Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieser Videoartikel beschreibt ein Verfahren zur Erstellung von Glykosylierungsprofilen von 20 verschiedenen Glykoproteinen in einer Serumprobe eines hepatozellulären Karzinompatienten unter Verwendung eines chemisch blockierten Antikörper-Microarrays: Zuerst werden Glykoproteine spezifische Antikörper direkt auf Microarray-Objektträger gedruckt und Antikörperglykane werden blockiert, um die Lektinbindung zu verhindern. Wenn Serumproben von Patienten entnommen werden, werden Glykoproteine aus der Probe von den Antikörpern eingefangen. Biotinylierte Glykan-bindende Proteine werden dann hinzugefügt, um die Glykane zu detektieren, und di-konjugiertes Neutravain wird hinzugefügt, um die biotinylierten Lektine zu markieren.

Der Microarray-Objektträger wird dann gescannt, um die Fluoreszenzanalyse der resultierenden Daten zu erkennen, zeigt die Glykosylierungsprofile der Probenproteine. Diese Technik hat mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden wie der HPLC. Diese Methode ermöglicht den Nachweis einzelner Glykoproteine in ihrem nativen Zustand.

Es ist schneller und einfacher, die Glykosylierungsveränderung für mehrere Proteine gleichzeitig zu screenen. Okay, wir haben herausgefunden, dass Biomarker für Krankheiten, insbesondere für Krebs und Leberkrebs, die wir uns am genauesten angesehen haben, oft glykosyliert sind. Und die Fähigkeit, spezifische Glykoformen nachzuweisen, verbessert die Leistung von Biomarkern in Bezug auf ihre Sensitivität und Spezifität erheblich.

Diese Messung kann also Einblicke in Glykosylierungsveränderungen an mehreren Serumproteinen in HCC geben. Es kann auch auf die Pathologie und die Entdeckung von Biomarkern bei anderen Krebsarten und Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs, Diabetes und Alzheimer angewendet werden. Das Verfahren wird von Chen Lu, einem Techniker aus meinem Labor, vorgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie den Antikörper-Microarray zuerst in 0,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vorbereiten, verdünnen Sie alle Antikörper, die für den Microarray-Druck verwendet werden, auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in mindestens 40 Millilitern PBS, hier werden 26 verschiedene Antikörper als Positivkontrolle verwendet. Bereiten Sie auch die gleiche Menge von 0,5 Milligramm pro Milliliter biotinyliertes BSA in PBS vor. Verwenden Sie eine Pipette, um 40 Milliliter jedes Antikörpers in die 384-Well-Quellplatte auf Eis zu aliquotieren.

Bestimmen Sie dann in der Microarray-Steuerungssoftware jede Antikörperposition. Laden Sie als nächstes die Platte auf den Microarray als Quelle. Laden Sie dann 20-Pfad-Microarray-Objektträger als Ziel auf den Microarray.

Stellen Sie den Microarray so ein, dass 48 identische Subar-Arrays gedruckt werden, in denen 27 Antikörper und Kontrollproteine in dreifacher Ausfertigung in einem neun x neun Muster aufgespottet sind. Starten Sie den Microarray, um die Antikörper-Microarray-Objektträger zu drucken. Sammeln Sie die Antikörper-Microarray-Objektträger und bewahren Sie sie in einer Objektträgerkassette mit Trockenmittel auf.

Verschließen Sie die Kassette in einer Plastiktüte, um eine Denaturierung des Proteins und Feuchtigkeit auf den Objektträgern während der Lagerung zu verhindern. Lagern Sie die versiegelten Microarray-Objektträger bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Der schwierigste und wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist der Schritt der chemischen Blockierung.

Um den Erfolg zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass eine ausreichende Menge an Antikörpern auf das Microarray-Licht gedruckt wird. Bereiten Sie unmittelbar vor dem Experiment immer frisches Natrium IDE und Agrosäurehydrozyten vor. Und stellen Sie sicher, dass Sie den Oxidationsvorgang bei vier Grad durchführen und dabei Licht vermeiden.

Nehmen Sie die Microarray-Objektträger aus dem Kühlschrank und äquilibrieren Sie sie 30 Minuten lang auf Raumtemperatur. Nehmen Sie eine Folie aus der Aufbewahrungsbox. Tauchen Sie die Rutsche kurz in ein Waschbecken mit PBS mit 0,1 % Tween 20.

