Name: A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie einen geführten Material-Screening-Ansatz zur Entwicklung von Sol-Gel-Protein-Mikroarrays mit Pin-Printing. Diese Methode ermöglicht effizientes Screening kleiner Moleküle mit Acetylcholinesterase und Multikinase.

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Die Autoren danken Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Kleine, Xin Ge und Laura Lautens für die Unterstützung bei der Entwicklung von Protein-Microarrays. Die Autoren danken dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) für die Finanzierung dieser Arbeit. Die Autoren danken auch dem Canada Foundation for Innovation und dem Ontario Innovation Trust für die Unterstützung dieser Arbeit. JDB hält den Canada Research Chair in Bioanalytik und Biointerfaces.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Methodik hier beschrieben wurde als die am besten geeignete für die Identifizierung druckbare Sol-Gel-Materialien abgeleitet mit einem Kontakt Drucker ausgewählt, wodurch ein zeit-und kostengünstige Verfahren zur schnellen Identifizierung optimalen Materialien, ohne eine große Zahl von Materialien zu screenen. Von den insgesamt 20.000 ~ potenziellen Materialien, war es möglich, ~ 200 Materialien, die für den Druck auf der Grundlage Gelierdauer allein waren zu identifizieren. Diese deutlich die Anzahl der benötigten Materialien, um für nachfolgende Druckversuche hergestellt werden reduziert. Diese bedruckbaren Materialien wurden dann auf 4 Gleitflächen für insgesamt 768 Material-Gleitpaarungen gedruckt. Im Durchschnitt können 50 Punkte / Replikate von einem Material in ~ 3 min, einschließlich Probenbeladung, Spot Abscheidung und Reinigung Stift gedruckt werden. Von diesen 155 Materialien oder etwa 20%, für den Druck der maximalen Anzahl von Punkten pro Lösungsaufnahme erlaubt und reproduzierbar hergestellt Punktgrößen. Es sollte angemerkt werden, dass der 4 slide Oberflächen getestet, gedruckte Materialien besser in der Reihenfolge: Amin&gt; Epoxidharz&gt; Aldehyd&gt; PMMA, PMMA Folien nicht produzieren nützliche Arrays für alle Materialien. Dies war wahrscheinlich auf die Polarität der Oberflächenbeschichtung zugeschrieben. Vergleichen der genannten Gleitflächen wurden das polarere Amin und Epoxid besser für die wässrigen Sole im Vergleich zu den PMMA Folien geeignet. Außerdem der getesteten Oberflächen bieten die Amin-beschichtete Objektträger ein Potential positiv geladenen Oberfläche der abgeschiedenen anionischen Sol zu binden. Wir vermuten, dass die Nanopartikel Siliciumdioxid an der Grenzfläche zwischen dem Schieber und das Sol auf der Oberfläche interagieren. Sowohl die Epoxy-und die Aldehyd Gleitflächen fehlt die gleiche anfängliche Lade-Interaktion. Um eine optimale Ort Abscheidung zu gewährleisten ist es sehr empfehlenswert, um pre-beschichtete Objektträger von einem Anbieter wie Arrayit verwenden. In-house Beschichtung erzeugt inkonsistente Flächen, die zu schlechter Reproduzierbarkeit Spot 13 ​​und führen, in einigen Fällen kann eine Quantifizierung prob führenbleme. 18. Von gleicher Bedeutung, Einfluss auf Temperatur und Luftfeuchtigkeit die &quot;Bedruckbarkeit&quot; der Materialien. Während keine detaillierten Studien zu den Auswirkungen im Zusammenhang mit Temperatur durchgeführt wurden, wurde das Drucken immer bei Raumtemperatur (23 ± 3 ° C). Feuchtigkeit (mehr als 80%) wurde auch in der Kammer Druck gesteuert wird, um unregelmäßige Form Ablagerung aufgrund der geringen Volumina Abscheidung (0,7-2,3 nl) und eine Verdampfung zu verhindern. Während das Material Bildschirm wurde zur Identifizierung optimaler Sol-Gel-abgeleitete Materialien, die speziell zum Drucken von AChE und Kinasen, eine kleine Reihe von Materialien identifiziert, die für beide Proteine ​​gearbeitet geführt. Tatsächlich wurden beide Materialien, die für die Kinase-Mikroarray Herstellung identifiziert wurden SS + PVA + Basis Glycerin, und beide Materialien wurden in den 26 Materialien für AChE Microarrays ausgewählt identifiziert. Diese &quot;optimal&quot; Materialien können eine