Gromer Nachweis von Biomarkern mithilfe einer molekularen Prägung basierte kapazitive Biosensor

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Biomoleküle mit geringen Häufigkeiten in hochkomplexen Proben mit hoher Empfindlichkeit, Einfachheit, geringen Kosten und Geschwindigkeit und ohne Verwendung von Markierung zu detektieren und zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Biotechnologie, Biochemie und Biomedizin zu beantworten, wie z. B. Umweltüberwachung, Lebensmittelsicherheit, Trinkwasserqualität und medizinische Diagnose. Die Hauptvorteile dieser Technik sind ihre inhärente Schnelligkeit, Einfachheit, hohe Empfindlichkeit, niedrige Kosten, einfache Manipulation und Echtzeit-Detektion ohne Verwendung von Markierungsreagenzien.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Krankheiten, da sie in der Lage ist, wenig häufig vorkommende Biomoleküle zu quantifizieren. Zum Beispiel verschiedene Biomarker in Echtzeit. Um die Glasdeckgläser zu reinigen, tauchen Sie sie 10 Minuten lang in 10 Milliliter 1,0 molare HCl in einen Ultraschallreiniger bei Raumtemperatur.

Tauchen Sie sie dann unter den gleichen Bedingungen in entionisiertes Wasser und 1,0 molare Natriumhydroxide. Trocknen Sie die Glasdeckgläser mit Stickstoffgas. Tauchen Sie dann die sauberen und getrockneten Deckgläser eine Stunde lang in 10 Milliliter einer APTES-Lösung, um bei Raumtemperatur Aminogruppen auf die Deckglasoberfläche zu bringen.

Spülen Sie die Deckgläser mit entionisiertem Wasser ab, bevor Sie sie wieder mit Stickstoffgas trocknen. Tauchen Sie die modifizierten Deckgläser von APTES zwei Stunden lang in eine 10-Milliliter-Lösung von Glutaraldehyd, um die Aminogruppen auf der Oberfläche bei Raumtemperatur zu aktivieren. Spülen Sie die Deckgläser nach der Inkubation mit 10 Millimolar Phosphatpuffer ab, um überschüssiges Glutaraldehyd von der Oberfläche zu entfernen.

Trocknen Sie die Deckgläser mit Stickstoffgas. Bereiten Sie anschließend 1,0 Milliliter Matrizenlösung in 10 Millimolar Phosphatpuffer in einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter vor. Geben Sie 200 Mikroliter dieser Schablonenlösung auf die modifizierten Deckgläser und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Um die Elektroden zu reinigen, tauchen Sie die Elektroden zunächst in ein kleines Becherglas mit fünf Millilitern 70%igem Ethanol für 10 Minuten in einen Ultraschallreiniger bei Raumtemperatur. Tauchen Sie dann die Elektroden nacheinander unter den gleichen Bedingungen in deionisiertes Wasser, Aceton, deionisiertes Wasser, saure Piranha-Lösung und deionisiertes Wasser. Trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas.

Um die Elektropolymerisation von Tyramin durchzuführen, bereiten Sie acht Milliliter 10 Millimolare Tyraminlösung in 10 Millimolar Phosphatpuffer vor, der zwei Milliliter Ethanol enthält. Führen Sie in dieser Lösung 15 Zyklen zyklischer voltammetrischer Scans mit einem Potentiostaten durch, der einen Potentialbereich von null bis 1,5 Volt und eine Abtastrate von 50 Millivolt pro Sekunde abdeckt. Spülen Sie dann die Elektroden mit entionisiertem Wasser, bevor Sie die Elektroden mit Stickstoffgas trocknen.

Tauchen Sie die Elektroden über Nacht bei Raumtemperatur in eine Lösung, die 30 Millimolare Acryloylchlorid und 30 Millimolare Trimethylamin in Toluol enthält, bevor Sie die Elektroden erneut spülen und trocknen. Vor der Polymerisation ist eine Monomerlösung herzustellen, die Monomere und Vernetzer in 820 Mikrolitern Reinstwasser enthält. Bereiten Sie dann 5 % Volumen zu Volumen TEMED in ultrareinem Wasser vor.

