Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Um die Interaktion zwischen zwei Proteinen zu testen, müssen die beiden Gene des Interesses mittels Gateway-Klonierungstechnik in unsere BF- und Vektoren kloniert werden. Diese Konstrukte werden in Agrobacterium GV3101 transformiert. Die GV3101-Bakterienkulturen, die die Konstrukte enthalten, werden gemischt und gemeinsam in die Blätter infiltriert.

Wenn die beiden Proteinkandidaten miteinander interagieren, kann das YFP-Signal mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet werden. Der Hauptzweck der BFC-Technik besteht darin, die Interaktion zwischen zwei Proteinen zu überprüfen. In vivo haben wir eine Reihe von Gateway-kompatiblen BFC- und IS-Zwei-Hybrid-Vektoren erstellt, die Forschern einfach zu handhabende Werkzeuge zur Durchführung sowohl von BFC- als auch von ISTO-Zwei-Hybrid-Assays bieten.

In diesem Video werden wir die einfache Handhabung unseres BFC-Systems demonstrieren. Um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen in einem unbe-Modus unabhängig vom Expressionssystem zu testen, müssen Sie zunächst die GV-3-1-0-1-Bakterienkultur vorbereiten.

Sie müssen eine einzelne Kolonie von Ihrer Platte entnehmen und in fünf ml YEB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum ansäen. Anschließend müssen Sie diese Kulturen über Nacht bei 28 Grad schütteln. Die Schüttelgeschwindigkeit beträgt 200 Umdrehungen pro Minute.

Die Bakterienkulturen sollten am nächsten Morgen bereit sein. Stellen Sie sicher, dass die Bakterien D überwucherten. Nehmen Sie die Kulturen aus dem Inkubator und überführen Sie jeweils ein männliches Exemplar jeder Kultur in ein steriles 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen.

Die Zentrifugenröhrchen in eine Tischzentrifuge geben. Die Bakterien bei 1000 G 10 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugieren, das Überstand entfernen. Anschließend das Pellet durch Zugabe eines Milliliters Infiltrationsmedium wieder aufnehmen und durch mehrmaliges Pipettieren resuspendieren.

Wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei Mal. Dies ist wichtig, da so Rückstände von Antibiotika im Bakterienmedium entfernt werden, die nach der Infiltration zu Schrumpfen der Pflanzen führen können. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie das Pellet in 0,5 ml Infiltrationsmedium und messen die Extinktion bei 600 nm der Bakteriensuspension mithilfe eines Spektralphotometers, wobei Infiltrationsmedium als Blindprobe dient.

Nach der OD-Messung müssen Sie den OD-Wert mit Infiltrationsmedium anpassen. Der endgültige OD-Wert sollte zwischen eins und 1,2 liegen. Bereiten Sie alle bakteriellen Suspensionen vor, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Übertragen Sie gleiche Mengen der Bakteriensuspensionen, die Ihren beiden Kandidatenproteinen entsprechen, und mischen Sie sie in einem neuen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Die Mischung der negativen Bakterien ist nun bereit zur Infiltration. Bereiten Sie alle Kombinationen vor und vergessen Sie nicht, eine negative Kontrolle einzuschließen. Verwenden Sie fünf bis sechs Wochen alte Pflanzen im besten Zustand für die Infiltration.

Sie können die Pflanzen aus dem Wachstumsraum entfernen und sie eine Stunde vor der Infiltration auf We-Nacht stellen, um die Stomata zu öffnen. Dies erleichtert den Infiltrationsprozess. Ziehen Sie etwa 100 Mikroliter Resus-suspendierte Bakterien auf.

Mischen Sie nahezu mit einer männlichen Spritze mit abgenommenem Nadelende. Setzen Sie die Spitze der Spritze an die Unterseite des Blattes. Stützen Sie die Oberseite des Blattes mit Ihrem Finger ab.

Drücken Sie im Allgemeinen den Kolben nach unten. Sie sollten sehen können, wie sich die Flüssigkeit durch die Blätter ausbreitet, da die Meso-dünnen Luftzwischenräume nach der Infiltration es ermöglichen, das infiltrierte A mit einem Markierstift zu kennzeichnen. Andernfalls werden Sie nach zwei Tagen nicht mehr in der Lage sein, das infiltrierte A zu identifizieren. Falls Sie mit verschiedenen Bakterienmischungen infiltrieren müssen, stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Handschuhe mit 50 %igem Ethanol besprühen oder zwischen den Infiltrationen die Handschuhe wechseln.

Versuchen Sie, einen ein Meter breiten Abstand zwischen den Infiltrationen zu lassen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die PFA-Signale sollten alle 24 Stunden ab der Infiltration über einen Zeitraum von bis zu fünf Tagen überwacht werden. Sie können zwei Überzüge unterschiedlicher Größe verwenden, um die Probe zu fixieren.

Zunächst einen Tropfen Miniwasser auf eine Nutabdeckungshülse geben. Dann ein kleines Stück Küchenpapier innerhalb der infiltrierten Zone abschneiden. Versuchen Sie, eine Übelkeit verursachende Ader in der Probe zu vermeiden.

Legen Sie das geschnittene Klingenpräparat in das Wasser auf dem Objektträger ab, decken Sie es mit einer kleineren Deckglasfolie ab und drücken Sie vorsichtig nach unten. Nun kann die Probe unter dem Mikroskop untersucht werden. Hier verwenden wir das NACA T CSS P zwei konfokale Mikroskop, um das BIFC-Signal sichtbar zu machen.

Sogar ein gewöhnlicher Scent-Mexico kann verwendet werden. Die konfokale Mikroskopie liefert bessere Bilder und kann schwache Signale nachweisen. Sie können den YFP-Parameter verwenden, um die VFC-Signale in diesem NCAs P zwei System zu detektieren.

Sie können einfach doppelt auf diese YFP-Voreinstellung hier klicken, wodurch automatisch die Anregung aktiviert und der Emissionsdetektionsbereich eingestellt wird. Wenn Sie ein anderes System verwenden, konsultieren Sie bitte die Bedienungsanleitung, um die Parameter korrekt zu setzen. Wir hoffen, dass Sie nach dem Ansehen dieses Videos in der Lage sein werden, die BFCE durchzuführen, um Protein-Protein-Interaktionen mithilfe des unbe MI Transcend-Expressionssystems zu testen.

Sie können dieses Verfahren auch auf Tabak- und AY-Pflanzen anwenden. Unsere BFC-Vektoren enthalten jeweils ein HA- und ein Flag-Tag, sodass Sie gegebenenfalls auch eine Co-IP durchführen können, um die Wechselwirkungen zu überprüfen.