generische Ausgangspunkt für die Entwicklung weiterer prote bietenin-dotierten Sol-Gel-basierten Microarrays und kleine Bildschirme um diesen Zusammensetzungen zentriert identifizieren können noch bessere Werkstoffe für Microarray-Herstellung. Ein zweiter Punkt ist die Bedeutung des Enzyms verwendet. Im Falle von AChE (a ziemlich robust Enzym), gehalten 26 (oder etwa 40%) der ursprünglichen 66 Materialien als Assay-kompatibel identifiziert die Aktivität des eingeschlossenen AChE. Doch für die zarteren Kinasen, waren nur 2 der 69 Test-kompatiblen Zusammensetzungen oder rund 3% der Materialien in der Lage, die Aktivität aller Kinasen zu behalten. Während eine ausreichende Zahl von verschiedenen Enzymen nicht studiert haben, um schlüssige Aussagen zu machen, scheint es, dass die Optimierung Arrayherstellung mit relativ instabil Enzyme können zur Identifizierung der Materialien, die eine breite Palette von Proteinen an mutliplexed Microarray Herstellung erlauben einzufangen führen kann. Unabhängig von der gewählten Proteins wurde die große cut-off Faktor zur Identifizierung bedruckbaren Materialien die Notwendigkeit für eine langeMaterial Gelierzeiten (&gt; 2,5 h). Bei der Entwicklung SS Sol-Gel-Materialien, ist es sehr wichtig, um sicherzustellen, dass nach Ionenaustausch und Filtration wurde das Sol bei etwa pH 4 ist. Sols mit einem geringeren anfänglichen pH-Wert kann in Materialien mit einer geringeren als den neutralen pH-Wert, die Enzymaktivität beeinflussen können. 19 Einstellen der Menge an Dowex (Ionenaustauscher) zu SS kann die endgültige pH des Sol verändern führen. Wenn eine neue Charge des Harzes wird das Verhältnis von Harz zu SS muss so eingestellt werden, dass Sole bei etwa pH 4 nach dem Verfahren in Abschnitt 2 des Protokolls zu produzieren. Ebenso ist die Herstellung von kristallinen DGS oft eine Fehlerquelle mit Materialversagen verbunden, wenn mit DGS based Sole für das Biomolekül Einschluss. Obwohl hier nicht im Detail angegeben, muss große Sorgfalt, um während der Synthese des kristallinen DGS, insbesondere die Notwendigkeit, die Anwesenheit von Wasser während der Synthese zu vermeiden, die polyglycerated Siliciumdioxid produzieren kann entnommen werdentes statt monomere DGS. Auch aufgrund der hygroskopischen Natur der DGS, muss die kristalline Probe zu speichernden ausgetrocknet werden und innerhalb von 6 Monaten nach der Synthese. Kristalline DGS älter als 6 Monate nicht vollständig auflösen (wegen teilweise kondensierten Polyglyceryl Silikat-Material), auch mit Ultraschall in einer sauren Umgebung. Unvollständige DGS Auflösung produziert Solen mit unbekannten und unkontrollierbaren Silica-Anteil und damit weniger robusten Materialien. Ein wichtiger Punkt bei Kontaktdruck beachten ist die Qualität der Stifte. Beschädigte oder misshandelt Stifte (Abbildung 9) wird nie reproduzierbar Arrays unabhängig von dem Material gedruckt wird. Es wird empfohlen, um den Stift mit einem Qualitäts-Check Dissektionsmikroskop um sicherzustellen, gebrochen oder verstopft Stifte nicht verwendet werden. Sorgfältige Behandlung garantiert eine lange Lebensdauer für die Stifte. Freie Bewegung des Stifts ist ebenfalls wichtig. In Fällen, in denen Feuchtigkeit in dem Druckkopf zwischen dem Kopf und der Stift der Stift eingeschlossen ist,er wird dann nicht vollständig und somit nicht guten Kontakt mit der Oberfläche, was zu einem Mangel der Abscheidung von Material. Zusammenfassend haben wir einen detaillierten, mehrstufigen Screening-Ansatz für die Entwicklung von High-Density-Protein-dotierten pin gedruckten Microarrays zur Verfügung gestellt. Das Screening beinhaltet die Optimierung der Materialeigenschaften (Gelierdauer und Bedruckbarkeit), damit Druck von Materialien, um mehr konzentriert Screening gefolgt, um Materialien, die mit einem gegebenen Assay und in der Lage, um die Enzymaktivität zu behalten sind zu identifizieren. Diese geführte Material Screening-Ansatz können zusätzliche Microarray-Formate angewendet werden, um Zeit und Kosten mit der Herstellung von effizienten High-Density-Microarrays zu reduzieren.

