Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieser Videoartikel beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Glykosylierungsprofilen von 20 verschiedenen Glykoproteinen in einer Serumprobe von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom unter Verwendung eines chemisch blockierten Antikörper-Mikroarrays. Zunächst werden spezifische Antikörper direkt auf Mikroarray-Objektträger aufgedruckt, und die Glykane der Antikörper werden blockiert, um eine Bindung von Lektinen zu verhindern. Wenn Patientenserumproben aufgebracht werden, werden die Glykoproteine aus der Probe durch die Antikörper gebunden. Anschließend werden biotinylierte Glykan-bindende Proteine hinzugefügt, um die Glykane nachzuweisen, und ein doppelt konjugiertes Neutravidin wird zugegeben, um die biotinylierten Lektine zu markieren.

Die Microarray-Platte wird anschließend gescannt, um die Fluoreszenz zu detektieren, und die Analyse der resultierenden Daten offenbart die Glykosylierungsprofile der Probeproteine. Diese Technik weist mehrere Vorteile gegenüber etablierten Methoden wie der HPLC auf. Die Methode ermöglicht die Detektion einzelner Glykoproteine in ihrem nativen Zustand.

Es ist schneller und einfacher, Glykosylierungsveränderungen bei mehreren Proteinen gleichzeitig zu untersuchen. Wir haben festgestellt, dass Biomarker von Krankheiten, insbesondere von Krebs und Leberkrebs, die wir am genauesten untersucht haben, häufig glykosyliert sind. Die Fähigkeit, spezifische Glykoformen nachzuweisen, verbessert nach unseren Erkenntnissen die Leistung von Biomarkern hinsichtlich Sensitivität und Spezifität erheblich.

Daher kann diese Messmethode Einblicke in Glykosylierungsveränderungen an mehreren Serumproteinen beim HCC gewähren. Sie kann außerdem auf die pathologische Untersuchung und die Biomarker-Entdeckung bei anderen Krebserkrankungen und Krankheiten wie Pankreaskrebs, Diabetes und Alzheimer-Krankheit angewendet werden. Die Durchführung des Verfahrens wird Chen Lu, eine Technikerin aus meinem Labor, demonstrieren.

Beginnen Sie dieses Protokoll damit, dass Sie zunächst das Antikörper-Mikroarray in 0,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vorbereiten. Verdünnen Sie alle für den Mikroarray-Druck verwendeten Antikörper auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in mindestens 40 Milliliter PBS. Hier werden 26 verschiedene Antikörper als positiver Kontrolle verwendet. Bereiten Sie außerdem die gleiche Menge biotinyliertes BSA mit einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in PBS vor. Verwenden Sie einen Pipettierer, um jeweils 40 Milliliter jeder Antikörperlösung in die 384-Well-Quellplatte auf Eis abzufüllen.

Dann im Microarray-Steuerungssoftware jede Antikörperposition festlegen. Anschließend die Platte als Quelle auf das Microarray laden. Danach 20 Path-Microarray-Objektträger als Ziel auf das Microarray laden.

Stellen Sie das Microarray so ein, dass 48 identische Subarrays gedruckt werden, wobei 27 Antikörper und Kontrollproteine in einer neun mal neun großen Anordnung jeweils im Dreifachansatz aufgebracht werden. Starten Sie das Microarray, um die Antikörper-Microarray-Objektträger zu drucken. Sammeln Sie die Antikörper-Microarray-Objektträger ein und lagern Sie sie in einer Objektträgerkassette mit Trockenmittel.

Versiegeln Sie die Kassette in einer Plastiktüte, um eine Denaturierung der Proteine und Feuchtigkeitsbildung auf den Objektträgern während der Lagerung zu verhindern. Lagern Sie die versiegelten Microarray-Objektträger bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet werden. Der schwierigste und wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist der chemische Blockierungsschritt.

Um den Erfolg sicherzustellen, ist es entscheidend, dass eine ausreichende Menge an Antikörpern auf dem Mikroarray aufgebracht wird. Bereiten Sie stets frisches Natrium-IDE und Agrosäure-Hydrozyt unmittelbar vor dem Experiment vor. Achten Sie darauf, das Oxidationsverfahren bei vier Grad im Dunkeln durchzuführen.

