A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue auf Soul-Gel basierende Materialien für die Herstellung von Mikroarrays zu identifizieren und diese für Enzym-Assays mit Nanoliter-Volumina zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst Materialien identifiziert werden, die ausreichend lange Gelierzeiten aufweisen, um eine Gelierung in der Mikroarray-Drucknadel während des Druckvorgangs zu vermeiden. Der zweite Schritt besteht darin, Materialien mit langen Gelierzeiten hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur reproduzierbaren Herstellung von Mikroarrays, ihrer Beständigkeit gegen Rissbildung, der Haftqualität, unerwünschter Phasentrennung und letztlich ihrer hohen Aktivität für eingebettete Enzyme zu bewerten.

Anschließend wird das Enzym von Interesse als Mikroarray unter Verwendung der optimalen Materialien aufgetragen, und seine Fähigkeit, die Assaylösung punktgenau zu überdecken und eine messbare enzymatische Reaktion hervorzurufen, wird geprüft. Der letzte Schritt besteht darin, die Materialien hinsichtlich ihrer Eignung zur Bereitstellung hochgradig reproduzierbarer Assays mit dem Enzym von Interesse zu bewerten und quantitative Daten zu generieren. Das endgültige Material für die Array-Herstellung wird dann ausgewählt.

Schließlich werden mit Soul-Gel-abgeleiteten Protein-Microarrays kleine Moleküle identifiziert, die die Enzymaktivität verringern. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der plattenbasierten Bildschirmung besteht darin, dass große Mengen an Materialien systematisch und sehr schnell mit geringen Reagenzvolumina getestet werden können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da es möglich ist, dass Materialien in den Drucknadeln verkleben.

Wenn diese anschließend nicht ordnungsgemäß entfernt werden, führt dies zu übersehenen Stellen, die als nicht druckbare Materialien interpretiert werden können. Bereiten Sie zunächst die verschiedenen Additiv-Lösungen gemäß der beigefügten schriftlichen Protokollbeschreibung vor. Viele der Lösungen können im Voraus hergestellt und bis zu einem Monat oder länger unter geeigneten Bedingungen gelagert werden, einige müssen jedoch am Tag des Experiments frisch angesetzt werden.

Mischen Sie die auf Natriumsilikat basierenden Sägen unmittelbar vor der Verwendung und stellen Sie sicher, dass sie auf Eis gehalten werden. Das SOS muss innerhalb einer Stunde nach Zugabe des Wassers verwendet werden, da längere Wartezeiten zu abnehmenden und inkonsistenten DATION-Zeiten führen. Bereiten Sie anschließend verschiedene Kombinationen aus Puffern, Salans-Polymeren und Organs-Lanen gemäß der beiliegenden schriftlichen Anleitung vor, um festzustellen, welche Kombinationen als druckbares Material mit Dilationszeiten von mehr als 2,5 Stunden verwendet werden können.

Nachdem eine Reihe von Kombinationen identifiziert wurde, stellen Sie die Luftfeuchtigkeit in der Druckkammer auf 80 bis 90 % ein; eine geringere Luftfeuchtigkeit kann zu Probenevaporation und Inkonsistenzen beim Drucken führen, da die Ablagevolumina mit dem Drucker sehr klein sind. Nun bereit, ordnen Sie die zu druckenden Array-Muster mithilfe des Chip Writer Pro-Programms an. Stellen Sie die Fahrgeschwindigkeit in XY-Richtung auf 10 Millimeter pro Sekunde und die Probennahmegeschwindigkeit in Z-Richtung auf zwei Millimeter pro Sekunde bei einer Probenaufgabedauer von 2,5 Sekunden unter Verwendung der zuvor identifizierten Saw-Gel-Kombinationen ein.

Bereiten Sie 25 Mikroliter der Grundmaterialien vor, indem Sie entsprechende Polymere, Organometallverbindungen und niedermolekulare Zusatzstoffe kombinieren, die im Vorscreening identifiziert wurden. Geben Sie 50 Millimolar HEPES mit einem pH-Wert von 8,0 in einzelne Vertiefungen einer 384-Loch-Mikrotiterplatte. Anschließend werden bis zu vier geschlitzte Hüllnadeln mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern in doppelt destilliertem Wasser sonifiziert.