Microarrays haben Popularität innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft als eine Methode zur Steigerung der Durchsatz Assay gewonnen. Da die Entwicklung der Microarray-Technologie, um die Genexpression 1 in der Mitte der 1990er Jahre zu bewerten, haben Microarrays Einsatz in der Entwicklung von High-Throughput-Assays gefunden, um Protein-Protein-und Protein-Interaktionen kleines Molekül zu identifizieren und neue Materialien mit einzigartigen Eigenschaften zu finden. 2-5 In jüngerer Zeit wurden Mikroarrays, wobei bestimmte Materialien verwendet werden, um funktionelle Proteine ​​zu immobilisieren, wodurch ein dreidimensionales Mikroarrayelement in denen Proteine ​​eingeschlossen entwickelt, das einfache Messung der enzymatischen Aktivität und Hemmung auf dem Microarray selbst mit einem geeigneten Fluoreszenz Assay, der auf das Substrat Umsatz gekoppelt ist. 5-10 Wichtig ist, dass solche Mikroarrays entwickelt, um alle notwendigen Komponenten, um Bildschirm Proben und Kontrollen gehören zusammen in einem sehr parallel Mode werden. 5,8 &lt;/ P&gt; Frühe Beispiele von Protein-Microarrays wurden typischerweise unter Verwendung von Standard-Verfahren für die Immobilisierung von Proteinen an feste Träger, wie eine kovalente Bindung, erfassen 11 Affinität 3 und physikalische Adsorption. 12 Während diese Verfahren von Bio-Immobilisierung erhöht Probenkonzentration und beschleunigte Kinetik erforderlich für erlauben Assay Miniaturisierung, leiden sie jeweils Nachteile. Im Allgemeinen führen alle eine Reduktion der nativen Biomolekül Funktionalität durch chemische Modifikation der Oberfläche, erschwerter Zugang zum aktiven Zentren oder unsachgemäße Ausrichtung durch unspezifische Immobilisierung. So sind alle Methoden führen zu geringeren Empfindlichkeit des Assays trotz einer Steigerung der Abscheidung Biomolekül, eine Antwort, die wahrscheinlich entsteht durch die Notwendigkeit, künstlich binden Biomolekülen an einer Oberfläche. Eine aufstrebende Ansatz für die Herstellung von funktionellen Biomolekülen Microarrays ist durch den Stift-Druck von Protein-dotiertenKieselsole auf festen Trägern, die in der Regel entweder funktionalisierte Glasplättchen oder einzelnen Vertiefungen von Mikrotiterplatten. Das Sol-Gel-Prozess selbst erfolgt in einer wässrigen Umgebung bei Raumtemperatur, und es ist die flüssige Vorstufe, die gedruckt und dann Gele zum Einschluss von Biomolekülen in der 3D-Matrix, was eine hohe Eiweissbelastung 13 sowie Einschluss von mehreren Komponenten in gleich Mikroarrayelement. 13,14 Tailoring des Sol-Gel-abgeleitete Material durch sorgfältige Auswahl der verschiedenen Silikavorstufen durchgeführt werden, sowie durch die Veränderung der wässrigen Komponente durch die Verwendung von verschiedenen Puffern (pH, Ionenstärke) und Aufnahme verschiedene Zusätze (Polymere, kleine Moleküle), um einen optimalen Materialfluss zu erreichen, hängt die spezifische Natur von denen auf dem Biomolekül, das eingeschlossen ist. 10 Eine mögliche Einschränkung mit den Entwicklungsländern Sol-Gel abgeleiteten Protein-Microarrays über Pin-Druck verbunden ist,die Notwendigkeit, die Sol-Gel-basierte Verbundwerkstoffe, die ohne Geliermittel in den Stift gedruckt werden können oder unerwünschte Eigenschaften zeigen (nicht reproduzierbar Messfelder, Rissbildung, schlechte Haftung, Inkompatibilität mit Assay-Komponenten, schlechte Protein-Aktivität) einmal auf eine Oberfläche gedruckt identifizieren. 5 Gleichzeitige Optimierung all dieser Parameter schließt einen Ansatz, bei de novo Materialien ausgelegt werden kann, oder untersucht langsam in serieller Weise. Auf der anderen Seite ist Zufalls-Screening von mehreren tausend oder zehntausend Materialien weder zeitlich noch kostengünstiger. In diesem Artikel beschreiben wir ein direktes Screening Ansatz, der die schnelle Identifizierung von geeigneten Materialien können für die Herstellung von Protein-Arrays, ohne dass nach dem Zufallsprinzip Screening einer großen Anzahl von Materialien. Mit einer geführten Ansatz werden Materialien, die für Microarray Druck zunächst identifiziert, gefolgt von einer Reihe von kleinen Bildschirme zu identifizieren optimale Sol-Gel-abgeleitete Materialienal-Kombinationen, die reproduzierbar gedruckt werden, ohne zu reißen und sind kompatibel mit einer gegebenen Assay. Schließlich werden optimale Materialien basierend auf Beibehaltung der Enzymaktivität und Leistung in einem abschließenden kleinen Molekülen Screening-Assay identifiziert. Auf diese Weise kann eine optimale Materialien aus vielen tausend Kandidaten mit nur ein paar hundert Schritte Assay identifiziert werden. Wir zeigen, diesen Ansatz für die Herstellung von sowohl hoher Dichte Acetylcholinesterase und Multi-Kinase-Microarrays und die Verwendung solcher Microarrays für kleine Molekül-Screening.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><stark>Reagenz/Material</stark></td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol) (PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>80% hydrolozyiert, Mw 600</td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 600 (PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>50 Gew.