Geben Sie 20 Mikroliter der TEMED-Lösung in die Monomerlösung und spülen Sie sie fünf Minuten lang mit Stickstoffgas. Geben Sie dann 20 Mikroliter frisch zubereitetes APS in die Monomerlösung. Pipettieren Sie 1,5 Mikroliter der Monomerlösung auf die modifizierte Goldelektrodenoberfläche.

Beginnen Sie nun mit der Polymerisation, indem Sie den Matrizenstempel mit der mit dem Monomer behandelten Oberfläche in Kontakt bringen und fünf Stunden lang bei Raumtemperatur ruhen lassen. Entfernen Sie nach der Polymerisation den Schablonenstempel vorsichtig mit einer Pinzette von der Oberfläche. Spülen Sie anschließend die Elektrode mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas.

Tauchen Sie die Elektroden zwanzig Minuten lang in einen Milliliter von zehn Millomer eines Dodecanetheols, das in Ethanol hergestellt wurde, um Nadellöcher auf der Elektrodenoberfläche abzudecken. Spülen Sie abschließend die Elektroden mit entionisiertem Wasser und trocknen Sie die Elektroden mit Stickstoffgas, bevor Sie ihre Oberflächen mit der Rasterelektronenmikroskopie charakterisieren. Setzen Sie die aufgedruckten kapazitiven Goldelektroden in die elektrochemische Durchflusszelle ein, die in einen kapazitiven Biosensor integriert ist.

Bereiten Sie 100 Milliliter Regenerationspuffer und einen Liter Laufpuffer vor. Beginnen Sie die Analyse mit der Injektion des Regenerationspuffers, um das System zu regenerieren, und dem laufenden Puffer, um das System für 25 Minuten wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Bereiten Sie Standard-Template-Lösungen im gewünschten Konzentrationsbereich im laufenden Puffer vor.

Anschließend spritzen Sie nacheinander und unter optimalen Bedingungen 250 Mikroliter dieser Standardlösungen in das System ein. Die Oberflächencharakterisierung der Goldelektroden erfolgt mittels Rasterelektronenmikroskopie. Zu sehen ist die blanke Goldoberfläche.

Ebenfalls zu sehen sind Bakteriophagen, die in verschiedenen Vergrößerungen an der Elektrodenoberfläche haften. Hier ist die Echtzeit-Bindung von Bakteriophagen an die aufgedruckte Goldelektrode durch ein Sensogramm zu sehen. Eine stabile Basislinie wird nach der Regeneration und Wiederherstellung des Gleichgewichts des Systems vor der Injektion der Probe etabliert.

Auf der Elektrode befinden sich phagenspezifische Hohlräume. Die Injektion der probeninduzierenden Bakteriophagen führt zu einer reduzierten Kapazität, da die Zielbakteriophagen an die geprägten Hohlräume auf der Oberfläche der Goldelektroden binden. Kalibrierungskurven zeigen die sich ändernde Kapazität im Vergleich zur Proteininjektion bei der Bakteriophagen-Injektion.

Aus den Gleichungen in diesen Diagrammen ist es möglich, die Konzentration von Bakteriophagen oder Proteinen in einer Probe zu berechnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein hochempfindliches, schnelles Echtzeit-Erkennungssystem entwickelt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden und dreißig Minuten durchgeführt werden, ohne die Wartezeiten dazwischen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, alle Wirkstoffe frisch am selben Tag zuzubereiten. Nach diesem Verfahren können andere Metriken wie Rasterkraftmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie, Ellipsometer und Quantenwinkelmessungen durchgeführt werden, um festzustellen, ob die Polymerisation oder Prägung erfolgreich war, und um einen signifikanten Unterschied zwischen den Oberflächen von blanken und geprägten Goldelektroden zu erkennen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biochemie, Biotechnologie und Biomedizin, um einen hochempfindlichen Nachweis eines Biomoleküls in der Lebensmittelsicherheit und medizinischen Diagnose zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit funktionellen Monomeren, Vernetzern, Initiatoren und anderen Wirkstoffen äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieser Experimente sollten jedoch immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und die Durchführung von Polymerisationsexperimenten im Abzug getroffen werden.