A Guided Materialien Screening-Ansatz für die Entwicklung von Quantitative Sol-Gel-Derived Protein Microarrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue Seelengel-basierte Materialien für die Herstellung von Microarrays zu identifizieren und diese für Nanovolumen-Enzymassays zu verwenden. Dies wird erreicht, indem zunächst Materialien identifiziert werden, die ausreichend lange Laufzeiten aufweisen, um ein Gelieren im Microarray-Druckstift während des Druckprozesses zu vermeiden. Der zweite Schritt besteht darin, Materialien mit langen Verarbeitungszeiten auf ihre Fähigkeit, als Microarrays zu drucken, Reproduzierbarkeit, Rissbeständigkeit, Adhäsionsqualität, unerwünschte Phasentrennung und letztendlich hohe Aktivität für eingeschlossene Enzyme zu bewerten.

Als nächstes wird das Enzym von Interesse als Microarray unter Verwendung der optimalen Materialien gedruckt und seine Fähigkeit getestet, die Assay-Lösung zu überflecken und eine messbare enzymatische Reaktion zu erzeugen. Der letzte Schritt besteht darin, die Materialien auf ihre Fähigkeit zu bewerten, hochgradig reproduzierbare Assays mit dem interessierenden Enzym zu liefern und quantitative Daten zu generieren. Anschließend wird das endgültige Material für die Array-Herstellung ausgewählt.

Letztendlich werden aus Seelengel gewonnene Protein-Microarrays verwendet, um kleine Moleküle zu identifizieren, die die Enzymaktivität reduzieren. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie dem plattenbasierten Screening besteht darin, dass Sie eine große Anzahl von Materialien sehr schnell und mit geringen Mengen an Reagenzien systematisch screenen können. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es möglich ist, dass Materialien in den Druckstiften gelieren.

Wenn diese dann richtig gereinigt werden, führt dies zu übersehenden Stellen, die als nicht druckbare Materialien interpretiert werden können. Bereiten Sie zunächst die zahlreichen additiven Lösungen vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Viele der Lösungen können vorgefertigt und unter den richtigen Bedingungen bis zu einem Monat oder länger gelagert werden, aber einige müssen am Tag des Experiments hergestellt werden.

Mischen Sie die Sägen auf Natriumsilikatbasis unmittelbar vor dem Gebrauch und bewahren Sie sie unbedingt auf Eis auf. Das SOS muss innerhalb einer Stunde nach der Zugabe des Wassers verwendet werden, da längere Wartezeiten zu verkürzten und ungleichmäßigen DATIONSZEITEN führen. Als nächstes bereiten Sie verschiedene Kombinationen von Puffern, Salanenpolymeren und Organbahnen vor, wie im begleitenden Textprotokoll angewiesen, um zu identifizieren, welche Kombinationen als druckbares Material mit Dilatationszeiten von mehr als 2,5 Stunden verwendet werden können.

Sobald eine Reihe von Kombinationen identifiziert wurden, stellen Sie die Luftfeuchtigkeit in der Druckkammer auf 80 bis 90 % ein. Eine Luftfeuchtigkeit von weniger als 80 % kann aufgrund der geringen Abscheidungsvolumina mit dem Drucker zu Probenverdunstung und Inkonsistenzen beim Drucken führen. Ordnen Sie nun die zu druckenden Array-Muster mit dem Chip Writer Pro-Programm an. Stellen Sie den Verfahrweg in XY-Richtung auf 10 Millimeter pro Sekunde und die Annäherungsgeschwindigkeit der Probe in Z-Richtung auf zwei Millimeter pro Sekunde ein, wobei die Ladezeit der Probe von 2,5 Sekunden unter Verwendung der zuvor identifizierten Sägegelkombinationen erreicht wird.

Bereiten Sie 25 Mikroliter der Ausgangsmaterialien vor, indem Sie entsprechende Polymere, Organobahnen und niedermolekulare Additive kombinieren, die durch den Vorscreening-Prozess identifiziert wurden. Verwendung von 50 Millimolaren Häufungen mit einem pH-Wert von 8,0 in einzelnen Vertiefungen einer 384-Well-Mikrotiterplatte. Beschallen Sie dann bis zu vier geschlitzte Mantelstifte mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern in doppelt destilliertem Wasser.

