Beurteilung Differenzen in Sperm Wettbewerbsfähigkeit in Drosophila

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Unterschiede in der Konkurrenzfähigkeit der Spermien bei Drosophila, Melanogaster-Männchen mit unterschiedlichen Genotypen, zu testen. Dies wird durch die Verfolgung sichtbarer genetischer Marker erreicht, die die Vaterschaft der Nachkommen von einem mit zwei verschiedenen Männchen verpaarten Weibchen identifizieren, Genotypen im Assay dürfen sich Weibchen zuerst mit einem Referenzmännchen paaren und dann mit einem experimentellen Männchen paaren. Der Anteil der Nachkommen, die vom Versuchsmännchen gezeugt wurden, wird durch Untersuchung der Augenfärbung der Nachkommen abgeleitet.

Die Ergebnisse vergleichen indirekt die Konkurrenzfähigkeit der experimentellen männlichen Spermien anhand ihrer relativen Leistung zu den männlichen Referenzspermien. Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Genetik und Evolution in der Biologie zu beantworten, wie z.B. die Bewertung des Einflusses eines genetischen Faktors auf die SPR-Wettbewerbsfähigkeit. Das folgende Protokoll veranschaulicht die Analyse eines genetischen Faktors namens sic, der vermutlich für ein Protein kodiert, das an der Beweglichkeit der Spermien beteiligt ist.

Beginnen Sie damit, 15 bis 20 Fläschchen für jedes Fläschchen aufzustellen. Bestreuen Sie das Medium leicht mit ein paar getrockneten aktiven Hefepellets. Um die Position zu erleichtern.

Verwenden Sie immer frische Nährmedien wie z. B. ein Maismehl-Hefemedium. Fügen Sie dann zu jedem Fläschchen acht bis 10 weibliche Tiere hinzu, aber nicht mehr, und fügen Sie fünf männliche hinzu. Die Geschlechtsbestimmung kann durch visuelle Inspektion einiger morphologischer Unterschiede erreicht werden.

Lagern Sie die Fläschchen bei 25 Grad Celsius und füllen Sie die Erwachsenen mindestens alle drei bis fünf Tage in neue Fläschchen um. Übertragen Sie die Erwachsenen jeden zweiten Tag, um das beste Ergebnis zu erzielen. Bewahren Sie die mit dem Ei enthaltenen Fläschchen auf, um die Nachkommen zu ernten.

Die Anzahl der benötigten Fläschchen hängt von der Anzahl der experimentellen männlichen Typen in der Studie und der geschätzten Anzahl von Individuen ab, die für die statistische Aussagekraft benötigt werden. Vergrößern Sie vier oder fünf Tage nach dem Transfer der Eltern aus einer Durchstechflasche die verfügbare Fläche für die Verpuppung in der Durchstechflasche, indem Sie ein mehrfach gefaltetes Papier in das Medium einführen. Untersuche die Fläschchen auf abgedunkelte Puppen, wenn sie sichtbar sind.

Diese Fliegen schlüpfen innerhalb von 24 Stunden, 11 bis 12 Tage nachdem die Kreuzung zum ersten Mal aufgestellt wurde. Beginne mit der Ernte jungfräulicher Weibchen und naiver Männchen aus diesen Fläschchen. Werfen Sie morgens als erstes Fliegen weg, die über Nacht geschlüpft sind.

Sammeln Sie dann ein- bis zweimal am Tag im Abstand von vier bis sechs Stunden Fliegen aus den Fläschchen und betäuben Sie die Fliegen, indem Sie Kohlendioxid in das Fläschchen einführen. Tippen Sie dann auf die Fliegen und bestimmen Sie sie unter dem Stereomikroskop. Legen Sie die gewünschten Fliegen je nach Geschlecht und Phänotyp in verschiedene Fläschchen und beschriften Sie die Fläschchen entsprechend.

Beladen Sie die Durchstechflaschen nicht mit mehr als 10 möglichen. Jungfräuliche Weibchen stellen bei den Fliegen einen 12 bis 12 hellen Dunkelzyklus ein, um ihre Okklusionszeit zu Ihrem Vorteil zu regulieren. Die Spitzenzeiten der Okklusion treten ein bis zwei Stunden nach der subjektiven Morgendämmerung und zwei Stunden vor dem Ausschalten des Lichts auf.

Es gibt zwei Versionen dieses Experiments. Sie werden als Offense-Assay und Defense-Assay bezeichnet. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Sie den Offense-Assay am Morgen des ersten Tages durchführen und die erste Paarung mit einem Aspirator einrichten.

Ein Aspirator besteht aus einem Stück Schlauch, der an einer Pipettenspitze befestigt ist und in der sich eine Barrikade befindet, die die aspirierten Fliegen in der Spitze hält. Die Bohrung der Spitze wird verbreitert. Für die Fliegen stellten sie Fläschchen mit zehn vier- oder fünftägigen jungfräulichen Weibchen auf.

