Name: Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Protein-Wechselwirkungen in Pflanzen mit dem Gateway-kompatiblen BIFC-System untersuchen. Diese Methode nutzt gespaltenes YFP für die Echtzeit-Visualisierung in vivo.

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Wir bedanken uns bei Vi Nguyen für die Durchsicht des Manuskripts und allgemeine Labor Unterstützung.

1. Vorbereitung von Agrobacterium Kultur <ol><li> Agrobacterium-Stamm GV3101 zuvor mit Gateway kompatibel BIFC Vektor pEarleyGate201-YC und pEarleyGate202-YN, die jeweils eine Verschmelzung von GOI Konstrukt transformiert. </li><li> Impfen einer 5-ml YEB (5g L -1 Beef-Extrakt, 1g L -1 Hefeextrakt, 5 g L -1 Pepton, 5 g L -1 Saccharose, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) Kultur BIFC Fusionsprotein-Konstrukten transformiert Agrobacterium mit dem einer angemessenen Antibiotika-Auswahl. Wachsen Kultur über Nacht bei 28 ° C unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der Kultur in ein steriles 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet-Zellen bei 1.000 g für 10 min bei Raumtemperatur, Überstand verwerfen. </li><li> Waschen des Pellets durch Zugabe von 1 ml der Infiltration Medien (5 g L -1 D-Glucose, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM Acetosyringon) 11. Pellet durch Pipettieren, Pellet-Zellen wieder bei 1.000 g für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang zwei weitere Male. </li><li> Das Pellet in 0,5 ml Infiltration Medien. </li><li> Die Absorption bei 600 nm und passen endgültigen OD 600 bis 1,0 bis 1,2. </li><li> Aliquot einer gleichen Menge von Agrobacterium Suspension von jedem Konstrukt in ein neues 1,5-ml-Tube, Wirbel für 10 sek. Für eine einzelne Infiltration, ist 100 ul von jedem Konstrukt mehr als genug. </li><li> Die Agrobacterium-Gemisch ist nun bereit für die Infiltration. </li></ol> 2. Infiltration <ol start="11"><li> N. benthamiana Pflanzen werden bei 21 ° C gewachsen, mit 16-h Licht und 8-h Dunkel-Zyklen. Fünf bis sechs Wochen alten Pflanzen sollten für die Infiltration verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie Pflanzen aus dem Wachstum Raum und unter weißem Licht für 1 h vor infiltratring so dass die Spaltöffnungen vollständig zu öffnen. </li><li> Erstellen Sie resuspendiert Agrobakterium Mischung in eine 1-ml Slip-Spitze Tuberkulinspritze ohne Nadel auf. </li><li> Setzen Sie die Spitze der Spritze an die Unterseite des Blattes und sanft drücken Sie den Kolben, während die direkte Unterstützung der Oberseite des Blattes mit einem Finger. Die Flüssigkeit wird durch das Blatt diffuse, wie es die mesophyllar Lufträume füllt. </li><li> Beschriften Sie die infiltrierten Bereich mit einem Filzstift für die künftige Identifikation. </li><li> Wenn Infiltration mit unterschiedlichen Konstrukten, vergewissern Sie sich, um entweder Ihre Handschuhe oder reinigen Sie sie mit 70% Ethanol zwischen Infiltrationen. Wenn möglich, lassen Sie eine Mittelrippe zwischen verschiedenen Proben, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Legen Sie Pflanzen in Wachstum Kabinett unter normalen Wachstumsbedingungen. </li></ol> 3. Die Beobachtung des rekonstituierten YFP-Signal <ol start="18"><li> Excise einem 5mm x 5mm Segment Blattgewebe innerhalb der infiltrierten Zone </li><li> Montieren Sie die Probe im Wasser, auf einem Glasobjektträger, decken Sie die Probe mit einem Deckglas und untersuchen die Wechselwirkungen mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop oder. </li><li> Expression sollte alle 24 Stunden ab dem Zeitpunkt der Infiltration bis zu 5 Tage später beobachtet werden, wie Überexpression / Handel mit fluoreszierenden Fusionsproteinen Anzeige verschiedenen Orten über einen zeitlichen Verlauf führen kann. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für Protein-Protein-Interaktion durch BIFC Assay getestet wird in Abbildung 1 dargestellt. AtTHP1 und AtSAC3A werden geglaubt, um Komponenten der Arabidopsis-Homolog der Hefe TREX-2-Komplex. Sie können mit einem nuclearporin AtNUP1 interagieren und zu erleichtern mRNA Export 10. AtTHP1 und AtSAC3A wurden in pEarlyGate201-YC geklont während AtNUP1 in pEarlyGate202-YN geklont wurde. Die Konstrukte wurden anschließend in GV3101 transformiert. (; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) für die Infiltration der drei Konstrukte wurden mit 3 möglichen Kombinationen gepaart. Die rekonstituierte YFP-Signal wurde unter einem LCSM 48 Stunden nach der Infiltration beobachtet. Die Signale wurden in den epidermalen Zellen beobachtet und lokalisiert in der nuklearen Peripherie oder nuklearen Plasma, das im Einklang mit dem sub-zelluläre Lokalisation dieser Proteine ​​ist. Die negativen Kontrollen zeigten keine YFP-Signal. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Arabidopsis TREX-2-mRNA export komplexen Komponenten miteinander interagieren. N. benthamiana Blätter, mit Konstrukten des GOI cotransformiert fusioniert pEarleyGate201-YC und pEarleyGate202-YN (wie angegeben), wurden abgebildet 48-72 h nach der Infiltration mit einem Leica TCS SP2 confocol Mikroskop. Die Bilder werden als fusionierte konfokalen YFP und Hellfeld-Bilder von epidermalen N. gezeigt benthamiana Blattzellen