Probieren Sie sie nach 15 Minuten unter einem Stickstoffstrahl aus. Entfernen Sie anschließend mit einem Rohrreiniger Restfeuchtigkeit aus dem Inneren des Stifthalters und platzieren Sie den Stift vorsichtig im Druckkopf des Kontaktstift-Druckroboters. Wenn die Restfeuchtigkeit nicht entfernt wird, kann sich der Stift nicht frei mit dem Halter bewegen, was zu übersehenden Stellen führt.

Gib dann kurz vor dem Druck 25 Mikroliter des jeweiligen SA in die Vertiefung. Mischen Sie die Lösung mit einer Auf- und Ab-Pipettierbewegung 50 Mal wiederholen, wenn Sie mit der Pipette mischen. Minimieren Sie die Menge an Luft, die in die Lösung eingearbeitet wird.

Luftblasen verhindern eine vollständige Beladung der Probe innerhalb des Stifts. Laden Sie anschließend den Stift, indem Sie ihn in die Probe absenken. Sobald die Stifte eingelegt sind, starten Sie den Druckvorgang und drucken Sie das Muster auf eine Objektträgeroberfläche.

Pausieren Sie den Druckvorgang, bevor Sie Salz auf die nachfolgende Quellplatte geben. Nun, wenn der Vorgang pausiert ist, entfernen Sie den Druckstift mit einem Magneten und platzieren Sie einen Pfeifenreiniger in den Druckkopf, um Feuchtigkeitsansammlungen im Druckkopf zu verhindern. Spülen Sie dann den Druckstift mit doppelt destilliertem Wasser ab und beschallen Sie ihn 30 Sekunden lang in sauberem, doppelt destilliertem Wasser.

Trocknen Sie anschließend den Druckstift unter einem Stickstoffstrahl und setzen Sie den Stift dann wieder in den Druckkopf ein. Fahren Sie mit dem Mischen, Drucken und Reinigen aller in der Quellplatte verbleibenden Proben fort, bis zu 12.000 Punkte mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern können auf einem einzigen Objektträger abgeschieden werden. Sobald der Druck abgeschlossen ist, lassen Sie das Array mindestens 30 Minuten und bis zu 24 Stunden in der Druckkammer bei 80 bis 90 % Luftfeuchtigkeit altern.

Bereiten Sie 50 Mikroliter der Positivkontrolle kurz vor der Verwendung vor, indem Sie 25 Mikroliter eines Millimolars, Acetylcholiniodid und 0,14 Mikroliter fünf Millimolare Bodi Pi, FIL-Cystein und 25 Millimolare Tris bei einem pH-Wert von 7,0 mit 4 % Glycerin in der Vertiefung einer 384-Well-Mikrotiterplatte kombinieren und die Lösung langsam auf und ab pipettieren, um sie zu mischen, ohne Blasen zu bilden. Bereiten Sie als Nächstes die Negativkontrollen kurz vor der Verwendung vor, indem Sie 0,14 Mikroliter von fünf Millimolaren Boai PI FIL Cystein mit 49,86 Mikrolitern von 25 Millimolar Triss bei pH 7,0 mit 4 % Glycerin in eine andere Vertiefung einer 384-Well-Mikrotiterplatte mischen und sie vorsichtig mischen, die Kontrollen auf die gealterten Microarrays drucken, wobei die gleichen Verfahren verwendet werden, die im vorherigen Abschnitt beschrieben wurden. Anstelle der Stifte mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern haben Sie jedoch Hauptstifte mit einem Durchmesser von 235 Mikrometern geschlitzt.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Lösungen die zuvor abgelagerten Stellen vollständig abdecken. Spots altern die Arrays bei 80 bis 90 % Luftfeuchtigkeit für eine Stunde bei Raumtemperatur aufgrund der Autohydrolyse von Acetylcholin. Längere Inkubationszeiten können aufgrund der erhöhten Enzymaktivität zu falsch positiven Ergebnissen führen.