-% Lösung in Wasser</td></tr><tr><td>Carboxyethylsilantriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263,0</td><td>25 % in Wasser</td></tr><tr><td>N-(3-triethoxysilylpropyl)gluconamid (GLS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>50 % Ethanol</td></tr><tr><td>Bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylenoxid (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltrimethoxysilan (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(triethoxysiyly)ethan (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose-Dihydrat</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&epsilon; -Acetyl-L-lysin</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, 1,0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Salzsäure, 1,0 N/0,1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diglycerolsilan (DGS)</td><td></td><td></td><td>Im Labor hergestellt</td></tr><tr><td>Natriumsilikatlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 Ionenaustauschharz</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetylthiocholiniodid</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetylcholinesterase aus Electrophorus electricus (Zitteraal)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystin</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Färbekit</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenosin-5'-Triphosphat-Dinatriumsalz (ATP)-Lösung</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), aktiver</td><td>EMD Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>gespendet durch Millipore</td></tr><tr><td>Glykogensynthase-Kinase 3&beta; (GSK-3&beta;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Myelin-Basisprotein (MBP)</td><td>EMD-Millipore-Substrat</td><td></td><td>für MAPK2 und p38&alpha;, gespendet von Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Substrat für GSK-3&beta;</td></tr><tr><td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>Substrat für EGFR</td></tr><tr><td>Stealth Pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth-Pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aminbeschichtete Objektträger</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aldehydbeschichtete Objektträger</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Exposy beschichtete Objektträger</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mit Poly(methylmethacrylat) (PMMA) beschichtete Objektträger</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2-μmu; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Virtek Kontakt Drucker</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Novaray Fluoreszenz-Dia-Imager</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Desktop-Mikroarray-Zentrifuge</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Wird verwendet, um das gesamte für Experimente benötigte Wasser zu filtern</td></tr></tbody></table>

a guided materialien screening-ansatz für die entwicklung von quantitative sol-gel-derived protein microarrays

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays haben den Einsatz in der Entwicklung von High-Throughput-Assays für neue Materialien und Entdeckung von niedermolekularen Leitstrukturen gefunden. Hier beschreiben wir eine geführte Material-Screening Ansatz zur Sol-Gel-basierten Materialien, die zur Herstellung von dreidimensionalen Protein-Microarrays zu identifizieren. Der Ansatz identifiziert zunächst Materialien, die als Microarrays gedruckt werden können, schränkt die Anzahl von Materialien durch diejenigen zu identifizieren, die mit einem bestimmten Enzym-Assay sind, und dann schärft in der optimalen Materialien basierend auf Beibehaltung der maximalen Enzymaktivität. Dieser Ansatz wird angewendet, um Microarrays geeignet für zwei verschiedene Enzym-Assays, eine mit Acetylcholinesterase und die andere mit einem Satz von vier zentralen Kinasen bei Krebs eine Rolle zu entwickeln. In jedem Fall war es möglich, die für die quantitative Mikroarrays niedermolekulare Screening-Assays und Produktion von Dosis-abhängigen Inhibitor-Wirkungs-Kurven verwendet werden könnten, zu erzeugen. Wichtig ist, dass die Fähigkeit zu screenen viele Kumpelstoffe produziert Informationen über die Arten von Materialien, die am besten geeignet sowohl Microarray Produktion und Speicherung von Enzymaktivität. Die Materialien Daten geben einen Einblick in Grundmaterial Anforderungen für optimale Anpassung, High-Density-Sol-Gel-abgeleiteten Microarrays.

