Bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung zur Isolierung von zwei interagierenden Proteinen
JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Biologische Techniken
0 Aufrufe • 4:29 Min. • July 8th, 2025
Um ein Paar spezifisch interagierender Proteine mittels bimolekularer Komplementationsaffinitätsreinigung nachzuweisen und zu isolieren, fügen Sie ein Paar bimolekularer Fluoreszenz-Komplementationsplasmide-Transfektionsmittel-Mischung in eine Kulturplatte mit Säugetierzellen hinzu.
Ein Plasmid kodiert für ein interagierendes Protein - das Köderprotein -, das mit einem fluoreszierenden Reporterproteinfragment fusioniert ist. Das andere Plasmid kodiert für das andere Bindungsprotein - das Beuteprotein -, das mit dem komplementären Fragment des fluoreszierenden Proteins fusioniert ist.
ausbrüten. Das Transfektionsmittel erleichtert die zelluläre Aufnahme von Plasmiden. Erfolgreich transfizierte Zellen exprimieren zellmembranlokalisierte Proteine.
Die Wechselwirkungen der Köder-Beute-Proteine bringen die fluoreszierenden Proteinfragmente einander näher. Dadurch verschmelzen und falten sich die Fragmente wieder zusammen, wodurch das funktionelle fluoreszierende Protein entsteht, dessen Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden kann.
Ersetzen Sie das Medium durch einen nichtionischen, detergenziösen Lysepuffer, um die Zellmembranen aufzubrechen und die Fusions
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