Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System
September 16th, 2011
Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.
Um die Interaktion zwischen zwei Proteinen zu testen, müssen die beiden interessierenden Gene mit Hilfe der Gateway-Longing-Technik in unsere BF und Vektoren kloniert werden. Diese Konstrukte werden in das Luftlicht GV 3 1 0 1 umgewandelt. Die zu konstruierenden GV 3 1 0 1 Bakterienkulturen werden gemischt und in die Blätter cofiltriert.
Wenn die beiden Kandidatenproteine miteinander interagieren, kann das YFP-Signal mit Hilfe des ergebnisfokalen Mexikos beobachtet werden. Der Hauptzweck der BFC-Technik besteht darin, die Interaktion zwischen zwei Proteinen zu testen. In vavo haben wir eine Reihe von Gateway-kompatiblen BFC- und IS-Zwei-Hybrid-Vektoren entwickelt, die Forschern einfach zu bedienende Werkzeuge zur Durchführung von BFC- und ISTO-Hybrid-Assays an die Hand geben.
In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie einfach es ist, unser BFC-System zu verwenden. Um das Protein zu testen, transzendieren Proteininteraktionen auf unmögliche Weise das Expressionssystem. Zuerst müssen Sie die Bakterienkultur GV 3 1 0 1 vorbereiten.
Sie müssen eine einzelne Kolonie von Ihrem Teller nehmen und fünf Männchen des YEB-Mediums mit geeigneten Antibiotika impfen. Dann müssen Sie diese Kulturen über Nacht bei 28 Grad schütteln. Die Geschwindigkeit beträgt 200 Durchläufe pro Minute.
Die Bakterienkulturen sollten am nächsten Morgen fertig sein. Stellen Sie sicher, dass das Bakterium D überwachsen ist. Nehmen Sie die Kulturen aus dem Inkubator und überführen Sie ein Männchen jeder Kultur in ein steriles Zentrifugenröhrchen mit 1,5 Männchen.
Setzen Sie die Zentrifugenröhrchen in eine Desktop-Zentrifuge ein. Schleudern Sie die Bakterien bei 1000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur ein, entsorgen Sie das Netz. Beobachten Sie dann den Penat, indem Sie eine Mahlzeit Infiltrationsmedium hinzufügen und die Neubewertung durch pro Petting einige Male.
Wiederholen Sie den Waschschritt noch zwei weitere Male. Dies ist wichtig, da es hilft, die Spuren von Antibiotika im Bakterienmedium zu entfernen, die nach der Infiltration zu Pflanzendichtungen führen. Nach der letzten Wäsche wird die Palette in 0,5 männlichen Infiltrationsmedien mit 600 dieser Bakteriensuspensionen mit einem Spektralphotometer unter Verwendung eines Infiltrationsmediums als Bankkontrolle aufgehängt.
Nach der OD-Messung müssen Sie den OD mit Hilfe eines Infiltrationsmediums einstellen. Der endgültige OD sollte zwischen eins und 1,2 liegen. Sie sollten alle Bakteriensuspensionen vorbereiten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Übertragen Sie die gleiche Menge an Bakteriensuspensionen, die Ihren beiden Kandidatenproteinen entsprechen, und mischen Sie sie in ein neues 1,5-männliches Röhrchen. Negative Bakterienmischung ist jetzt mit Infiltrat verwandt. Bereiten Sie alle Kombinationen vor und vergessen Sie nicht, eine Negativkontrolle einzuschließen. Sie sollten fünf bis sechs Wochen Code und die beste Art und Weise Pflanzen für die Infiltration verwenden.
Sie können die Pflanzen aus dem Anbauraum nehmen und sie eine Stunde lang auf die Nacht stellen, bevor sie infiltrieren, um den Sturmangriff zu öffnen. Dies wird den Infiltrationsprozess unterstützen. Ziehen Sie etwa 100 Mikroliter Resus-suspendierte Bakterien auf.
Mischen Sie in der Nähe einer männlichen Spritze mit verrutschter Spitze ohne Nadel. Legen Sie die Spitze der Spritze gegen die Unterseite des Blattes. Stützen Sie die Oberseite des Knies mit dem Finger ab.
Drücken Sie in der Regel auf den Kolben. Du solltest in der Lage sein, die Flüssigkeit durch das Blatt diffundieren zu sehen, während du die Meso-dünneren Lufträume nach der Infiltration spürst, die die infiltrierte Aero mit einem Markierungsstift aktivieren. Andernfalls können Sie nach zwei Tagen das infiltrierte A nicht mehr identifizieren.Wenn Sie mit einer anderen Bakterienmischung infiltrieren müssen, stellen Sie sicher, dass Sie Ihren Handschuh mit 50% Ethanol besprühen oder Ihre G-Handschuhe zwischen Infiltrationen wechseln.
