Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Meine Forschung konzentriert sich auf die Membran von T-Zellen und zielt darauf ab, neue nanoskalige Erkenntnisse für therapeutische Zielgerichteung zu enthüllen. Bestehende Bildgebungsverfahren visualisieren in der Regel nicht direkt die nanoskaligen Antikörper-Epitope-Interaktionen in Zellen. Dieses Protokoll überwindet diese Einschränkung, indem es direkte Beobachtung innerhalb der zellulären Umgebung ermöglicht.

Nachdem die Probe am Mikroskop montiert und Goldkolloide auf die Oberfläche abgelegt wurde, wird mit heller Feldbeleuchtung überprüft, dass genügend Kolloide im Interessensbereich abgelagert wurden. Überprüfen Sie, dass die ideale Dichte von 5 bis 10 Goldkolloiden im relevanten Bereich vorhanden ist, bevor Sie fortfahren. Für die optische Konfiguration des Antikörperprobe-Fluorophors öffnen Sie die Bildgebungssoftware und greifen Sie auf die optischen Konfigurationseinstellungen zu.

Wählen Sie den passenden dichroitischen Spiegel aus und stellen Sie die Wellenlänge und Leistungsdichte der Laseranregung ein. Passen Sie die Integrationszeit der Kamera an und wählen Sie den Emissionsfilter aus. Dann stellt man das Pixel-Binning der Kamera so ein, dass es eine Pixelgröße von 150 bis 160 Nanometern erreicht.

Erstellen Sie nun eine optische Konfiguration für den Fotobleichschritt, indem Sie in der Bildgebungssoftware einen Fotobleichmodus auswählen. Stelle die Laserleistung auf 100 % ein und stelle die Kamera-Integrationszeit auf eine Sekunde ein. Stellen Sie die Bildparameter in der Bildaufnahmesoftware ein, indem Sie das Nicht-Beleuchtungsintervall, die Anzahl der Bilder und die Häufigkeit des Fotobleichschritts festlegen.

Anschließend bereiten Sie den Bildgebungspuffer vor, indem Sie den CD81-Antikörper auf eine Konzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter in 200 Mikrolitern von 5 % BSA aus DPBS verdünnen. Die endgültig empfohlene Antikörperkonzentration beträgt 0,5 nanomolare für Jurkat-T-Zellen oder 2 nanomolare für U-2-OS-Zellen. Fügen Sie den vorbereiteten Bildpuffer dem Brunnen hinzu, der die Zellen enthält, und starten Sie die Bildaufnahme in der Software, um mit der Datenerhebung zu beginnen.

Nutzen Sie die Live-View-Funktion in der Bildgebungssoftware, die für die Membran-Single-Antibody-Markierung konfiguriert ist, um die Antikörperbindung in Echtzeit zu überwachen. Konfigurieren Sie die Bildparameter in der Bilderfassungssoftware so, dass sie mindestens eine 10-Bild-Aufnahme erzielen, und stellen Sie das Intervall für nicht-leuchtende Bilder auf fünf Sekunden ein. Beginnen Sie mit der Erfassung und bewerten Sie die Sparsamkeit einzelner Moleküllokalisierungen im aufgenommenen Film.

Wenn unmittelbar nach dem Hinzufügen des Bildgebungspuffers mehrere sich überlappende Antikörperbindungsereignisse beobachten oder wenn sich Einzelmoleküllokalisierungen im Laufe der Zeit ansammeln, wird die Aufnahme abgebrochen. Reduzieren Sie die Antikörperkonzentration um das Doppelte und wiederholen Sie die Aufnahme an einer neuen Probe. Reduzieren Sie weiterhin die Antikörperkonzentration um das Doppelte und bewerten Sie die Anzahl der Ereignisse pro Flächeneinheit erneut, bis die gewünschte Einzelmolekül-Lokalisationsdichte erreicht ist.