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
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<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

BIFC Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Protein-Interaktionen. Im Gegensatz zu den traditionellen Y2H Assay BIFC ermöglicht nicht nur die Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen, sondern bietet auch weitere Informationen des Protein-Komplexes, wie sub-zelluläre Lokalisation. Auch ist es möglich, indirekten Wechselwirkungen so lange zu erkennen, wie die beiden Kandidaten Proteine ​​nahe genug von einem dritten Partner gebracht werden. Wie jede Technologie hat BIFC seine Grenzen. Aufgrund der...

<table><tbody><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>1-mL-Spritze mit Schliffanschluss (Tuberkulinspritze)</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

detektion von protein-wechselwirkungen in plant mit einem gateway kompatibel bimolekularen fluoreszenz komplementation (bifc) system

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Wir haben eine BIFC Technik, um die Interaktion zwischen zwei Proteinen in vivo-Test entwickelt. Dies wird durch Aufteilung eines gelb fluoreszierenden Proteins (YFP) in zwei nicht-überlappenden Fragmenten durchgeführt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse geklont. Diese Konstrukte können dann in Nicotiana benthamiana werden via Agrobacterium vermittelte Transformation co-transformiert, die den Transit Expression von Fusionsproteinen. Die Rekonstitution von YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteine ​​1-7 interagieren. Um zu testen und zu validieren das Protein-Protein-Interaktionen können BIFC zusammen mit Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Assay verwendet werden. Dies kann erkennen indirekten Wechselwirkungen, die in der Y2H übersehen werden kann. Gateway-Technologie ist eine universelle Plattform, die Forschern die Shuttle-Gens von Interesse (GOI) in so viele Expression und funktionelle Analyse-Systeme wie möglich zu 8,9. Sowohl die Orientierung und Leserahmen können ohne Verwendung von Restriktionsenzymen oder Ligation zum Ausdruck bereit-Klone machen aufrechterhalten werden. Als Ergebnis kann man beseitigen alle Re-Sequenzierung Schritte, um konsistente Ergebnisse in den Experimenten zu gewährleisten. Wir haben eine Reihe von Gateway kompatibel BIFC und Y2H Vektoren, die Forscher stellen mit einfach zu bedienenden Tools zu führen sowohl BIFC und Y2H Assays 10 erstellt. Hier zeigen wir die einfache Nutzung unserer BIFC System zum Protein-Protein-Interaktionen in N. Test benthamiana Pflanzen.

Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Wir haben eine BiFC-Technik entwickelt, um die Interaktion zwischen zwei Proteinen in vivo zu untersuchen. Dies wird durch die Aufspaltung eines gelben Fluoreszenzproteins erreicht ...