Versuchen Sie, einen Rippenabstand von einem Meter zwischen den Infiltrationen zu lassen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Die PFA-Signale sollten alle 24 Stunden nach der Infiltration bis zu fünf Tage überwacht werden. Sie können zwei Abdeckhüllen in verschiedenen Größen verwenden, um die Probe zu halten.
Geben Sie zuerst einen Tropfen Mini-Wasser auf eine Abdeckhülle mit Kerbe. Schneiden Sie dann ein kleines Stück Messergewebe in die infiltrierte Zone. Versuchen Sie, Übelkeit zu vermeiden Venen in der Probe.
Legen Sie das abgeschnittene Messertuch in das Wasser auf der Rutsche Unter setzen Sie es ab, decken Sie es mit einer kleineren Strömungshülse ab und drücken Sie es leicht an. Nun kann die Probe im Rahmen des mexikanischen Teleskops betrachtet werden. Hier verwenden wir dieses NACA T CSS P two konfokale Mexiko, um das BIFC-Signal zu visualisieren.
Sogar normaler Duft Mexico kann verwendet werden. Konfokal liefert bessere Bilder und erkennt schwache Signale. Sie können den YFP-Parameter verwenden, um die VFC-Signale in diesem NCAs P two-System zu erkennen.
Sie können hier einfach auf diese YFP-Voreinstellung doppelklicken, wodurch die Anregung automatisch eingeschaltet und der Emissionserkennungsbereich eingestellt wird. Wenn Sie ein anderes System verwenden, lesen Sie bitte im Handbuch nach, wie Sie die Parameter richtig einstellen können. Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos in der Lage sein sollten, die BFCE durchzuführen, um Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dem unbe MI Transcend-Expressionssystem zu testen.
Sie können dieses Verfahren auch auf Tabak- und AY-Pflanzen anwenden. Unsere BFC-Vektoren enthalten auch ein HA- bzw. ein Flag-Tag, sodass Sie bei Bedarf auch co-IP durchführen können, um die Interaktionen zu validieren.
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Überblick
Diese Studie präsentiert eine neuartige Technik zum Testen von Protein-Protein-Interaktionen in Pflanzen unter Verwendung eines gespaltenen gelben fluoreszierenden Proteins (YFP) Ansatzes. Durch das Klonen von YFP-Fragmenten in-frame mit interessierenden Genen können Forscher die YFP-Rekonstitution beobachten, was auf Protein-Interaktionen hinweist.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Pflanzenbiologie
- Protein-Interaktionen
- Fluoreszierende Proteintechniken
Hintergrund
- Das Verständnis von Protein-Interaktionen ist entscheidend für die Aufklärung biologischer Prozesse.
- Traditionelle Methoden sind möglicherweise nicht für Pflanzensysteme geeignet.
- Die gespaltene YFP-Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung von Interaktionen.
- Gateway-Klonierung erleichtert den Aufbau von Fusionsproteinen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer effizienten Methode zum Studium von Protein-Interaktionen in Pflanzen.
- Bereitstellung von Werkzeugen für Forscher zur Durchführung von BFC- und ISTO-Two-Hybrid-Assays.
- Verbesserung des Verständnisses von Proteinfunktionen in der Pflanzenbiologie.
Verwendete Methoden
- Klonierung von YFP-Fragmenten in Gateway-kompatible Vektoren.
- Transformation von Konstrukten in Agrobacterium GV3101.
- Co-Infiltration von Bakterienkulturen in Pflanzenblätter.
- Beobachtung des YFP-Signals mittels Mikroskopie zur Bestätigung von Interaktionen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Rekonstitution des YFP-Signals zeigt Protein-Interaktionen an.
- Demonstration der Wirksamkeit der BFC-Technik in Pflanzensystemen.
- Bereitstellung benutzerfreundlicher Werkzeuge für Forscher.
- Validierung der Methode durch verschiedene Proteinpaare.
Schlussfolgerungen
- Die gespaltene YFP-Technik ist ein wertvolles Werkzeug zum Studium von Protein-Interaktionen in Pflanzen.
- Diese Methode kann weitere Forschung in der Pflanzenbiologie erleichtern.
- Zukünftige Anwendungen können die Erforschung komplexer Proteinnetzwerke umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
