Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip
16. November 2019
Die chipbasierte optische Superauflösungsmikroskopie ist ein neuartiger Ansatz in der Fluoreszenzmikroskopie und bietet Vorteile in Bezug auf Wirtschaftlichkeit und Durchsatz. Hier werden die Protokolle für die Chipvorbereitung und -bildgebung gezeigt für die TIRF-Mikroskopie und die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie.
Das Hauptziel dieses Manuskripts ist es, ein bildgebendes Verfahren der neu entwickelten photonischen Chip-basierten TIRF-Mikroskopie und der Einmolekül-Lokalisationsmikroskopie wie dSTORM zu präsentieren. Die Hauptkomponente hier ist der photonische Chip, die aus Einer Reihe von optischen Wellenleitern hergestellt werden. Das Licht im Inneren des optischen Wellenleiters wird auf der Grundlage der gesamten inneren Reflexion geführt.
Ein Teil des Lichts ist auf der Oberfläche in Form der evaneszenten Wellen vorhanden. Diese evaneszenten Wellen zerfallen exponentiell von der Oberfläche weg, mit einer Eindringtiefe von ein paar hundert Nanometern. Dadurch eignen sie sich für die TIRF-Beleuchtung.
Die TIRF-Beleuchtung über den optischen Wellenleiter ist über eine extrem große Fläche verfügbar, die durch die Wellenleitergeometrie definiert wird und somit ideal für die Bildgebung mit hohem Durchsatz geeignet ist. Der Hauptunterschied zwischen einem traditionellen TIRF- und dSTORM-Setup im Vergleich zu unserem Ansatz besteht darin, dass wir einen photonischen Chip verwenden, um die Probe zu beleuchten, anstatt Licht durch eine bildgebende Objektivlinse zu senden. Unser Ansatz entkoppelt die Beleuchtung und den Sammlungslichtteil und eröffnet neue bildgebende Möglichkeiten.
Legen Sie den Chip in die Glas-Petrischale mit einer Wafer-Pinzette und decken Sie sie vollständig mit einer 1%Hellmanex-Lösung ab. Die Petrischale 10 Minuten bei 70 Grad auf eine Kochplatte legen. Während Sie noch auf der Kochplatte sind, reiben Sie die Oberfläche mit einem Reinraum-Gewebeabstrich.
Entfernen Sie den Chip aus der Petrischale. Spülen Sie mit mindestens 100 Milliliter entioniertem Wasser. Spülen Sie mit mindestens 100 Milliliter Isopropanol, wobei darauf achten, dass das Lösungsmittel nicht auf der Oberfläche trocknet, um Verdunstungsflecken zu verhindern.
Spülen Sie mit mindestens 100 Milliliter entioniertem Wasser. Blasen Sie den Chip trocken mit einer Stickstoffpistole. Bereiten Sie eine spätere von 150 Mikrometer PDMS vor, indem Sie es in einer Petrischale drehen.
Verwenden Sie ein Skalpell, um einen etwa 1,5 mal 1,5 Zentimeter großen Rahmen aus der PDMS-Schicht zu schneiden. Heben Sie den Rahmen von der Petrischale mit einer Pinzette. Legen Sie es flach auf einem sauberen und polierten Chip.
Die Probe ist nun bereit für die Zellaussaat. Entfernen Sie nach dem Aussäen der Zelle den Chip vom Medium. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssige Flüssigkeit von außerhalb der PDMS-Kammer zu entfernen.
Entfernen Sie die aktuelle Flüssigkeit aus dem Inneren der PDMS-Kammer mit einer Pipette, während Sie ca. 60 Mikroliter gleichzeitig reinigende PBS hinzufügen. Ersetzen Sie die PBS durch 60 Mikroliter reinigen PBS, und lassen Sie es für eine Minute inkubieren. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, und lassen Sie ihn dieses Mal fünf Minuten lang inkubieren.
Entfernen Sie das PBS, und ersetzen Sie es durch 60 Mikroliter der Farbstofflösung. Lassen Sie die Probe etwa 15 Minuten inkubieren und schützen Sie sie vor Licht. Waschen Sie die Probe mit PBS, indem Sie das zuvor beschriebene Verfahren verwenden.
