Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bildschirm extrazelluläre Protein Microarrays zur Identifizierung von Roman-Rezeptor-Ligand-Interaktionen in hohem Durchsatz. Wir beschreiben auch eine Methode zur Erkennung von transienten Proteinprotein Interaktionen zu verbessern mithilfe von Protein-Microbead-komplexe.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Proteinprotein-Wechselwirkungen zu beantworten, indem sie den Nachweis neuartiger Bindungspartner für extrazelluläre Proteine ermöglicht, sowohl bei hohem Durchsatz als auch mit hoher Empfindlichkeit. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass Sie mit nur wenigen Mikrogramm Protein Hunderte von Dias mit dem Micro-Array-Drucker erzeugen können. Verwenden Sie einen Standard-Mikroarrayer für den Foliendruck.

Dieses Gerät hat eine Kapazität von 57 Dias pro Durchlauf, verwendet einen Druckkopf mit 48 Spotting-Pins und kann bis zu 8.000 Spots pro Folie aufnehmen. Generieren Sie Arbeitsplatten mit 384 Wellplatten bei 10 Mikroliter Nasth pro Bohrung aus den Lagerplatten. Führen Sie diesen Schritt manuell aus, bevor Sie mit dem Micro-Arrayer drucken.

Dann erkennen Proteine mit Quill-Typ Spotting-Pins auf Epoxid-Silan-Dias bei 60%Feuchtigkeit, um eine Austrocknung der Proteinflecken zu verhindern. Cy3-beschriftetes Rinderserumalbumin kann zwischen jeder Proteinprobe doppelt gesichtet werden, um das Array für die Maskenanpassung zu visualisieren. Entfernen Sie nach dem Druck die Protein-Mikro-Array-Dias aus der befeuchteten Umgebung.

Verwenden Sie als Nächstes einen Ultraschall-Fogger, um einen feinen Nebel der Blockierlösung zu erzeugen, der sich auf der Gleitfläche absetzt. Blockieren Sie dann die Dias über Nacht mit 5% Milch in PBST, um die Oberfläche zu aktivieren. Lagern Sie Dias bei minus 20 Grad Celsius in 50% Glycerin, um das Einfrieren zu verhindern.

Wechselwirkungen zwischen extrazellulären Proteinen sind oft durch ihre geringen Affinitäten gekennzeichnet. Um den Nachweis dieser Wechselwirkungen zu ermöglichen, haben wir durch die Erhöhung der Bindungs-Avidität einen multivalenten Ansatz entwickelt, der auf der Erfassung des abgefragten Proteins basiert, ausgedrückt als FC-markierte extrazelluläre Domänen auf Protein A-beschichteten Mikroperlen. Drehen Sie den Träger IgG, der mit Cy5 Mono-Reaktivfarbstoff beschriftet wurde, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um das Molverhältnis des Abfrageproteins und des Cy5 IgG zu berechnen, dividieren Sie das Molekulargewicht des Abfrageproteins durch das Molekulargewicht des IgG und multiplizieren Sie es mit 40 Mikrogramm pro Milliliter, um die benötigte Cy5-IgG-Konzentration zu bestimmen. Sobald alle Verhältnisse ermittelt wurden, bilden die Mikroperlenprotein-Komplex durch die Kombination der FC-getaggten Abfrage und der Cy5 IgG mit dem Protein A Mikroperlen. Mischen Sie die Aufhängung in PBS auf einem Rohrrotator für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.

Um mit dem Screening zu beginnen, wärmen Sie die vorbereiteten Dias bei Raumtemperatur, bevor Sie auf die Hybridisierungsstation geladen werden. Um das Screening durchzuführen, waschen Sie zuerst das Mikro-Array mit PBST für eine Minute, um Restglycerin zu entfernen. Laden Sie 200 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Protein A in PBS 5%Milch und inkubieren für 30 Minuten, um zu verhindern, dass unkomplexe Protein A Mikroperlen an FC-markierte Proteine binden, die im Mikro-Array vorhanden sein können.

Nach dem Abwälten der Hybridisierungsstation werden die Dias mit PBST abgeladen, 200 Mikroliter des Abfrage-Mikroperlenkomplexes in Gegenwart von einem Milligramm pro Milliliter-Protein A geladen und 30 Minuten inkubiert. Nach Hybridisierung und Waschen der Dias durch die Hybridisierungsstation gleitet mit Wasser und legen Sie sie in einzelne 50 Milliliter Konische Rohre. Trocknen Sie die Rohre, indem Sie bei 900 mal G für fünf Minuten drehen.

Scannen Sie schließlich die Dias mit einem Mikro-Array-Scanner, der für die Erkennung der Cy3- und Cy5-Fluoreszenz mit 532 bzw. 635 Nanometern geeignet ist. Hier ist ein repräsentatives Bild einer gedruckten Folie zu sehen. Die Cy3-beschrifteten Rinderserum-Albumin-Spots sind grün.

Die Spots wurden als Qualitätskontrolle des Druckprozesses in zwei Teilen gedruckt. Repräsentative Ergebnisse eines verwaisten Proteins, das zur Identifizierung von Bindungspartnern mit der extrazellulären Protein-Mikroarray-Technologie gescreent wird, werden hier gezeigt. Die doppelten roten Flecken werden als Treffer für das abgeschirmte Abfrageprotein identifiziert.

Diese beschriebene Methode ist sehr vielseitig und kann für den Druck einer Vielzahl von Proteinbibliotheken verwendet werden, seien es spezifische Proteinfamilien oder große Zusammenstellungen von Proteinen wie unserer. Jedes Protein von Interesse kann ausgewertet werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dias mit Sorgfalt zu behandeln und sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen, um den Verlust der Aktivität der gedruckten Proteine zu verhindern.

Nach dem Screen eines Proteins von Interesse, ist es dringend ratsam, alle Treffer, die durch die Verwendung von orthogonalen Technologien beobachtet werden, wie Oberflächenplasmonresonanz, weiter zu validieren. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher geebnet, um extrazelluläre Protein-Wechselwirkungen beim Menschen zu untersuchen.