Um die Interaktion zwischen zwei Proteinen zu testen, müssen die beiden Gene des Interesses mittels Gateway-Klonierungstechnik in unsere BF- und Vektoren kloniert werden. Diese Konstrukte werden in Agrobacterium GV3101 transformiert. Die GV3101-Bakterienkulturen, die die Konstrukte enthalten, werden gemischt und gemeinsam in die Blätter infiltriert.Wenn die beiden Proteinkandidaten miteinander interagieren, kann das YFP-Signal mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet werden. Der Hauptzweck der BFC-Technik besteht darin, die Interaktion zwischen zwei Proteinen zu überprüfen. In vivo haben wir eine Reihe von Gateway-kompatiblen BFC- und IS-Zwei-Hybrid-Vektoren erstellt, die Forschern einfach zu handhabende Werkzeuge zur Durchführung sowohl von BFC- als auch von ISTO-Zwei-Hybrid-Assays bieten.In diesem Video werden wir die einfache Handhabung unseres BFC-Systems demonstrieren. Um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen im unbe-Manier-Expressionssystem zu testen, müssen Sie zunächst die GV 3 1 0 1-Bakterienkultur vorbereiten.Sie müssen eine einzelne Kolonie von Ihrer Platte entnehmen und in fünf ml YEB-Medium mit dem geeigneten Antibiotikum ansetzen. Anschließend müssen Sie diese Kult

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Dieser Artikel veranschaulicht, wie man richtig mit dem BioRad Helios Gene Gun, um Plasmid-DNA in Zwiebel Epidermiszellen einzuführen und wie man für Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebel-Zellen auf dem Prinzip der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) basierter...

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Dieses Manuskript beschreibt ein einfache und schnelles experimentelles Verfahren für die Bestimmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die basierend auf der Messung der Luciferase-Aktivität.

Luciferase Komplementierung Imaging Assay in Nicotiana Benthamiana Blätter für Transient Bestimmung Proteinprotein Interaktion Dynamik

Wir entwickelten eine neuartige Methode zur Co mehrere Chimären fluoreszierende Fusionsproteine in Anlagen zur Überwindung der Schwierigkeiten von konventionellen Methoden zum Ausdruck zu bringen. Es nutzt die Vorteile der Verwendung einer einzigen Ausdruck Plasmid, das enthält mehrere funktionell unabhängig Protein mit dem Ausdruck Kassetten um Co Proteinexpression zu erreichen.

Co Ausdruck von mehreren Chimären fluoreszierende Fusionsproteinen in effizienter Weise in Pflanzen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.

In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Hier stellen wir eine Methode zur Visualisierung der ternären Komplexbildung zwischen drei Proteinpartnern unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Proteine durch BiFC-basierten FRET-FLIM-Assay vor. Diese Methode ist wertvoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionskomplexen in vivo.

Bestimmung der dreigliedrigen Wechselwirkung zwischen zwei Monomeren eines MADS-Box-Transkriptionsfaktors und eines Calcium-Sensorproteins mittels BiFC-FRET-FLIM-Assay

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung des Proximity-Labeling-Experiments (PL) in Gurken (Cucumis sativus L.) unter Verwendung AT4G18020 (APRR2)-AirID-Proteins als Modell vor. Die Methode beschreibt die Konstruktion eines Vektors, die Transformation eines Konstrukts durch Agroinfiltration, Biotininfiltration, Proteinextraktion und die Reinigung von Biotin-markierten Proteinen durch Affinitätsreinigungstechnik.

AirID-basierte Proximity-Markierung für Protein-Protein-Interaktion in Pflanzen

Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Hier wird ein FRET-Protokoll vorgestellt, um die Assoziation von Histon-modifizierenden Enzymen mit Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die sie zu den Zielpromotoren für die epigenetische Regulation der Genexpression in Pflanzengeweben rekrutieren.

Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren in vivo durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer

Erfahren Sie, wie Sie Protein-Wechselwirkungen in Pflanzen mit dem Gateway-kompatiblen BIFC-System untersuchen. Diese Methode nutzt gespaltenes YFP für die Echtzeit-Visualisierung in vivo.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System (Video) | JoVE Journal

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

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