Nehmen Sie die Microarray-Objektträger aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Raumtemperatur akklimatisieren. Entnehmen Sie einen Objektträger aus der Aufbewahrungsbox. Tauchen Sie den Objektträger kurz in ein Waschbecken mit PBS, das 0,1 % Tween 20 enthält.

Anschließend tauchen Sie den Objektträger 10 Minuten lang in 15 Millimolar Natriumacetatpuffer mit 0,1 % Tween. Danach bereiten Sie frisch 150 Millimolar Natriumperjodat in 15 Millimolar Natriumacetatpuffer vor und geben es in ein Objektträgerwaschbecken. Bewahren Sie es im Kühlschrank, lichtgeschützt, bis zur Verwendung auf. Entnehmen Sie den Objektträger dem Natriumacetatpuffer und legen Sie ihn in das Becken mit frischem Natriumperjodat, wobei die Seite mit dem Antikörper nach oben zeigt.

Bedecken Sie die Wanne mit Aluminiumfolie, um Licht zu vermeiden. Anschließend stellen Sie die Objektträgerwanne bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln für zwei Stunden. Entfernen Sie den Objektträger aus der Wanne und spülen Sie ihn kurz dreimal für jeweils fünf Minuten in Natriumacetatpuffer aus.

Die Probe zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in 300 Milliliter frisch zubereiteter 10-Millimolar-Hydroglutaminsäure-Blockierungslösung in einer Inkubationskammer inkubieren. Die Objektträger aus der Kammer entfernen und dreimal drei Minuten lang mit PBS mit 0,1 % Tween waschen. Danach die Microarray-Objektträger in einem Objektträgerwaschbecken eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in 300 Milliliter 1 % BSA in PBS mit 0,5 % Tween inkubieren.

Spülen Sie die Objektträger dreimal für jeweils drei Minuten in PBS mit 0,1 % Tween. Legen Sie den Objektträger auf einen Objektträgerhalter und zentrifugieren Sie ihn bei 1.200 × g für zwei Minuten, um den Microarray-Objektträger anschließend zu trocknen. Um jede Subarray voneinander zu trennen, wird ein Wabengitter aus Wachs auf den Objektträger aufgebracht.

Nachdem der Wachs-Imprinter fünf Minuten lang auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde, wird der blockierte Microarray-Objektträger mit der Antikörperseite zum Wachs hin in den Wachs-Imprinter eingelegt. Ziehen Sie vorsichtig am Griff, um das Wachs gleichmäßig auf den Objektträger aufzutragen. Diese Methode kann verwendet werden, um entweder Glyko-Profilierungs-Assays für eine einzelne Probe oder die Messung eines einzelnen Glyko-Epitops in mehreren Proben durchzuführen.

Hier demonstrieren wir Glyko-Profilierungsanalysen. Verdünnen Sie zunächst 40 Mikroliter Serum in 360 Mikrolitern PBS, das 0,1 % Tween, 0,1 % Bridge 35 sowie jeweils 100 Mikrogramm pro Milliliter Maus-, Ratte-, Kaninchen-, Ziegen- und Esels-IgG enthält. Dieses Volumen reicht aus, um sechs Mikroliter der verdünnten Serumlösung auf jedes Subarray aufzutragen.

Tragen Sie sorgfältig sechs Mikroliter der verdünnten Probe oder der Kontrolle auf jedes Subarray des Objektträgers auf. Inkubieren Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kassette mit feuchten Papiertüchern. Spülen Sie den Objektträger dreimal für jeweils drei Minuten mit PBS mit 0,1 % Tween.

Anschließend trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn bei 1200 × g für zwei Minuten zentrifugieren. Bereiten Sie 20 Mikroliter der biotinylierten glykanbindenden Proteine mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in PBS-Tween in einem 0,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vor. Geben Sie sechs Mikroliter der verdünnten biotinylierten Lektine auf jedes Subarray des Objektträgers und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der befeuchteten Objektträgerkassette mit feuchten Papiertüchern.