Entfernen Sie das PBS, und ersetzen Sie es gleichzeitig durch 40 Mikroliter des Bildgebungspuffers. Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Oberseite, um zu verhindern, dass sich Luftblasen darunter bilden. Drücken Sie vorsichtig den Deckelschlupf gegen die Bildkammer, um überschüssige Medien zu entfernen.
Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssige Medien außerhalb des Deckblatts zu entfernen. Reinigen Sie den Bereich außerhalb des Deckels mit einem wasserfeuchten Tupfer, um Kristalle zu vermeiden, die durch getrocknete Tauchmittelrückstände gebildet werden. Diese Version des Setups besteht aus drei Hauptkomponenten.
Das Mikroskop mit Filterhalter, weißer Lichtquelle, Kamera und Objektivrevolver. Die Kupplungsstufe, die eine dreiachsige Piezostufe ist, mit einem fasergekoppelten Laser und einer Kupplungslinse. Die Probenstufe, die eine einachsige manuelle Stufe mit Spitze und Neigung ist, mit einem Vakuumhalter.
Sowohl die Kupplung als auch die Probenstufe sind auf einer zweiachsigen motorisierten Stufe für die Probenübersetzung montiert. Legen Sie den Chip auf den Vakuum-LKW, mit der KupplungSfacet zum Kupplungsziel. Stellen Sie sicher, dass der Chip etwa eine Brennweite vom Kupplungsobjektiv entfernt ist.
Schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Schalten Sie den Laser auf ein Milliwatt ein. Stellen Sie die Spanhöhe grob ein, so dass der Strahl auf die Kante trifft.
Schalten Sie den Laser aus. Schalten Sie die weiße Lichtquelle ein. Wählen Sie eine objektive Linse mit geringer Vergrößerung, z. B. eine 10-fache.
Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einen Wellenleiter. Übersetzen Sie das Mikroskop entlang des Wellenleiters, um zu sehen, ob es gut auf den optischen Pfad ausgerichtet ist. Bewegen Sie das Mikroskop auf die Kupplungskante.
Schalten Sie den Laser mit einem Milliwatt oder weniger ein. Übersetzen Sie das Mikroskop entlang der Kupplungskante, um das Laserlicht zu finden. Fokussieren Sie den Strahl auf die Spankante.
Passen Sie die Kopplungsstufe entlang des optischen Pfades in die Richtung an, die die Größe des Laserstrahlflecks reduziert, bis er verschwindet. Der Strahl befindet sich nun entweder über oder unter der Spanoberfläche. Passen Sie die Höhe der Kupplungsstufenhöhe an, bis der Strahlfleck wieder auftaucht und maximiert wird.
Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte, bis der Laser einen fokussierten Punkt bildet. Bewegen Sie den fokussierten Punkt zum Wellenleiter von Interesse. Übersetzen Sie das Mikroskop in kurzer Entfernung vom Rand, so dass der fokussierte Strahlfleck nicht mehr sichtbar ist.
Schalten Sie das weiße Licht aus. Passen Sie den Kontrast an. Wenn der Wellenleiter lenkt, sollte das gestreute Licht entlang des Wellenleiters deutlich sichtbar sein.
Passen Sie die Achse der Kupplungsstufe an, um die Streulichtintensität zu maximieren. Schalten Sie den Laser aus. Schalten Sie das weiße Licht ein.
Passen Sie ggf. den Kontrast an. Navigieren Sie zum Bildgebungsbereich. Fokus mit dem gewünschten Vorstellungsziel.
Schalten Sie das weiße Licht aus. Setzen Sie den Fluoreszenzfilter ein, und drehen Sie die Laserleistung auf ein Milliwatt. Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf ca. 100 Millisekunden ein.
Passen Sie den Kontrast nach Bedarf an. Stellen Sie sicher, dass die Kupplung noch optimiert ist. Suchen Sie eine Region, die für die Bildgebung von Interesse ist.
Schalten Sie die Piezo-Stufenschleife ein, um die Knoten zu durchschnittlichen Knoten zu verwenden. Erfassen Sie mindestens 300 Bilder. Laden Sie den erfassten Image-Stack mit einem virtuellen Stack nach Fidschi.