Nach 15 Minuten unter einem Stickstoffstrom testen. Anschließend einen Pinselreiniger verwenden, um restliche Feuchtigkeit aus dem Pinhalter zu entfernen, und den Pin vorsichtig in den Druckkopf des Kontakt-Pin-Druckroboters einsetzen. Die Nichtentfernung von Restfeuchtigkeit kann dazu führen, dass sich der Pin im Halter nicht frei bewegen kann, was zu ausgelassenen Stellen führen kann.

Fügen Sie dann 25 µL der jeweiligen SA unmittelbar vor dem Drucken in das Bohrloch ein. Mischen Sie die Lösung durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren, wobei dieser Vorgang beim Mischen mit der Pipette 50-mal wiederholt wird. Minimieren Sie die Menge an eingeschlossener Luft in der Lösung.

Luftblasen verhindern das vollständige Befüllen der Probe im Pin. Danach den Pin senken, um ihn in die Probe einzutauchen. Sobald die Pins befüllt sind, beginnen Sie den Druckvorgang und drucken die Probe auf eine Objektträgeroberfläche.

Unterbrechen Sie den Druckvorgang, bevor Salz zur anschließenden Quellplatte hinzugefügt wird. Bei unterbrochenem Prozess entfernen Sie die Drucknadel mithilfe eines Magneten und platzieren einen Rohrreiniger im Druckkopf, um die Ansammlung von Feuchtigkeit im Druckkopf zu verhindern. Spülen Sie die Drucknadel anschließend mit doppelt destilliertem Wasser ab und behandeln Sie sie 30 Sekunden lang einer Ultraschallreinigung in sauberem, doppelt destilliertem Wasser.

Trocknen Sie anschließend den Druckstift unter einem Strom von Stickstoff und setzen Sie ihn danach wieder in den Druckkopf ein. Fahren Sie mit dem Mischen, Drucken und Reinigen für alle verbleibenden Proben in der Quellplatte fort; dabei können bis zu 12.000 Tropfen mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern auf einem einzigen Objektträger abgesetzt werden. Nach Beendigung des Druckvorgangs lagern Sie das Array mindestens 30 Minuten und bis zu 24 Stunden in der Druckkammer bei einer Luftfeuchtigkeit von 80 bis 90 %.

Stellen Sie kurz vor der Verwendung 50 Mikroliter der positiven Kontrolle her, indem Sie 25 Mikroliter einer einmillimolaren Acetylcholiniodid-Lösung, 0,14 Mikroliter einer fünfmillimolaren BODIPY-FL-Cystein-Lösung und 25 Millimolar Tris bei pH 7,0 mit 4 % Glycerol in einem Wells einer 384-Well-Mikrotiterplatte mischen. Pipettieren Sie die Lösung langsam mehrmals auf und ab, um sie zu vermischen, ohne Blasen zu bilden. Bereiten Sie anschließend die negativen Kontrollen kurz vor der Verwendung vor, indem Sie 0,14 Mikroliter einer fünfmillimolaren BOAI-PI-FL-Cystein-Lösung mit 49,86 Mikrolitern 25 Millimolar Tris bei pH 7,0 mit 4 % Glycerol in einem weiteren Well einer 384-Well-Mikrotiterplatte vermengen und vorsichtig mischen. Drucken Sie die Kontrollen mithilfe der im vorherigen Abschnitt beschriebenen Verfahren auf die gealterten Mikroarrays. Verwenden Sie jedoch statt der Pins mit 100-Mikrometer-Durchmesser geschlitzte Pins mit einem Durchmesser von 235 Mikrometern.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Lösungen die zuvor abgesetzten Tropfen vollständig bedecken. Die Tropfen altern die Arrays eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeit von 80 bis 90 %, bedingt durch die autokatalytische Hydrolyse von Acetylcholin. Längere Inkubationszeiten können aufgrund einer erhöhten Enzymaktivität zu falsch-positiven Ergebnissen führen.