Wenn die Ereignisdichte gering ist, erhöht man die Antikörperkonzentration im Bildpuffer um das Doppelte. Wiederholen Sie die Aufnahme an einer neuen Probe und erhöhen Sie weiterhin die Antikörperkonzentration um das Doppelte, während Sie die Anzahl der Bindungsereignisse pro Flächeneinheit neu bewerten, bis die gewünschte Einzelmolekül-Lokalisierungsdichte erreicht ist. Für die Optimierung des Nicht-Beleuchtungsintervalls konfigurieren Sie die Bildparameter in der Bildaufnahmesoftware, um eine 50-Bild-Aufnahme zu erhalten.

Nach dem Hinzufügen des Antikörpers und Beginn der Aufnahme wird die Dichte und Sparsamkeit der Einzelmoleküllokalisierungen im aufgezeichneten Film bewertet. Bestimmen Sie das niedrigste nicht-beleuchtende Intervall, das eine optimale Einzelmolekül-Ereignisdichte liefert. Schließlich, wenn räumlich überlappende Bindungsereignisse im Verlauf der Bildaufnahme auftreten, wird in regelmäßigen Abständen ein Fotobleichschritt eingeführt.

Passen Sie die Fotobleichfrequenz so an, dass die Fluoreszenz von gebundenen Antikörpern entfernt wird, bevor sich überlappende Ereignisse anhäufen. Setze den Dateipfad in der MATLAB-Software auf den Ordner, der die rekonstruierte Datei mit Komma-getrennten Werten der M-Zelle enthält. Führe den Code aus, indem du in der MATLAB-Werkzeugleiste auf Ausführen klickst.

Wenn du aufgefordert wirst, wähle die M-Zellen-CSV-Datei aus und klicke auf Öffnen, um sie ins Programm zu laden. Führen Sie die Analyse mit den zuvor definierten Eingaben als Ausgangspunkt durch. Auswertung des Streudiagramms, das die unclusterten Lokalisierungsdaten enthält.

Wählen Sie einen Mindestpunktwert, der höher ist als die Anzahl der Rauschlokalisierungen, aber niedriger als die Anzahl der Lokalisierungen auf der Zelle. Bewerten Sie das Fenster, das die Cluster-Daten darstellt. Bestätigen Sie, dass Cluster auf der Zelle mit dem erwarteten Phänotyp erhalten bleiben, während Lokalisierungen außerhalb der Zelle minimiert werden.

Wenn die Clustering-Parameter zu restriktiv sind, senken Sie den Mindestpunktwert und erhöhen Sie das Epsilon. Wenn die Clusterparameter zu umfassend sind, erhöhen Sie den Mindestpunktwert und verringern Sie das Epsilon. Schließlich wird der Code nach Anpassung des Mindestpunktwerts und Epsilon erneut ausgeführt, um eine optimale Clusterung zu erzielen.

Jurkat-T-Zellen wurden mit ausreichendem Abstand immobilisiert, um die Membranintegrität zu erhalten und Antikörpern Zugang zu den Membranepitopen zu ermöglichen. Goldkolloide wurden visualisiert und als fiduciale Marker für die laterale Driftkorrektur während der M-Zell-Bildaufnahme verwendet. Die Optimierung des Nicht-Beleuchtungsintervalls zeigte, dass ein fünfsekündiges Intervall Antikörperbindungsereignisse mit minimaler räumlicher Überlappung verursachte, verglichen mit kürzeren oder längeren Intervallen bei einer nanomolaren Antikörperkonzentration.

Die Anwendung der Driftkorrektur verbesserte das rekonstruierte M-Zellbild im Vergleich zur unkorrigierten Rekonstruktion. Dichtebasierte Clusterbildung von M-Zell-Lokalisierungen reduzierte Interaktionen mit niedriger Dichte im Hintergrund und hob geclusterte CD81-Bindungsereignisse hervor. Wir können Antikörper beobachten, die mit ihren Membranepitopen in einer zellulären Umgebung interagieren, was relevante Einblicke für therapeutische Antikörper liefert.

Die Antikörperkonzentration, das Nicht-Beleuchtungsintervall und die Fotobleichungsschritte sind entscheidend zur Optimierung. Suboptimale Parameter beeinträchtigen die Ergebnisse. Die Single-Antibody-Markierung kann erweitert werden, um gleichzeitig die Membranproteinbindung mehrerer Antikörper innerhalb derselben zellulären Umgebung zu bewerten.