Wählen Sie im Bildmenü in Fidschi Stacks und Z Project aus. Berechnen Sie das TIRF-Bild, indem Sie Projektionstyp, Durchschnittliche Intensität, auswählen. Schalten Sie den Laser auf ein Milliwatt ein, und stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 30 Millisekunden ein.
Passen Sie den Kontrast und den Fokus an. Erhöhen Sie die Laserleistung, bis das Blinken beobachtet wird. Vergrößern Sie einen kleinen Bereich der Stichprobe.
Passen Sie den Kontrast an. Erfassen Sie ein paar Bilder, um zu sehen, ob die Blinzeln gut getrennt sind. Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera für ein optimales Blinken an.
Schalten Sie die Piezo-Bühnenschleife ein. Zeichnen Sie einen Bildstapel mit mindestens 30.000 Bildern auf, abhängig von der blinkenden Dichte. Öffnen Sie Fidschi, und laden Sie den dSTORM-Stack als virtuelle Bilder.
Passen Sie ggf. den Kontrast an. Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um den Bereich auszuwählen, den Sie rekonstruieren möchten. Open Run-Analyse im ThunderSTORM-Plugin in Fidschi.
Stellen Sie die grundlegenden Kameraeinstellungen in ThunderSTORM ein, die Ihrem Gerät entsprechen. Die verbleibenden Standardparameter sind in der Regel zufriedenstellend. Beginnen Sie mit der Rekonstruktion.
Die von der Rekonstruktionssoftware bereitgestellte Lokalisierungsliste wird gefiltert, um unspezifische Lokalisierungen zu entfernen. Bei Bedarf wird eine zusätzliche Driftkorrektur vorgenommen. Der Hauptunterschied zwischen chipbasierter und traditioneller Bildgebung liegt in der Instrumentierung und Datenerfassung.
Die Qualität der rekonstruierten Bilder kann somit auf die gleiche Weise beurteilt werden wie ein Bild aus einem kommerziellen Super-Auflösungsmikroskop. Da Multimode-Wellenleiter verwendet werden, kann das resultierende Bild jedoch eine inhomogene Anregung aufweisen, wenn zu wenige Bilder gesammelt werden. Dies wird in Panel a angezeigt.
Die Erhöhung der Anregungsmuster sollte zu einer inhomogenen Anregung führen, wie in Panel b gezeigt. Hier haben wir Leber sinusförmige Endothelzellen mit fluoreszierend markierter Plasmamembran abgebildet. Die Panels a und b sind beugungsbegrenzte Bilder.
Panel c zeigt ein beugungsbegrenztes Bild des Einssets in Panel b. Panel d zeigt ein dSTORM-Bild derselben Region. Leber sinusförmige Endothelzellen haben nanogroße Fenestrationen in ihrer Plasmamembran, die im Super-Auflösungsbild im Panel d deutlich sichtbar sind.
Einer der Hauptvorteile der chipbasierten Super-Auflösungs-Bildgebung ist das große Sichtfeld, das erreichbar ist. Panel a zeigt ein 500 Mikrometer mal 500 Mikrometer großes dSTORM-Bild von Lebersinus-Endothelzellen mit fluoreszierend markiertem Mikrotubuli. Panel b zeigt das Magenta-Einset aus Panel a, mit sowohl beugungsbeschränkten als auch superhochauflösenden Bildern zum Vergleich.
Panel c zeigt den grünen Einset von Panel a an. Die Auflösung des aufgenommenen Bildes beträgt 77 Nanometer. In diesem Video haben wir große Sichtfeld TIRF und dSTORM Bildgebung der Leber sinusförmigeen Endothelzellen mit einem photonischen Chip für die Beleuchtung durchgeführt.
Unsere Methode ist weniger komplex, kompakter und flexibler als die herkömmliche Art, TIRF mit einem Mikroskopobjektiv einer vorgegebenen numerischen Blende und niedrigem Sichtfeld durchzuführen. Die Lokalisationsmikroskopie, wie z. B. dSTORM, ist eine von mehreren hochauflösenden Bildgebungstechniken, die wir mit dem photonischen Chip erforscht haben. Beispielsweise kann Licht in einem optischen Wellenleitermaterial mit hohem Brechungsindex viel enger eingeengt werden, als es mit einer bildgebenden Objektivlinse möglich ist.
