DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Microarray-Experiment mit einer automatisierten Mischapparatur durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Qualität der RNA-Proben mit dem Bioanalyzer analysiert wird, gefolgt von der RNA-Amplifikation und -Markierung. Die RNA-Proben werden mit den Microarrays hybridisiert.

Abschließend werden die hybridisierten Microarrays gewaschen und gescannt. Letztendlich werden Ergebnisse erzielt, die die differentielle Expression von RNA-Transkripten durch die Analyse von zweifarbigen Fluoreszenz-Microarray-Bildern zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Microarray-Hybridisierung aufgrund der speziellen Ausrüstung schwer zu erlernen sind.

Die Qualitätskontrollanalyse beginnt mit der Vorbereitung des 2.100 Bioanalysegeräts und der Chip-Priming-Station, wie im schriftlichen Verfahren angegeben. Die Gelmatrix wird dann filtriert, indem 550 Mikroliter in einen Spin-Filter pipettiert werden, der mit einer RNA 6.000-Nanokit-Zentrifuge versehen ist. Der Filter wird bei 1.500 RCF für 10 Minuten bei Raumtemperatur getestet.

Anschließend aliquotiert das gefilterte Gel in 65-Mikroliter-Aliquote, die bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden können. Das Farbstoffkonzentrat 10 Sekunden lang vortexen und einen Mikroliter zu einem 65-Mikroliter-Aliquot hinzufügen. Ein filtriertes Gel nach dem Vortexen der Mischung zentrifugiert bei 13.000 RCF für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Proben laufen zu lassen.

Positionieren Sie zunächst einen Chip auf der Priming-Station. In dieser Demonstration werden RNA 6.000 Nanochips verwendet. Laden Sie neun Mikroliter der Gelfarbmischung in die Vertiefung, die mit einem weißen G auf schwarzem Hintergrund markiert ist.

Die Pipettenspitze befindet sich ganz unten in der Vertiefung. Positionieren Sie den Spritzenkolben auf einen Milliliter und schließen Sie die Ansaugstation. Drücken Sie den Kolben langsam, aber stetig nach unten, bis er vom Clip gehalten wird.

Lassen Sie nach 30 Sekunden den Clip los und lassen Sie den Kolben einige Sekunden anheben. Nachdem der Kolben gestoppt ist, ziehen Sie den Kolben zurück in die Ein-Milliliter-Position und öffnen Sie die Ansaugstation. Laden Sie neun Mikroliter der Gelmatrize.

In jeder der beiden Vertiefungen mischen. Mark G.Dann geben Sie fünf Mikroliter des Markers in die Leitervertiefung und in jede der 12 Probenvertiefungen. Als nächstes wird ein Mikroliter der vergällten Leiter in die Leitervertiefung und ein Mikroliter jeder vergällten Probe in die Probenvertiefungen geladen.

Geben Sie schließlich einen Mikroliter des Markers in jede unbenutzte Probe. Nun, nach dem Laden wirbeln Sie den Chip eine Minute lang bei 2.400 U/min. Positionieren Sie nach dem Start der Software 2.100 expert den Chip und schließen Sie den Deckel.

Stellen Sie sicher, dass der richtige Anschluss ausgewählt ist, und führen Sie den Assay innerhalb von fünf Minuten nach dem Laden der Proben durch, um eine Verdunstung zu verhindern. Methoden zur Durchführung der RNA-Amplifikation und -Markierung finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nach der Markierung reinigen Sie das CRNA, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen. Mit Hilfe von Cogens r und einfachen Mini-Säulen kann das markierte CRNA dann mit einem NanoDrop 2000 Spektrenphotometer quantifiziert werden.

Im Microarray-Messmodus können Sie die Probenkonzentration, die Ausbeute und die spezifische Aktivität aufzeichnen. Für die Microarray-Hybridisierung ist es notwendig, eine Ausbeute von mindestens 825 Nanogramm und eine spezifische Aktivität von mindestens acht Picomole pro Mikrogramm mindestens zwei Stunden vor der Microarray-Hybridisierung zu erreichen. Schalten Sie die Hybridisierungsstation ein und stellen Sie sie auf 65 Grad Celsius ein.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Agilent vier x 40 4K-Arrays mit dem Roche Nimble Gen-Hybridisierungssystem und vier Mischkammern nach der CRNA-Fragmentierung, die wie im schriftlichen Protokoll beschrieben durchgeführt wird, um die Hybridisierungskammer vorzubereiten. Platzieren Sie eine Microarray-Folie auf der Barcode-Seite des Demontagewerkzeugs. Öffnen Sie zuerst einen A-Viermischer und legen Sie den Klebstoff frei, der das Array und das Montagedemontagewerkzeug hält, um eine Bewegung zu verhindern.

Platzieren Sie den A-Vier-Mixer auf der Folie, beginnend am hinteren Ende. Stellen Sie sicher, dass es richtig am Werkzeug ausgerichtet ist, und kleben Sie den Mischer entlang der Anordnung. Schieben Sie am Ende des Mischers, um die Schiebemischerbaugruppe zu entfernen.

Drücken Sie mit dem Schreiwerkzeug entlang der Klebedichtung, um sicherzustellen, dass sie fest mit dem Schlitten verklebt ist. Kleine Luftblasen, die zwischen dem Kleber und der Folie eingeschlossen sind, sind vor dem dunklen Hintergrund zu sehen. Nehmen Sie sich extra Zeit, um diese Blasen mit dem Schreiwerkzeug zu entfernen.