Durch die Durchführung einer geführten Faktor für das Material-Bildschirm, konnten wir die Anzahl der getesteten Materialien von ~ 20.000 bis ein paar hundert, die Gelierzeiten geeignet für den Druck hatte minimieren. Durch die Anwendung eines strengen Richtlinien erfordern Material Gelbildungszeit von 2,5 Stunden oder mehr, wurden Materialien, die die Druckstiften verstopfen oder produzieren nicht reproduzierbaren Arrays nie gedruckt. Die bedruckbaren Materialien identifiziert, um eine ausreichende (&gt; 2,5 h) Gelierzeiten haben wurden auf 4 verschiedenen funktionalisierten Glasträger Oberflächen gedruckt. Um als &quot;druckbaren&quot; zu werden, musste die maximale Anzahl von Punkten pro Aufnahme Volumen des Stiftes zu bedruckenden (SMP3 = 200) werden. Spots wurden auch für Spotmorphologie bewertet, um sicherzustellen, dass keine Rissbildung oder unerwünschte Phasentrennung eingetreten mit einfachen Hellfeld, wie in 2 gezeigt. Von diesem Stadium identifiziert bedruckbaren Materialien wurden Microarrays mit AChE produziert undKinasen in die gepufferte wässrige Komponente eingearbeitet. Materialien, die mit dem Assay-Verfahren (einschließlich der möglichen Überdruck und Waschen oder Färben Stufen) waren, wurden durch Beobachtung Beibehaltung der Mikroarray Spots (keine Rissbildung, Verlust von Flecken oder ungewöhnliche Fluoreszenzmuster) und eine positive Kontrolle (PC) Negativkontrolle (NC identifiziert ) von größer als 1, da durch Bild beobachtet. Da es sich um etwa 50% der Materialien, eine größere PC / NC-Verhältnis von 3 wurde verwendet, um optimale Materialien unter Beibehaltung der Protein-Aktivität definieren. Durch diese Methode ist, zeigen 26 Sol-Gel-abgeleiteten Materialien, die AChE und 2 enthaltenden Materialien Kinasen zufrieden die&gt; 3 PC / NC Kriterien. Abbildung 3 und Abbildung 4 eine grafische Aufschlüsselung der 5 geführte Material angezeigten Schritte zur Identifizierung der optimalen AChE und Kinase Mikroarrays sind. Die Assays können auch durch die Erzeugung eines Z &#39;Ergebnis überprüft werden. 17 </sup&gt; Dies geschah mit dem Material, das die höchste PC / NC Verhältnis hergestellt. Abbildung 5 zeigt die Z &#39;Grundstück durch den Vergleich des Signals von 200 Punkten, 100 PC und 100 NC nach Überdrucken die Indikator-Farbstoff und Substrat auf der AChE Array erzeugt wird, erhalten. Der Schmerz und die Kinase Arrays führte in den jeweiligen Z &#39;Noten von 0,60 und 0,67, was auf eine ausgezeichnete Test. Es sollte jedoch beachtet werden, dass vor dem Assay-Validierung, on-Array Enzym, Farbstoff, Substrat und Cofaktor Konzentrationen durch Überdrucken einen Bereich von Konzentrationen der einzelnen Komponenten und Auswählen der Konzentration, die die höchste Signalqualität produziert optimiert werden, wie ausführlich an anderer Stelle beschrieben werden musste . 5 Um die Tests zu validieren, wurden quantitative Hemmung erhaltenen Daten mit bekannten und unbekannten AChE-Inhibitoren, wobei die Ergebnisse in doppelte durchgeführt und verwendet, um doppelte Grundstücke (6A) und Hemmkurven (6B und 6C) zu erzeugen. &lt;strong&gt; Spots wurden zunächst mit Mischungen von bekannten biologisch aktiven niedermolekularen Inhibitoren dann mit Farbstoff und Substrat überdruckt und Kontrolle Mischungen, die entweder bekannt oder Inhibitoren keinen Inhibitor enthalten waren. Doppelte Parzellen wurden erzeugt, um die Enzymaktivität zu beurteilen, und beliebige Mischungen, die in weniger als 25% Enzymaktivität führte wurden als positiv für die Hemmung. Einzelne Verbindungen aus solchen Mischungen wurden dann in zweifacher Ausfertigung an die spezifische kleines Molekül (en), die für die Hemmung identifizieren getestet. Einmal identifiziert, diese kleinen Moleküle wurden verwendet, um quantitative Hemmkurven generieren IC 50-Werte und Hemmkonstanten bestimmen. Ähnliche qualitative Ergebnisse wurden mit dem Multi-Kinase-Array mit einer gemeinsamen Kinase-Inhibitor, Staurosporin. 7A und 7B zeigen die Microarray-Bild und zeigen, dass die Signalintensitäten nach Überdrucken und Färben der multikinase(- ATP), Positivkontrolle (+ ATP) und bekannter Inhibitor (+ ATP + inh) Anordnung wie für eine negative Kontrolle erwartet. Um die Fähigkeit zur Hemmung quantitative Daten aus den Microarrays erhalten zu demonstrieren, wurde eine konzentrationsabhängige Hemmung Assay für eine Kinase durchgeführt. Wie in den 8A und 8B gezeigt, nimmt Signalintensität Inhibitorkonzentration zu, und die Reaktion folgt der erwarteten Konzentration Hemmung Kurve für die p38α/MBP Kinase / Substrat-System. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeines Schema für die geführte Materialien Screening-Ansatz. Jeder Block stellt einen Schritt auf dem Bildschirm in der angegebenen Reihenfolge. Die Zahlen auf der linken Seite stellen die Anzahl von Materialien für die Analyse vorbereitet. Mit einem Gelierdauer größer als 2,5 h (Materialien mit Gelierzeiten weniger als 2,5 h are, die durch die durchgestrichen), wird die Anzahl der Materialien, die jede Stufe weitergegeben und vorgetragen während der Material-Bildschirm durch die Zahl auf der rechten Seite angegeben. * Für Materialien mit weniger als optimale Phasentrennung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Abbildung 2. Optische Bilder mit verschiedenen Störungsarten Materialien an der Bedruckbarkeit Schritt des Bildschirms. Ein Bild von einem &quot;guten&quot; Material (zweite Reihe, dritte Spalte) wird ebenfalls zum Vergleich gezeigt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 8, Copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein gerichteter Material Screening-Ansatz für die Identifizierung der optimalen Materialien für die Herstellung von Sol-Gel-abgeleiteten AChE Microarrays. Dauerwelle mit Nachdruckission von Referenz 5, Copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ein gerichteter Materialien Screening-Ansatz für die Identifizierung der optimalen Materialien für die Herstellung von Sol-Gel-abgeleiteten Kinase-Microarrays. Mit Genehmigung aus Lit. 8, Copyright 2013 American Chemical Society Nachdruck. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Abbildung 5. (A) Ein Teil der AChE Microarray zeigt HC (hellgrün) und LC (hellgrün) Spots (ein schwarz-grün-Palette wurde als Pseudocolor für die Klarheit der Präsentation angewendet), (B) eine vergrößerte Ansicht der boxed Bereich zu markieren Ort Morphologie und Ausrichtung;. und (c) eine Z &#39;plot durchgezogenen Linien zeigen den Mittelwert der<html> repliziert, während gestrichelte Linien zu 3SD entsprechen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 5, Copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Abbildung 6. (A) Duplizieren Grundstück für on-Array-Screening von synthetischen Analoga von Amaryllidaceae Alkaloide; (B) IC 50 Stellplätze der identifizierten potentiellen Inhibitoren als Verbindungen 1 und (C) Verbindung 2, mit Fehlerbalken repräsentieren eine Standardabweichung des Mittelwertes von 25 markiert repliziert. Repräsentative Spots gezeigt werden, um Unterschiede in proportionales Signal Inhibitorkonzentrationen illustrieren. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 5, Copyright 2013 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Abbildung 7. On-Array-Assay unter Verwendung von vier Kinasen 1.4SS/1.0PVA zum Mitreißen und gedruckt an ein Amin-derivatisierten Folie. (A) Ein Bild von einem Abschnitt der Mikroarray in denen Punkte mit Kinasen mit ihren jeweiligen Substraten zusammen mit Puffer eingeschlossen wurden überdruckt (NC, obere Reihe), oder Lösungen, die ATP (PC, mittlere Reihe) oder ATP + Staurosporin (untere Reihe). (B) Balkendiagramme Vergleich Signalintensitäten zwischen gesperrt und ungehemmt Reaktionen, nach Abzug der Hintergrund-Signale und Fehlerbalken repräsentieren eine Standardabweichung des Mittelwertes von 25 Wiederholungen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 8, Copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Fig. 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Abbildung 8. Inhibiti. auf Assay auf einem Mikroarray p38a/MBP (A) Sektionen von Mikroarrays, welche repräsentative Punkte overspotted mit variierenden Konzentrationen von Staurosporin, wie angegeben (die Bilder wurden von einer einzigen Abtastung der gleichen Folie erhalten wird; zusammengesetzte Bild wird zur Klarheit gezeigt). (B) 50 IC-Kurve aus den analysierten Array Bilder erzeugt. Die Intensität bei 100 mM erhalten wurde aus allen Bildern subtrahiert, alle anderen Intensitäten wurden durch Einstellen der Intensität bei 10 nM auf einen Wert von 100% der Aktivität erhalten normalisiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 8, Copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Abbildung 9. Bilder von mikroskopischen Stealth-Stift für Kontaktstift-Druck mit verschiedenen Unvollkommenheiten verwendet: (A) verstopft ist, (B) gebogen.

Eine geführte Material-Screening Ansatz zur Sol-Gel abgeleiteten Protein-Microarrays mit dotierten eine aufstrebende Pin-Druckverfahren der Fertigung entwickeln beschrieben. Diese Methodik wird durch die Entwicklung von Acetylcholinesterase-und Multi-Kinase-Microarrays, die für eine kostengünstige Screening kleiner Moleküle verwendet werden aufgezeigt.

A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue auf Soul-Gel basierende Materialien für die Herstellung von Mikroarrays zu identifizieren und diese für Enzym-Assays mit Nanoliter-Volumina zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst Materialien identifiziert werden, die ausreichend lange Gelierzeiten aufweisen, um eine Gelierung in der Mikroarray-Drucknadel während des Druckvorgangs zu vermeiden. Der zweite Schritt besteht darin, Materialien mit langen Gelierzeiten hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur reproduzierbaren Herstellung von Mikroarrays, ihrer Beständigkeit gegen Rissbildung, der Haftqualität, unerwünschter Phasentrennung und letztlich ihrer hohen Aktivität für eingebettete Enzyme zu bewerten.Anschließend wird das Enzym von Interesse als Mikroarray unter Verwendung der optimalen Materialien aufgetragen, und seine Fähigkeit, die Assaylösung punktgenau zu überdecken und eine messbare enzymatische Reaktion hervorzurufen, wird geprüft. Der letzte Schritt besteht darin, die Materialien hinsichtlich ihrer Eignung zur Bereitstellung hochgradig reproduzierbarer Assays mit dem Enzym von Interesse zu bewerten und quantitative Daten zu generieren. Das endgültige Material für die Array-Herstellung wird dann ausgewählt.Schließlich werden mit Soul-Gel-abgeleiteten Protein-Microarrays kleine Moleküle identifiziert, die die Enzymaktivität verringern. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der plattenbasierten Bildschirmung besteht darin, dass große Mengen an Materialien systematisch und sehr schnell mit geringen Reagenzvolumina getestet werden können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Technik nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da es möglich ist, dass Materialien in den Drucknadeln verkleben.Wenn diese anschließend nicht ordnungsgemäß entfernt werden, führt dies zu übersehenen Stellen, die als nicht druckbare Materialien interpretiert werden können. Bereiten Sie zunächst die verschiedenen Additiv-Lösungen gemäß der beigefügten schriftlichen Protokollbeschreibung vor. Viele der Lösungen können im Voraus hergestellt und bis zu einem Monat oder länger unter geeigneten Bedingungen gelagert werden, einige müssen jedoch am Tag des Experiments frisch angesetzt werden.Mischen Sie die auf Natriumsilikat basierenden Sägen unmittelbar vor der Verwendung und stellen Sie sicher, dass sie auf Eis gehalten werden. Das SOS muss innerhalb einer Stunde nach Zugabe des Wassers verwendet werden, da längere Wartezeiten zu abnehmenden und inkonsistenten DATION-Zeiten führen. Bereiten Sie anschließend verschiedene Kombinationen aus Puffern, Salans-Polymeren und Organs-Lanen gemäß der beiliegenden schriftlichen Anleitung vor, um festzustellen, welche Kombinationen als druckbares Material mit Dilationszeiten von mehr als 2,5 Stunden verwendet werden können.Nachdem eine Reihe von Kombinationen identifiziert wurde, stellen Sie die Luftfeuchtigkeit in der Druckkammer auf 80 bis 90 % ein; eine geringere Luftfeuchtigkeit kann zu Probenevaporation und Inkonsistenzen beim Drucken führen, da die Ablagevolumina mit dem Drucker sehr klein sind. Nun bereit, ordnen Sie die zu druckenden Array-Muster mithilfe des Chip Writer Pro-Programms an. Stellen Sie die Fahrgeschwindigkeit in XY-Richtung auf 10 Millimeter pro Sekunde und die Probennahmegeschwindigkeit in Z-Richtung auf zwei Millimeter pro Sekunde bei einer Probenaufgabedauer von 2,5 Sekunden unter Verwendung der zuvor identifizierten Saw-Gel-Kombinationen ein.Bereiten Sie 25 Mikroliter der Grundmaterialien vor, indem Sie entsprechende Polymere, Organometallverbindungen und niedermolekulare Zusatzstoffe kombinieren, die im Vorscreening identifiziert wurden. Geben Sie 50 Millimolar HEPES mit einem pH-Wert von 8,0 in einzelne Vertiefungen einer 384-Loch-Mikrotiterplatte. Anschließend werden bis zu vier geschlitzte Hüllnadeln mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern in doppelt destilliertem Wasser sonifiziert.Nach 15 Minuten unter einem Stickstoffstrom testen. Anschließend einen Pinselreiniger verwenden, um restliche Feuchtigkeit aus dem Pinhalter zu entfernen, und den Pin vorsichtig in den Druckkopf des Kontakt-Pin-Druckroboters einsetzen. Die Nichtentfernung von Restfeuchtigkeit kann dazu führen, dass sich der Pin im Halter nicht frei bewegen kann, was zu ausgelassenen Stellen führen kann.Fügen Sie dann 25 µL der jeweiligen SA unmittelbar vor dem Drucken in das Bohrloch ein. Mischen Sie die Lösung durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren, wobei dieser Vorgang beim Mischen mit der Pipette 50-mal wiederholt wird. Minimieren Sie die Menge an eingeschlossener Luft in der Lösung.Luftblasen verhindern das vollständige Befüllen der Probe im Pin. Danach den Pin senken, um ihn in die Probe einzutauchen. Sobald die Pins befüllt sind, beginnen Sie den Druckvorgang und drucken die Probe auf eine Objektträgeroberfläche. Unterbrechen Sie den Druckvorgang, bevor Salz zur anschließenden Quellplatte hinzugefügt wird. Bei unterbrochenem Prozess entfernen Sie die Drucknadel mithilfe eines Magneten und platzieren einen Rohrreiniger im Druckkopf, um die Ansammlung von Feuchtigkeit im Druckkopf zu verhindern. Spülen Sie die Drucknadel anschließend mit doppelt destilliertem Wasser ab und behandeln Sie sie 30 Sekunden lang einer Ultraschallreinigung in sauberem, doppelt destilliertem Wasser. Trocknen Sie anschließend den Druckstift unter einem Strom von Stickstoff und setzen Sie ihn danach wieder in den Druckkopf ein. Fahren Sie mit dem Mischen, Drucken und Reinigen für alle verbleibenden Proben in der Quellplatte fort; dabei können bis zu 12.000 Tropfen mit einem Durchmesser von 100&nbsp;Mikrometern auf einem einzigen Objektträger abgesetzt werden. Nach Beendigung des Druckvorgangs lagern Sie das Array mindestens 30&nbsp;Minuten und bis zu 24&nbsp;Stunden in der Druckkammer bei einer Luftfeuchtigkeit von 80 bis 90&nbsp;%.Stellen Sie kurz vor der Verwendung 50 Mikroliter der positiven Kontrolle her, indem Sie 25 Mikroliter einer einmillimolaren Acetylcholiniodid-Lösung, 0,14 Mikroliter einer fünfmillimolaren BODIPY-FL-Cystein-Lösung und 25 Millimolar Tris bei pH 7,0 mit 4 % Glycerol in einem