Richten Sie das Analyseprotokoll gemäß der Erfassung mit Propagierung mit Gate eins im FS CSC-Punktdiagramm für lebende Zellen ein. Gate zwei im FSC-Impuls mit Punktdiagramm von Gate eins für nicht aggregierte lebende Zellen und Gate drei im ccfp FSC-Punktdiagramm von Gate zwei für nicht aggregierte ccfp-positive lebende Zellen.

Nach der Kompensation des YFP- und CCFP-Signals im Y fp CFP-Punktdiagramm unter Verwendung von YFP- und CFP-Einzel-positiven Zellen bestimmen wir die Cutoff-Linien für CFP- und YFP-positive Zellen. Exportieren Sie die mittlere YFP-Fluoreszenzintensität oder MFI von CFP-positiven Zellen in Excel für die Datendarstellung, normalisieren Sie dann in Excel Y-F-P-M-F-I auf das Expressionsniveau von ACAP LBC PDE E 43 und laden Sie Alpha-Tubulin durch Western Blotting, um den linearen Bereich der mittleren Fluoreszenzintensität von YFP zu bestimmen. CFP wurde mit VN ACAP L BBC und unterschiedlichen Mengen an VC PDE E 43 in HEC 2 93-Zellen transeziert, und die Interaktion wurde mit Hilfe der bif-Durchflusszytometrie bewertet, wie in diesem Video beschrieben. Dieses Diagramm zeigt eine relative Faltungsänderung in der Expression von VC PDE E 43 als Funktion von VC PDE E 43 transfiziert.

Die mittlere Fluoreszenzintensität der Venus in CFP-positiven Zellen, die durch die blauen Quadrate angezeigt wird, korrelierte mit der VCDE 43-Expression und stimmte mit den Expressionsniveaus überein, die durch die Bildanalyse eines Western Blots bestimmt wurden, was durch die roten Dreiecke angezeigt wird. Eine ähnliche mittlere CFP-Fluoreszenzintensität wurde bei den Proben beobachtet, wie durch die grünen Quadrate angezeigt, und wurde als Negativkontrolle verwendet, um Zellvariationen zu begrenzen. Diese Ergebnisse validieren die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Quantifizierung der ACAB LB C PDE 43-Wechselwirkung durch Messung der mittleren Fluoreszenzintensität von BSE e bei gleichzeitiger Bestimmung der richtigen Menge an BIC-Konstrukten, die für das Screening zur Kartierung von ACAP-LBC-Bindungsstellen innerhalb der PDE E 43 verwendet werden. BIC Analyse der ACAP LBC-Interaktion mit PDE E 43 fl in voller Länge.

Die UCR-Region eine Region von PDE 43 und UCR zwei und CAT-Regionen von PDE 43 wurden mit dieser Methode bewertet, wie hier zu sehen. Die Expression von vn ACAP LBC und VC PDE 43 UCR zwei plus CAT führt zu einem niedrigeren BC-Signal im Vergleich zu VC PDE 43 FL und VC PDE 43 UCR; eine ähnliche Proteinexpression wurde in allen Durchflussproben beobachtet und die mittlere Fluoreszenz wurde auf die relativen Expressionsniveaus von ACAP LBC, PDE 43 und alpha Tubulin normalisiert. Daher zeigt das normalisierte B-C-M-F-I, dass es keinen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen ACAP LBC PDE 43 FL und ACAP LBC PDE 43 UCR R eins gibt, aber ein viel geringeres Signal für ACAP LBC PDE 43 UCR zwei plus CAT-Wechselwirkung.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es mehrere Regionen in PDE 43 gibt, die mit ACAP LBC interagieren, und dass PDE 43 UCR R eins die primäre Region der Interaktion mit ACAP LBC ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Protein- und Proteininteraktion durch Durchflusszytometrie-Analyse von BP C untersuchen können. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die richtige Menge an BP C-Konstrukt zu bestimmen, die verwendet wird, um eine ähnliche Proteinexpression und lineare BP C-Reaktion zu erhalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Peptid oder Risiko durchgeführt werden, um zu bestimmen, für welche Aminosäuren innerhalb von PDE 40 D drei verantwortlich sind.

Seine ACAP-RBC-Wechselwirkungen.