Das Array kann nun geladen werden. Verwenden Sie ein Verdrängerperpet, um 100 Mikroliter der Hybridisierungsprobe zu laden. Schieben Sie die Spitze fest in das Bullauge und geben Sie sie langsam und gleichmäßig ab, damit die Luft nicht im Array-Bereich eingeschlossen wird.

Wenn die Probe das gesamte Array bedeckt und die Flüssigkeit auszutreten beginnt, entfernen Sie schnell die Pipette und lassen Sie nur den Kolben los. Sobald die Spitze vom Objektträger entfernt ist, tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit vorsichtig an beiden Anschlüssen ab und achten Sie darauf, dass keine Probe aus der Kammer selbst gezogen wird. Decken Sie dann die Bullaugen mit einer Pinzette mit Aufklebern ab.

Legen Sie den Objektträger auf die Hybridisierungsstation und prüfen Sie, ob die Blasenlöcher korrekt über den O-Ringen positioniert sind. Dies gewährleistet eine ordnungsgemäße Durchmischung während der Hybridisierung. Schließen Sie die Schiebeabdeckung und den Stationsdeckel.

Stellen Sie die Station auf Mischmodus B und hybridisieren Sie das Array 17 Stunden lang bei 65 Grad Celsius. Sobald die Füllglasschale mit der Bezeichnung A und dem Waschpuffer eins fertig ist, sollte die Schale groß genug sein, um das Demontagewerkzeug aufzunehmen und auch etwas Manövrieren zu ermöglichen. Alle Waschgänge sollten in Glaswaren durchgeführt werden, da Kunststoff dazu neigt, Verbindungen auszulaugen, was zu einem hohen Hintergrundhintergrund in der Anordnung führt.

Legen Sie einen Schieberost und einen Rührstab in eine Färbeschale. Füllen Sie die Schüssel mit dem Waschpuffer eins, der den Rost abdeckt, und stellen Sie die Schüssel auf eine Rührplatte bei Raumtemperatur. Geben Sie außerdem einen Rührstab in eine leere Färbeschale mit der Aufschrift C und legen Sie ihn auf eine Rührplatte.

Entfernen Sie das Array aus der Hybridisierungsstation und legen Sie es in das Montage-Demontagewerkzeug. Tauchen Sie die gesamte Baugruppe in die Schale a, während Sie das Demontagewerkzeug und die Schiene von gegenüberliegenden Seiten mit einer Hand halten. Ziehen Sie den A-Vier-Mixer vorsichtig ab und achten Sie darauf, den Array-Bereich nicht zu zerkratzen.

Legen Sie den Objektträger schnell auf den Rost und die Färbeschale B. Die Exposition gegenüber der Luft sollte minimiert werden, da der SCI-Fünf-Farbstoff ozonempfindlich ist. Waschen Sie das Radiergummi eine Minute lang unter Rühren bei mittlerer Geschwindigkeit. Füllen Sie die Färbeschale C mit dem vorwarmen Waschpuffer zwei.

Übertragen Sie die Objektträger und waschen Sie sie eine Minute lang. Entfernen Sie nach dem sehr langsamen Waschen den Objektträgerrost von der Färbung von Schale C, um Tröpfchen auf dem Objektträger zu minimieren. Trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn zwei Minuten lang drehen.

Legen Sie dann den Objektträger in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie ihn mit Argongas, scannen Sie sofort mit dem Gen-Picks 4.000 B-Scanner von molekularen Geräten, um den gezeigten Signalverlust zu vermeiden. Hier sind Beispiele für vier RNA-Proben, die aus dem menschlichen Gehirn isoliert wurden. Die Qualität der Tumorgewebeproben wurde mit dem 2.100 Bioanalyzer auf einem RNA 6.000 Chip bewertet.

Durchgehende und offene Pfeilspitzen zeigen die Position der Spezies 18 s bzw. 28 S-R-R-N-A. an. Die RNA-Integritätszahl oder RIN ist ein quantitatives Maß für die RNA-Qualität von guter Qualität insgesamt. RNA-Proben sollten nur zwei große Peaks erzeugen, wenn sie zur Qualitätskontrolle in einem Bioanalysator durchgeführt werden, der den beiden wichtigsten ribosomalen RNA-Spezies entspricht.

Ein gewisser RNA-Abbau zeigt sich als Abstrich vor dem ersten ribosomalen RNA-Peak und ein signifikant niedrigerer Peak für stark abgebaute 28 S-R-R-N-A. RNA von geringer Qualität zeigt einen breiten Peak oder eine Reihe von Peaks bei niedrigen Retentionszeiten. Während die beiden ribosomalen RNA-Peaks eine sehr geringe Intensität aufweisen oder gar nicht identifizierbar sind.

Arrays von guter Qualität sollten ein hohes Signal bei relativ niedrigen PMT-Werten erzeugen. Es wird erwartet, dass die meisten Transkripte in der Versuchs- und Referenzstichprobe in ähnlichem Umfang vorhanden sind. Massive, weit verbreitete Veränderungen der Genexpression werden wahrscheinlich keine biologische Bedeutung haben.

Daher sollte der größte Teil des Arrays gelb und nicht grün oder rot aussehen. Signale von guter Qualität sollten sich auch in einem Dynamikbereich befinden, so dass sich die Signalhistogramme vollständig überlappen, wie im Streudiagramm des Array-Bildes zu sehen ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Microarray-Experiment mit einer automatisierten Hybridisierungsvorrichtung durchführen.