Stellen Sie sicher, dass der Alpha Innotech Novo Array-Imager eingeschaltet ist und mit einem Anregungsfilter von 478 ± 17 Nanometer und einem Emissionsfilter von 538 ± 21 Nanometer für die Messung der Acetylcholinesterase-Mikroarrays ausgestattet ist. Danach wird der Objektträger mit den Spot-Seiten nach oben in den Objektträgerhalter eingelegt. Stellen Sie die Anzahl der Vorschaubereiche so ein, dass mindestens ein Bereich auf jeder Seite des Mikroskopobjektträgers mit einer Mindestauflösung von vier Mikrometern unter Verwendung der automatischen Belichtung angezeigt wird.

Wenn die Parameter als akzeptabel erachtet werden, erfassen Sie ein Objektträgerbild und speichern Sie es als TIFF-Datei. Öffnen Sie anschließend das aufgenommene Objektträgerbild in ImageJ 64. Klicken Sie auf das Werkzeug „Oval Selection“ und markieren Sie jeden einzelnen Spot.

Wählen Sie einen Bereich, der etwas größer ist als der beobachtete Fleck, und stellen Sie sicher, dass Sie eine einheitliche Größe zwischen den Flecken verwenden, um die Subjektivität von Image J zu verringern. Messen Sie anschließend die Signalintensität jedes Flecks mithilfe der Messoption unter dem Reiter „Analyze“. Bilden Sie den Mittelwert der Intensität aus 25 ähnlichen positiven Kontrollflecken und teilen Sie diesen durch den Mittelwert der Intensität von 25 ähnlichen negativen Kontrollflecken, um die Verhältnisse von positiver zu negativer Kontrolle für die einzelnen Materialzusammensetzungen zu erhalten.

Hier wird ein Beispiel für die Dynamik der mit diesen Methoden hergestellten Mikroarrays gezeigt. Die positiven Kontrollen ergaben helle grüne Bereiche, während die negativen Kontrollen deutlich schwächer leuchtende Flecken zeigten. Die mittels Image J 64 gemessene Intensität zeigt, dass die positiven Kontrollen durchschnittlich etwa 22.000 relative Fluoreszenzeinheiten erreichen, während die negativen Kontrollen im Durchschnitt nahe bei 8.000 liegen.

Die gestrichelten Linien stellen drei Standardabweichungen vom Mittelwert dar. Hier sind Beispiel-Microarrays für eine Honor-Array-Screening-Analyse synthetischer Analoga der Ameral-Sier-Alkaloide, die als Verbindung eins und Verbindung zwei identifiziert wurden. Beide Achsen repräsentieren den Prozentsatz des Enzyms, wie er durch das Fluoreszenzsignal bestimmt wurde.

Bei der doppelten Durchführung repräsentiert die Nähe der Punkte zur Diagonalen eine hohe Reproduzierbarkeit des Assays. Hier werden IC50-Diagramme von zwei verschiedenen potenziellen Inhibitoren gezeigt. Verbindung eins führte zu einem IC50-Wert von 16 µM, während der IC50-Wert von Verbindung zwei 21 µM betrug. Oberhalb sind repräsentative Spotbilder dargestellt, um Unterschiede im Signal in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration zu veranschaulichen.

Das hier gezeigte Array wurde mit vier verschiedenen Kinasen, P 38 MAP-Kinase, EGFR und GSK, bedruckt und anschließend mit Puffer allein, Puffer enthaltend A TP sowie Puffer enthaltend A TP und Starrosporin, einem Inhibitor der Enzymaktivität, überdruckt. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Einfluss des Kinaseinhibitors Starrosporin, basierend auf den resultierenden Fluoreszenzintensitäten, wie hier beschrieben. Der größte Unterschied bei der hier verwendeten Konzentration von Storsporin ergab sich bei den P 38-Spots.

Hier sind repräsentative Stellen eines P 30 8:00 AM BP-Mikroarrays dargestellt, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Stor-Sporin überspottet wurden. Wie angegeben, betrug die IC50 dieses Moleküls ein Mikromolar und ist im rechten Graphen dargestellt. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß gemäß diesem Verfahren durchgeführt wird.

Andere Methoden wie Immunassays oder Proteininteraktionsassays können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen im Bereich Diagnostik oder Entdeckung von kleinen Molekülen zu beantworten.