Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
January 7th, 2019
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Proteinprotein-Wechselwirkungen zu beantworten, indem sie den Nachweis neuartiger Bindungspartner für extrazelluläre Proteine ermöglicht, sowohl bei hohem Durchsatz als auch mit hoher Empfindlichkeit. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass Sie mit nur wenigen Mikrogramm Protein Hunderte von Dias mit dem Micro-Array-Drucker erzeugen können. Verwenden Sie einen Standard-Mikroarrayer für den Foliendruck.
Dieses Gerät hat eine Kapazität von 57 Dias pro Durchlauf, verwendet einen Druckkopf mit 48 Spotting-Pins und kann bis zu 8.000 Spots pro Folie aufnehmen. Generieren Sie Arbeitsplatten mit 384 Wellplatten bei 10 Mikroliter Nasth pro Bohrung aus den Lagerplatten. Führen Sie diesen Schritt manuell aus, bevor Sie mit dem Micro-Arrayer drucken.
Dann erkennen Proteine mit Quill-Typ Spotting-Pins auf Epoxid-Silan-Dias bei 60%Feuchtigkeit, um eine Austrocknung der Proteinflecken zu verhindern. Cy3-beschriftetes Rinderserumalbumin kann zwischen jeder Proteinprobe doppelt gesichtet werden, um das Array für die Maskenanpassung zu visualisieren. Entfernen Sie nach dem Druck die Protein-Mikro-Array-Dias aus der befeuchteten Umgebung.
Verwenden Sie als Nächstes einen Ultraschall-Fogger, um einen feinen Nebel der Blockierlösung zu erzeugen, der sich auf der Gleitfläche absetzt. Blockieren Sie dann die Dias über Nacht mit 5% Milch in PBST, um die Oberfläche zu aktivieren. Lagern Sie Dias bei minus 20 Grad Celsius in 50% Glycerin, um das Einfrieren zu verhindern.
Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Proteinen sind oft durch ihre geringen Affinitäten gekennzeichnet. Um den Nachweis dieser Wechselwirkungen zu ermöglichen, haben wir durch die Erhöhung der Bindungs-Avidität einen multivalenten Ansatz entwickelt, der auf der Erfassung des abgefragten Proteins basiert, ausgedrückt als FC-markierte extrazelluläre Domänen auf Protein A-beschichteten Mikroperlen. Drehen Sie den Träger IgG, der mit Cy5 Mono-Reaktivfarbstoff beschriftet wurde, wie im Textprotokoll beschrieben.
Um das Molverhältnis des Abfrageproteins und des Cy5 IgG zu berechnen, dividieren Sie das Molekulargewicht des Abfrageproteins durch das Molekulargewicht des IgG und multiplizieren Sie es mit 40 Mikrogramm pro Milliliter, um die benötigte Cy5-IgG-Konzentration zu bestimmen. Sobald alle Verhältnisse ermittelt wurden, bilden die Mikroperlenprotein-Komplex durch die Kombination der FC-getaggten Abfrage und der Cy5 IgG mit dem Protein A Mikroperlen. Mischen Sie die Aufhängung in PBS auf einem Rohrrotator für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.
Um mit dem Screening zu beginnen, wärmen Sie die vorbereiteten Dias bei Raumtemperatur, bevor Sie auf die Hybridisierungsstation geladen werden. Um das Screening durchzuführen, waschen Sie zuerst das Mikro-Array mit PBST für eine Minute, um Restglycerin zu entfernen. Laden Sie 200 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Protein A in PBS 5%Milch und inkubieren für 30 Minuten, um zu verhindern, dass unkomplexe Protein A Mikroperlen an FC-markierte Proteine binden, die im Mikro-Array vorhanden sein können.
Nach dem Abwälten der Hybridisierungsstation werden die Dias mit PBST abgeladen, 200 Mikroliter des Abfrage-Mikroperlenkomplexes in Gegenwart von einem Milligramm pro Milliliter-Protein A geladen und 30 Minuten inkubiert. Nach Hybridisierung und Waschen der Dias durch die Hybridisierungsstation gleitet mit Wasser und legen Sie sie in einzelne 50 Milliliter Konische Rohre. Trocknen Sie die Rohre, indem Sie bei 900 mal G für fünf Minuten drehen.
Scannen Sie schließlich die Dias mit einem Mikro-Array-Scanner, der für die Erkennung der Cy3- und Cy5-Fluoreszenz mit 532 bzw. 635 Nanometern geeignet ist. Hier ist ein repräsentatives Bild einer gedruckten Folie zu sehen. Die Cy3-beschrifteten Rinderserum-Albumin-Spots sind grün.
Die Spots wurden als Qualitätskontrolle des Druckprozesses in zwei Teilen gedruckt. Repräsentative Ergebnisse eines verwaisten Proteins, das zur Identifizierung von Bindungspartnern mit der extrazellulären Protein-Mikroarray-Technologie gescreent wird, werden hier gezeigt. Die doppelten roten Flecken werden als Treffer für das abgeschirmte Abfrageprotein identifiziert.