Diese Eigenschaft der Chipbeleuchtung hat Anwendung bei der Erhöhung der Auflösung der Intensität-Fluktuations-basierten optischen Mikroskopie-Methode und strukturierte Beleuchtungsmikroskopie gefunden. Darüber hinaus profitieren photonische Chips auch von Miniaturisierung, Kosteneffizienz und einer einfachen optischen Einrichtung. Als integrierte Technologie ist sie mit anderen optischen Funktionen auf dem Chip kompatibel.
Insgesamt ermöglicht dies die Nachrüstung in herkömmliche Beugungs-begrenzte Mikroskope, was eine Superauflösung bei geringem Aufwand ermöglicht.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine neuartige chipbasierte optische Mikroskopietechnik mit überzähliger Auflösung vorgestellt, die den Schwerpunkt auf die TIRF-Mikroskopie und die Lokalisierungsmikroskopie einzelner Moleküle legt. Die Protokolle zur Chippräparation und Bildgebung werden detailliert beschrieben, wobei die Vorteile dieses Ansatzes hinsichtlich Kosteneffizienz und Durchsatz hervorgehoben werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Fluoreszenzmikroskopie
- Super-Auflösungs-Bildgebung
- Photonik-Chip-Technologie
Hintergrund
- Die herkömmliche TIRF-Mikroskopie beruht auf der Beleuchtung durch das Objektiv.
- Photonische Chips nutzen optische Wellenleiter zur Lichtführung.
- Evaneszente Wellen ermöglichen die hochauflösende Abbildung auf der Oberfläche.
- Diese Methode verbessert den Abbildungsbereich und die Durchsatzleistung.
Zweck der Studie
- Eine neue Bildgebungsprozedur mittels TIRF-Mikroskopie auf Basis eines photonischen Chips demonstrieren.
- Herkömmliche Methoden mit dem chipbasierten Ansatz vergleichen.
- Detaillierte Protokolle für die Chip-Präparation und Bildgebung bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung photonischer Chips unter Verwendung optischer Wellenleiter.
- Zellsaat und Inkubationsprotokolle zur Probenvorbereitung.
- Abbildungsanordnung mit Mikroskop, Laser und Kamera.
- Bildaufnahme und -verarbeitung mit der Fiji-Software.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Demonstration der Hochdurchsatz-Bildgebungsfähigkeiten.
- Deutliche Sichtbarkeit des gestreuten Lichts entlang des Wellenleiters.
- Effektive Lokalisierung einzelner Moleküle mithilfe des neuen Aufbaus.
- Verbesserte Bildauflösung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Der chipbasierte Ansatz bietet erhebliche Vorteile in der Fluoreszenzmikroskopie.
- Die Entkopplung von Beleuchtung und Sammeln erweitert die Abbildungsmöglichkeiten.
- Diese Methode ebnet den Weg für zukünftige Fortschritte in der Super-Auflösungsmikroskopie.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Die chipbasierte Nanoskopie entkoppelt Anregungs- und Detektionswege und ermöglicht so die TIRF-Bildgebung mit großem Bildfeld unter Verwendung von Optiken mit niedriger Vergrößerung. Dieser Ansatz unterstützt die hochdurchsatzfähige Super-Auflösungs-Bildgebung, während er eine Auflösung beibehält, die mit herkömmlichen Methoden vergleichbar ist, und so Engpässe in der Zielvalidierung und phänotypischen Bildgebung der Entdeckungsphase adressiert. Die Technik erhöht die Vorhersagesicherheit, indem sie quantitative und reproduzierbare Daten aus der subzellulären Bildgebung über skalierbare Probeflächen hinweg bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung subzellulärer Strukturen wie der Fenestrierungen der leber-sinusförmigen endothelialen Zellen und der Organisation der Plasmamembran mit einer Auflösung von 76 nm.
- Operativer Wert: Die getrennte Anordnung von Beleuchtung und Detektion ermöglicht den Einsatz von Objektiven mit niedriger Vergrößerung, wodurch das Sichtfeld vergrößert wird und Analysen zur Zielinteraktion auf Populationsebene verbessert werden.