Stellen Sie sicher, dass der alpha innotech novo Array Imager eingeschaltet und mit einem 478 plus oder minus 17 Nanometer Anregung und 538 plus oder minus 21 Nanometer Emissionsfilter für die Messung der Acetylcholinesterase Microarrays ausgestattet ist. Legen Sie dann die Folie mit den Punkten nach oben in den Folienhalter. Stellen Sie die Anzahl der Vorschauabschnitte so ein, dass mindestens einer auf jeder Seite des Objektträgers mit einer Mindestauflösung von vier Mikrometern bei automatischer Belichtung in der Vorschau angezeigt wird.

Sobald die Parameter für akzeptabel befunden werden, erfassen Sie ein Folienbild und speichern Sie es als TIFF-Datei. Öffnen Sie anschließend das aufgenommene Diabild in Bild J 64. Klicken Sie auf das Auswahlwerkzeug "Oval" und wählen Sie die einzelnen Punkte aus.

Wählen Sie einen Bereich aus, der etwas größer als der beobachtete Spot ist, und achten Sie darauf, eine einheitliche Größe zwischen den Spots zu verwenden, um die Subjektivität des Bildes zu verringern J. Messen Sie dann die Signalintensität jedes Spots mit der Option "Messen". Auf der Registerkarte "Analysieren". Die Intensität von 25 ähnlichen positiven Kontrollpunkten wird gemittelt und durch die durchschnittliche Intensität von 25 ähnlichen negativen Kontrollpunkten dividiert, um ein Verhältnis von positiver Kontrolle zu negativer Kontrolle für die einzelnen Materialzusammensetzungen zu erhalten.

Hier sehen Sie ein Beispiel für den Dynamikbereich der resultierenden Microarrays, die mit diesen Methoden hergestellt wurden. Die hohen Kontrollen führten zu hellgrünen Bereichen, während die niedrigen Kontrollen zu deutlich dunkleren Flecken führten. Die Intensität, wie sie in Bild J 64 gemessen wurde, zeigt, dass die hohen Kontrollen durchschnittlich etwa 22.000 relative Fluoreszenzeinheiten betrugen, und die niedrigen Kontrollen lagen im Durchschnitt bei etwa 8.000.

Die gestrichelten Linien stellen drei Standardabweichungen vom Mittelwert dar. Hier sind Beispiel-Microarrays für ein Honor-Array-Screening von synthetischen Analoga von Ameral-Sier-Alkaloiden, die als Verbindung eins und Verbindung zwei identifiziert wurden. Beide Achsen stellen den prozentualen Anteil des Enzyms dar, der durch das Fluoreszenzsignal bestimmt wird.

In doppelter Ausführung stellt die Nähe der Punkte zur Diagonale eine hohe Reproduzierbarkeit des Assays dar. IC 50-Diagramme von zwei verschiedenen potentiellen Inhibitoren sind hier dargestellt. Verbindung eins führte zu einem IC 50-Spiegel von 16 Mikromolaren, während der IC 50 von Verbindung zwei 21 Mikromolar war. Repräsentative Punkte sind oben dargestellt, um Unterschiede im Signal proportional zu den Inhibitorkonzentrationen zu veranschaulichen.

Das hier gezeigte Array wurde mit vier verschiedenen Kinasen, P 38 Map Kinase, EGFR und GSK, gedruckt und mit Puffer allein, Puffer mit A TP und Puffer mit A TP und Starro Sporin, einem Inhibitor der Enzymaktivität, überdruckt. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Effekt des Kinase-Inhibitors Starro Sporin basierend auf den resultierenden Fluoreszenzintensitäten, wie hier beschrieben. Der größte Unterschied bei der Konzentration des hier verwendeten Stor-Sporins war bei den P 38-Spots.

Hier sind repräsentative Flecken eines P 30 8:00 AM BP Microarrays dargestellt, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von stor sporin überfleckt wurden. Wie angedeutet, wurde das IC 50 dieses Moleküls als ein Mikromolar bestimmt und ist in der Grafik rechts nach der Beherrschung dargestellt. Diese Technik kann in wenigen Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren wird dies getan.

Andere Methoden wie Immunoassays oder Proteininteraktionsassays können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit der Diagnostik oder der Entdeckung kleiner Moleküle zu beantworten.