Bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung zur Isolierung von zwei interagierenden Proteinen

Um ein Paar spezifisch interagierender Proteine mittels bimolekularer Komplementationsaffinitätsreinigung nachzuweisen und zu isolieren, fügen Sie ein Paar bimolekularer Fluoreszenz-Komplementationsplasmide-Transfektionsmittel-Mischung in eine Kulturplatte mit Säugetierzellen hinzu.

Ein Plasmid kodiert für ein interagierendes Protein - das Köderprotein -, das mit einem fluoreszierenden Reporterproteinfragment fusioniert ist. Das andere Plasmid kodiert für das andere Bindungsprotein - das Beuteprotein -, das mit dem komplementären Fragment des fluoreszierenden Proteins fusioniert ist.

ausbrüten. Das Transfektionsmittel erleichtert die zelluläre Aufnahme von Plasmiden. Erfolgreich transfizierte Zellen exprimieren zellmembranlokalisierte Proteine.

Die Wechselwirkungen der Köder-Beute-Proteine bringen die fluoreszierenden Proteinfragmente einander näher. Dadurch verschmelzen und falten sich die Fragmente wieder zusammen, wodurch das funktionelle fluoreszierende Protein entsteht, dessen Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden kann.

Ersetzen Sie das Medium durch einen nichtionischen, detergenziösen Lysepuffer, um die Zellmembranen aufzubrechen und die Fusionsproteine freizusetzen. Sammeln Sie das Zelllysat in einem Röhrchen. Zentrifuge.

Den Fusionsprotein-haltigen Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Fügen Sie Agarosekügelchen hinzu, die mit dem fluoreszierenden Protein-Targeting-Einzeldomänen-Antikörper Nanobody konjugiert sind, der ein dreidimensionales Epitop auf dem gefalteten fluoreszierenden Protein erkennt und an es bindet.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Fusionsprotein-gebundenen Agarosekügelchen in Puffer. Erhitzen, um Fusionsproteine von den Agarosekügelchen zu dissoziieren. Führen Sie SDS-PAGE durch, um einzelne Proteine zu trennen, gefolgt von Western Blot mit Antikörpern, die spezifisch für die fluoreszierenden Proteinfragmente sind.

Es werden nur interagierende Proteine nachgewiesen, die mit fluoreszierenden Fragmenten markiert sind, was ihre Isolierung bestätigt.

Zuerst wird die HEK293T Zellen in 10-Zentimeter-Schalen mit 10 Millilitern DMEM gesät. Verdünnen Sie dann 2,5 Mikrogramm jedes bimolekularen Fluoreszenz-Komplementationsvektors in 500 Mikrolitern Transfektionspuffer.

Fügen Sie 10 Mikroliter des Transfektionsreagenzes hinzu und wirbeln Sie die Mischung 10 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie die Proben dann kurz und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Als nächstes gibst du die DNA-Transfektionsmischung tropfenweise in die Schüssel. Inkubieren Sie die Proben dann 8 bis 24 Stunden lang.

Bereiten Sie den Zelllysepuffer und den ergänzten Zelllysepuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 Milliliter eiskalten Zelllysepuffer hinzu.

Stellen Sie dann die Schüssel auf Eis und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Verwenden Sie dann einen Zellschaber, um die Zellen zu entfernen und in ein gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei der 18.000-fachen Schwerkraft, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie dann den klaren Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.

Waschen Sie eine angemessene Menge Agarosekügelchen in 1 Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie dann die Kügelchen bei der 300-fachen Schwerkraft und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie dann 20 Mikroliter Agarosekügelchen zu jeder Probe und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 4 Grad Celsius mit End-to-End-Rotation.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 300-facher Schwerkraft und waschen Sie sie dreimal in Zelllysepuffer. Anschließend werden die gewaschenen Kügelchen in 50 Mikrolitern verdünntem Probenpuffer resuspendiert. Zum Schluss erhitzen Sie die Proben zwei bis drei Minuten lang auf 95 Grad Celsius.