Mit 10 naiven Referenzmännchen stellten sie an fünf aufeinanderfolgenden Tagen täglich zwei bis drei solcher Fläschchen auf. Lassen Sie die Fliegen für jedes Fläschchen zwei Stunden lang paaren, entsorgen Sie dann die Referenzmännchen und setzen Sie jedes Weibchen mit einem Aspiratoretikett in ein neues Fläschchen um und lassen Sie das Weibchen zwei Tage lang in der Durchstechflasche. Bereiten Sie am dritten Tag die zweite Paarung mit naiven Männchen des anderen Genotyps für jedes Weibchen vor.

Verwenden Sie zwei Stunden vor Einbruch der Dunkelheit einen Aspirator, um das Weibchen in ein neues Fläschchen mit drei, fünf oder sechs Tage alten Versuchsmännchen desselben Genotyps zu übertragen. Beschriften Sie die Fläschchen mit dem männlichen Genotyp und beschriften Sie das neue Fläschchen V zwei. Am nächsten Morgen ist Tag vier.

Zwei Stunden bevor die Fliegen subjektiv fliegen, verwerfen die Morgendämmerung die Männchen mit Hilfe des Aspirators. Übertragen Sie am sechsten Tag jedes Weibchen in ein anderes neues Fläschchen mit der Aufschrift V drei. Am 10. Tag werfen Sie die Weibchen am 17. Tag zurück.

Untersuchen Sie die V one Fläschchen von den Nachkommen. Bestimmen Sie, ob das Weibchen jungfräulich war oder nicht, als es mit der Referenzpost gepaart wurde, und ob es sich mit der Referenzpost paarte. Am selben Tag inspizierst du die Nachkommen aus den beiden V-Fläschchen, indem du die Fliegen mit Kohlenstoff niederschlägst.

Sortieren Sie sie nach Augenfarbe und Geschlecht. Notieren Sie dann die Anzahl der Nachkommen, die vom ersten und zweiten Männchen gezeugt wurden. In diesem Versuch können nur weibliche Nachkommen eindeutig zugeordnet werden, wie sie von der Referenz oder den Versuchsmännchen angegeben werden.

In anderen Experimenten konnten auch verschiedene genetische Marker verwendet werden, um die Vaterschaft der männlichen Nachkommen zu bestimmen. Entsorgen Sie die untersuchten Nachkommen, aber bewahren Sie die V zwei Fläschchen für eine Sekunde auf. Inspektion an Tag 20, die Vaterschaft der Nachkommen aus den beiden V-Fläschchen ein zweites Mal erfassen und die erste Inspektion der aus den drei V-Fläschchen hervorgegangenen Nachkommen durchführen.

Dann, drei Tage später, an Tag 23, inspizieren Sie die geschlüpften Nachkommen in V drei. Auch hier sollten die erfassten Nachkommenzahlen für eine einfache visuelle Inspektion und effiziente Analyse mit einem Statistikpaket für jedes Weibchen und den Zählungen von V zwei und V drei angemessen organisiert werden. Zur Berechnung der Gesamtzahl der Nachkommen des Referenzmännchens und des Versuchsmännchens ist der P 2-Wert für jedes Weibchen als das Verhältnis der Nachkommen des Versuchsmännchens zu den Nachkommen sowohl des Versuchsmännchens als auch des Referenzmännchens zu berechnen.

Einige weibliche Tiere müssen von der Analyse ausgeschlossen werden. Zuerst diejenigen, die keine oder nur sehr begrenzte Nachkommen hatten, zweite Weibchen, die während des Eingriffs starben, und dritte Weibchen, die nur von einem der beiden Männchen erfolgreich befruchtet wurden. Achten Sie auf statistische Unterschiede in den Werten von P two.

Bei den experimentellen männlichen Typen werden parametrische oder nicht-parametrische Tests verwendet, die auf der Schiefe der P-Zwei-Werte-Verteilung und der Abhängigkeit zwischen der Varianz und dem mittleren Anteil basieren. Daten sind in der Regel nicht normalverteilt. Die Bogenzeichentransformation, auch als Winkeltransformation bekannt, kann auf die ursprünglichen P-Werte zwei vor dem T-Test eines Schülers oder einem NOVA-Test angewendet werden oder einfach nicht-parametrische Tests wie WIL Coxin zwei Offensivexperimente mit Drosophila melanogaster verwenden.

Experimentelle Männchen wurden mit und ohne funktionsfähigen ESIC-Cluster durchgeführt. Insgesamt waren 58 % bis 83 % der Frauen informativ. Männchen ohne funktionellen ESIC-Cluster zeigten signifikant niedrigere P-2-Werte im Vergleich zu Männchen mit dem intakten ESIC-Cluster.

Dies deutet darauf hin, dass der SIC-Cluster die Konkurrenzfähigkeit der Spermien erhöht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Doppelpaarungsexperimente durchführt, damit Sie die Unterschiede in der Konkurrenzfähigkeit der Spermien zwischen mutierten und Kontrollmännchen erkennen können.