Wells einer 384-Well-Mikrotiterplatte mischen. Pipettieren Sie die Lösung langsam mehrmals auf und ab, um sie zu vermischen, ohne Blasen zu bilden. Bereiten Sie anschließend die negativen Kontrollen kurz vor der Verwendung vor, indem Sie 0,14 Mikroliter einer fünfmillimolaren BOAI-PI-FL-Cystein-Lösung mit 49,86 Mikrolitern 25 Millimolar Tris bei pH 7,0 mit 4 % Glycerol in einem weiteren Well einer 384-Well-Mikrotiterplatte vermengen und vorsichtig mischen. Drucken Sie die Kontrollen mithilfe der im vorherigen Abschnitt beschriebenen Verfahren auf die gealterten Mikroarrays. Verwenden Sie jedoch statt der Pins mit 100-Mikrometer-Durchmesser geschlitzte Pins mit einem Durchmesser von 235 Mikrometern.Dadurch wird sichergestellt, dass die Lösungen die zuvor abgesetzten Tropfen vollständig bedecken. Die Tropfen altern die Arrays eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeit von 80 bis 90 %, bedingt durch die autokatalytische Hydrolyse von Acetylcholin. Längere Inkubationszeiten können aufgrund einer erhöhten Enzymaktivität zu falsch-positiven Ergebnissen führen.Stellen Sie sicher, dass der Alpha Innotech Novo Array-Imager eingeschaltet ist und mit einem Anregungsfilter von 478 ± 17 Nanometer und einem Emissionsfilter von 538 ± 21 Nanometer für die Messung der Acetylcholinesterase-Mikroarrays ausgestattet ist. Danach wird der Objektträger mit den Spot-Seiten nach oben in den Objektträgerhalter eingelegt. Stellen Sie die Anzahl der Vorschaubereiche so ein, dass mindestens ein Bereich auf jeder Seite des Mikroskopobjektträgers mit einer Mindestauflösung von vier Mikrometern unter Verwendung der automatischen Belichtung angezeigt wird.Wenn die Parameter als akzeptabel erachtet werden, erfassen Sie ein Objektträgerbild und speichern Sie es als TIFF-Datei. Öffnen Sie anschließend das aufgenommene Objektträgerbild in ImageJ 64. Klicken Sie auf das Werkzeug „Oval Selection“ und markieren Sie jeden einzelnen Spot.Wählen Sie einen Bereich, der etwas größer ist als der beobachtete Fleck, und stellen Sie sicher, dass Sie eine einheitliche Größe zwischen den Flecken verwenden, um die Subjektivität von Image J zu verringern. Messen Sie anschließend die Signalintensität jedes Flecks mithilfe der Messoption unter dem Reiter „Analyze“. Bilden Sie den Mittelwert der Intensität aus 25 ähnlichen positiven Kontrollflecken und teilen Sie diesen durch den Mittelwert der Intensität von 25 ähnlichen negativen Kontrollflecken, um die Verhältnisse von positiver zu negativer Kontrolle für die einzelnen Materialzusammensetzungen zu erhalten.Hier wird ein Beispiel für die Dynamik der mit diesen Methoden hergestellten Mikroarrays gezeigt. Die positiven Kontrollen ergaben helle grüne Bereiche, während die negativen Kontrollen deutlich schwächer leuchtende Flecken zeigten. Die mittels Image J 64 gemessene Intensität zeigt, dass die positiven Kontrollen durchschnittlich etwa 22.000 relative Fluoreszenzeinheiten erreichen, während die negativen Kontrollen im Durchschnitt nahe bei 8.000 liegen.Die gestrichelten Linien stellen drei Standardabweichungen vom Mittelwert dar. Hier sind Beispiel-Microarrays für eine Honor-Array-Screening-Analyse synthetischer Analoga der Ameral-Sier-Alkaloide, die als Verbindung eins und Verbindung zwei identifiziert wurden. Beide Achsen repräsentieren den Prozentsatz des Enzyms, wie er durch das Fluoreszenzsignal bestimmt wurde.Bei der doppelten Durchführung repräsentiert die Nähe der Punkte zur Diagonalen eine hohe Reproduzierbarkeit des Assays. Hier werden IC50-Diagramme von zwei verschiedenen potenziellen Inhibitoren gezeigt. Verbindung eins führte zu einem IC50-Wert von 16 µM, während der IC50-Wert von Verbindung zwei 21 µM betrug. Oberhalb sind repräsentative Spotbilder dargestellt, um Unterschiede im Signal in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration zu veranschaulichen.Das hier gezeigte Array wurde mit vier verschiedenen Kinasen, P 38 MAP-Kinase, EGFR und GSK, bedruckt und anschließend mit Puffer allein, Puffer enthaltend A TP sowie Puffer enthaltend A TP und Starrosporin, einem Inhibitor der Enzymaktivität, überdruckt. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Einfluss des Kinaseinhibitors Starrosporin, basierend auf den resultierenden Fluoreszenzintensitäten, wie hier beschrieben. Der größte Unterschied bei der hier verwendeten Konzentration von Storsporin ergab sich bei den P 38-Spots.Hier sind repräsentative Stellen eines P 30 8:00 AM BP-Mikroarrays dargestellt, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Stor-Sporin überspottet wurden. Wie angegeben, betrug die IC50 dieses Moleküls ein Mikromolar und ist im rechten Graphen dargestellt. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß gemäß diesem Verfahren durchgeführt wird.Andere Methoden wie Immunassays oder Proteininteraktionsassays können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen im Bereich Diagnostik oder Entdeckung von kleinen Molekülen zu beantworten.

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