Diese beschriebene Methode ist sehr vielseitig und kann für den Druck einer Vielzahl von Proteinbibliotheken verwendet werden, seien es spezifische Proteinfamilien oder große Zusammenstellungen von Proteinen wie unserer. Jedes Protein von Interesse kann ausgewertet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dias mit Sorgfalt zu behandeln und sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen, um den Verlust der Aktivität der gedruckten Proteine zu verhindern.
Nach dem Screen eines Proteins von Interesse, ist es dringend ratsam, alle Treffer, die durch die Verwendung von orthogonalen Technologien beobachtet werden, wie Oberflächenplasmonresonanz, weiter zu validieren. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher geebnet, um extrazelluläre Protein-Wechselwirkungen beim Menschen zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert ein Protokoll zur Untersuchung von extrazellulären Protein-Mikroarrays zur Identifizierung neuartiger Rezeptor-Ligand-Interaktionen mit hohem Durchsatz. Es wird auch eine Methode beschrieben, um die Erkennung transienter Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung von Protein-Mikroperlen-Komplexen zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissensgebiet
- Protein-Protein-Interaktionen
- Extrazelluläre Proteine
- Hochdurchsatz-Screening
Hintergrund
- Das Verständnis von Rezeptor-Ligand-Interaktionen ist in der Biologie entscheidend.
- Transiente Protein-Protein-Interaktionen sind oft schwer zu erkennen.
- Mikroarrays bieten eine Plattform für die Hochdurchsatz-Analyse.
- Protein-Mikroperlen-Komplexe können die Erkennungsempfindlichkeit verbessern.
Zweck der Studie
- Neue Bindungspartner für extrazelluläre Proteine zu identifizieren.
- Die Empfindlichkeit der Erkennung transienter Interaktionen zu verbessern.
- Mikroarray-Technologie für effizientes Screening zu nutzen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Mikroarray-Druckern für die Folienerzeugung.
- Vorbereitung von Arbeitsplatten unter Verwendung von 384-Well-Platten.
- Manuelle Vorbereitung der Proben vor dem Foliendruck.
- Hochkapazitives Drucken mit mehreren Folien pro Durchgang.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung neuartiger Rezeptor-Ligand-Interaktionen.
- Hohe Empfindlichkeit bei der Erkennung transienter Interaktionen demonstriert.
- Effiziente Nutzung minimaler Proteinmengen für umfangreiches Screening.
- Erzeugung von Hunderten von Folien aus nur wenigen Mikrogramm Protein.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert die Fähigkeit zur Untersuchung von Proteininteraktionen.
- Mikroarray-Technologie ist effektiv für die Hochdurchsatz-Analyse.
- Diese Methode kann die Forschung in der Proteinbiologie erheblich vorantreiben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-throughput extracellular protein microarray technology addresses a critical bottleneck in mapping low-affinity receptor-ligand interactions, which are central to target validation and therapeutic discovery. By enabling robust detection of transient extracellular protein interactions with minimal sample requirements, this approach enhances predictive confidence at the earliest stages of biopharma R&D. Its scalability and sensitivity support portfolio-wide interrogation of novel targets and de-risking of biological hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of novel extracellular binding partners for target validation.
- Supports biological de-risking by revealing previously undetectable low-affinity interactions.
- Facilitates rapid triage of candidate targets based on interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein microarrays for downstream screening workflows.
- Standardizes detection of weak protein-protein interactions for reproducible assay development.
- Enables high-throughput, quantitative evaluation of extracellular protein libraries.
Translational & Preclinical Research
- Aligns discovery findings with disease-relevant extracellular signaling pathways.
- Provides continuity from target identification to preclinical validation of interaction networks.
- De-risks translational progression by confirming functional extracellular interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This technology integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting hypothesis-driven screening and mechanistic de-risking of extracellular targets.
- Discovery Biology: Enables high-sensitivity mapping of receptor-ligand networks for hypothesis testing.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microarray outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts to support statistical evaluation of binding events.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by confirming extracellular protein interactions relevant to disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable platform for repeated interrogation of diverse protein libraries across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes high-throughput workflows with minimal protein consumption and robust reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by clarifying extracellular interaction landscapes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, labeling, and microarray handling.
- Needs access to microarray printers, hybridization stations, and fluorescence scanners.
- Demands rigorous cross-team standardization for slide preparation and data analysis.
- Adaptable to various protein families and library sizes with careful protocol adherence.
- Dependent on orthogonal validation (e.g., surface plasmon resonance) for hit confirmation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Extracellular Protein Microarray Printing
1:55
Preparation of Multivalent Bait Complexes
3:09
Extracellular Protein Microarray Screening
4:36
Results: Evaluation of Extracellular Protein Microarray Slide Printing and Screen of an Orphan Query Protein
5:11
Conclusion