- Prädiktiver Wert: Die dSTORM-Bildgebung über große Flächen hinweg unterstützt die statistische Robustheit bei der Lokalisierung von Zielstrukturen und der Beurteilung von Heterogenität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Eine gleichmäßige Anregung durch evaneszente Wellen über wellenleiterdefinierte Bereiche ermöglicht eine konsistente Lokalisierung einzelner Moleküle für Assayauswertungen.
- Operativer Wert: Die Kompatibilität mit Standardmikroskopen und die Integration auf dem Chip unterstützen die Standardisierung und Wiederverwendung von Assays über verschiedene Entdeckungskampagnen hinweg.
- Skalierbarkeit: Ein nachgewiesener Bildgebungsbereich von 500 µm × 500 µm ermöglicht die gleichzeitige Überprüfung mehrerer Bedingungen in einer einzigen Aufnahme.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Die bildgebende Darstellung von krankheitsrelevanten LSEC bestätigt die Anwendbarkeit für Modelle der endothelialen Pathophysiologie.
- Mechanistische Entlastung: Die Super-Auflösungs-Visualisierung von nanoskaligen Membranstrukturen unterstützt das Verständnis räumlicher Beziehungen zwischen Wirkstoffen und Zielstrukturen.
- Vorklinische Abstimmung: Die Auflösung und Durchsatzkapazität ermöglichen Biomarker-Lokalisierungsstudien in primären oder stammzellbasierten Systemen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in die frühe Entdeckungsphase bis hin zu Workflows zur Identifizierung von Leitsubstanzen und liefert hochauflösende Messwerte, die vor der Verbindungsscreening die Zielvertrauenswürdigkeit und die Reproduzierbarkeit des Assays beurteilen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch direkte Visualisierung der Lokalisation und Aggregation von Zielstrukturen in nativen Membranumgebungen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch quantifizierbare, hochdichte Lokalisierungsdaten aus großen Probenbereichen.
- Analytik: Erzeugt gefilterte Lokalisierungslisten und driftkorrigierte Rekonstruktionen zur objektiven Vergleichbarkeit experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht den Übergang zur präklinischen Validierung durch Abbildung krankheitsrelevanter zellulärer Ultrastrukturen in primären Zellmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die photonische Chip-Infrastruktur kann über verschiedene Projekte hinweg beibehalten werden, wodurch die Umrüstungskosten für bildgebende Verfahren mit Superauflösung reduziert werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch nanoskalige Auflösung der Organisation und Dynamik von Membranproteinen.
- Operationaler Wert: Standardisierte Chip-Präparation und Bildgebungsprotokoll gewährleisten Reproduzierbarkeit über verschiedene Anwender und Standorte hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf Daten zur subzellulären Target-Verteilung und verringert so die Ausscheidung in späteren Phasen aufgrund mechanistischer Fehlinterpretationen.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung von Targets, gestützt durch superauflösende räumliche Nachweise in relevanten zellulären Kontexten.
Durchführungsaspekte
- Es sind Kenntnisse im Umgang mit photonischen Chips, in der Fluoreszenzmikroskopie und in der Lokalisierungsanalyse einzelner Moleküle erforderlich.
- Zur Instrumentierung gehören eine Laserquelle, ein Piezotisch, ein Vakuumhalter, sowie ein mit TIRF und dSTORM kompatibler Satz an Fluoreszenzfiltern.
- Zu den standardisierungsbedürftigen Aspekten zwischen den Teams zählen Reinigungsverfahren für Chips, die Herstellung von PDMS-Kammern und Analyse-Pipelines mit Fiji/ThunderSTORM.
- Anpassungsüberlegungen beinhalten die Optimierung der Anregungsmuster für eine homogene Beleuchtung über verschiedene Wellenleitergeometrien und Probenarten hinweg.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören mögliche inhomogene Anregung bei unzureichender Mittelung der Muster sowie ein geringfügiger Auflösungsverlust im Vergleich zur TIRF-Mikroskopie mit Objektiven hoher numerischer Apertur.