Nachdem die Objektträger dreimal wie zuvor mit PBS mit 0,1 % Tween gespült wurden, trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn zwei Minuten lang bei 1200 × g in einer Zentrifuge drehen. Bereiten Sie 400 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter DITE 5 49 markierten Neutravidin-Lösung in PBS mit 0,1 % Tween in einem 0,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vor. Geben Sie mithilfe einer Mehrfachpipette jeweils sechs Mikroliter der mit DITE 5 49 markierten Neutravidin-Lösung auf jedes Subarray und inkubieren Sie den Objektträger danach eine Stunde lang bei Raumtemperatur in der befeuchteten Objektträgerkassette.

Spülen Sie den Objektträger dreimal für jeweils drei Minuten mit PBS 0,1 % Tween. Trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn zwei Minuten lang bei 1200 ×g in einer Zentrifuge drehen. Scannen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenz-Microarray-Scanner bei einer Auflösung von 10 Millimeter.

Die Einstellungen für Laser und PMT sollten so stark wie möglich sein, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Sättigung auftritt. Öffnen Sie das Bild in Array Pro 3.2. Richten Sie die Array-Vorlage gemäß der Array-Karte ein, die die Positionen der Antikörperpunkte zeigt.

Richten Sie jeden Vorlagenkreis sorgfältig auf die entsprechende Stelle im Bild aus und übertragen Sie die Intensität jeder Stelle in eine Excel-Datei zur weiteren Analyse. Ein Antikörper-Mikroarray, der 48 identische Teilarrays mit 26 Antikörpern gegen 20 serumhaltige Glykoproteine sowie Biotin enthält, wurde wie in diesem Video beschrieben entworfen und hergestellt, um die Bedeutung des Blockierungsschritts zu untersuchen.

Bei der Analyse des Glykoprotein-Profiling wurden zwei identische Microarray-Objektträger hergestellt. Einer wurde nicht chemisch blockiert, während der andere als Kontrollprobe diente. Die Kontrollprobe wurde auf die Subarrays in den Spalten eins und drei aufgebracht, und eine gepoolte HCC-Serumprobe wurde auf die Subarrays in den Spalten zwei und vier aufgebracht.

Biotinylierte, für verschiedene Glykane spezifische Lektine wurden anschließend auf jedes Subarray aufgetragen, wie in diesen Bildern der Subarrays dargestellt. Lektine bindeten an die Fangantikörper in den Kontrollspalten und verursachten ein hohes Hintergrundsignal, das sich nicht von den Signalen der mit Serum beladenen Spalten in den nicht blockierten Mikroarrays unterscheiden ließ. Hingegen zeigte dasselbe Experiment auf einem chemisch blockierten Antikörper-Mikroarray-Objektträger keine oder nur eine sehr geringe Bindung an die Fangantikörper in den Kontrollspalten sowie eine starke Antigenbindung in den mit Serum beladenen Spalten.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die chemische Blockierung ein entscheidender Schritt für die Messung von Glykanen an Antikörper-gefangenen Glykoproteinen ist. Indem man dem Protokoll folgt, können die Glykosylierungsprofile von 22 Glykoproteinen im HCC-Serum erhalten werden, sobald es beherrscht ist. Diese Technik kann in acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Antikörper können nach einer Modifikation ihre Affinität zu ihren Antigenen und andere Eigenschaften verlieren.

Daher ist es wichtig, dies im Hinterkopf zu behalten und mehrere verschiedene Antikörper aus unterschiedlichen Quellen zu verwenden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Weitere Maßnahmen, wie beispielsweise die Detektion der jeweiligen Protein-Konzentration mithilfe desselben Mikroarray-Slides, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa ob die Veränderung der Glykosylierung auf einer Änderung der Proteinexpressionsniveaus beruht oder ausschließlich auf einer veränderten Glykosylierung einzelner Proteine. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Serumproben, die Pathogene enthalten, äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzhandschuhen, während Sie dieses Verfahren durchführen.