Tauchen Sie den Objektträger dann 10 Minuten lang in 15 millimolaren Natriumacetatpuffer mit 0,1 %Tween. Bereiten Sie anschließend frische 150 Millimolar Natrium pro Jodat in 15 Millimolar Natriumacetatpuffer vor und geben Sie es in ein Dia-Waschbecken Bewahren Sie es im Kühlschrank auf und vermeiden Sie Licht bis zum Gebrauch. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Natriumacetatpuffer und legen Sie ihn mit der Antikörperseite nach oben in das Becken mit frischem Natriumpuriat.

Decken Sie das Becken mit Alufolie ab, um Licht zu vermeiden. Stellen Sie dann das Rutschenbecken bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln für zwei Stunden auf. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Becken und spülen Sie ihn dreimal fünf Minuten lang kurz mit Natriumacetatpuffer aus.

Inkubieren Sie den Objektträger in 300 Millilitern frisch zubereiteter 10-Millimola-Hydroglutaminsäure-Blockierungslösung in einer Inkubationskammer für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Nehmen Sie die Objektträger aus der Kammer und waschen Sie sie drei Minuten lang mit PBS mit 0,1 % Tween. Als nächstes inkubieren Sie den Microarray-Objektträger in einem Objektträger-Waschbecken in 300 Millilitern 1 % BSA in PBS mit 0,5 % Tween für eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.

Spülen Sie die Objektträger in PBS mit 0,1 % Tween dreimal drei Minuten lang. Legen Sie den Objektträger auf ein Objektträgergestell und drehen Sie ihn zwei Minuten lang bei 1.200 Mal G, um den Microarray-Objektträger als nächstes zu trocknen. Um die einzelnen Subar-Arrays zu trennen, wird ein Wachsgitter auf den Objektträger gedruckt.

Nachdem Sie den Wachsimprinter fünf Minuten lang auf 70 Grad Celsius vorgeheizt haben, laden Sie den blockierten Microarray-Objektträger mit der Antikörperseite in Richtung Wachs in den Wachsimprinter. Ziehen Sie vorsichtig am Griff, um das Wachs gleichmäßig auf den Objektträger zu drucken. Diese Methode kann verwendet werden, um entweder Glyko-Profiling-Assays für eine einzelne Probe oder für die Messung eines einzelnen Glyko-Epitops in mehreren Proben durchzuführen.

Hier werden wir Glyko-Profiling-Assays demonstrieren. Beginnen Sie damit, 40 Mikroliter Serum in 360 Mikroliter PBS zu verdünnen, die 0,1 % zwischen 0,1 % Bridge 35 und 100 Mikrogramm pro Milliliter enthalten, jeweils Maus-, Ratten-, Kaninchen-, Ziegen- und Esel-IgG. Dieses Volumen reicht aus, um sechs Mikroliter verdünnte Serumlösung auf jedes Subarray aufzutragen.

Tragen Sie vorsichtig sechs Mikroliter der verdünnten Probe oder Kontrolle auf jedes Subarray des Objektträgers auf. Inkubieren Sie den Objektträger in einer befeuchteten Kassette mit feuchten Papiertüchern eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie den Objektträger dreimal drei Minuten lang mit PBS mit 0,1 % Tween.

Trocknen Sie dann den Objektträger, indem Sie ihn zwei Minuten lang mit dem 1200-fachen G drehen. Bereiten Sie 20 Mikroliter der biotinylierten Glykanbindungsproteine mit 10 Milligramm pro Milliliter in PBS-Tween in einem 0,8 Milliliter Mikrofuge-Röhrchen auf Eis vor. Sechs Mikroliter der verdünnten biotinylierten Lektine auf jedes Subarray des Objektträgers geben und in der befeuchteten Objektträgerbox mit feuchten Papiertüchern eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Nachdem Sie die Objektträger wie zuvor dreimal mit PBS mit 0,1 % Tween gespült haben, trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn zwei Minuten lang bei 1200 x G in einer Zentrifuge drehen. Bereiten Sie 400 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter DITE 5 49 markiertes Neut Travain in PBS 0,1% Tween in einem 0,8 Milliliter Mikrofuge-Röhrchen auf Eis vor. Mit einer Wiederholungspipette sechs Mikroliter DITE 5 49 markiertes Neut-Travain auf jedes Subarray auftragen und den Objektträger in der befeuchteten Objektträgerkassette nach der Inkubation eine Stunde lang inkubieren.

Spülen Sie den Objektträger dreimal drei Minuten lang mit PBS 0,1 % Tween aus. Trocknen Sie den Objektträger, indem Sie ihn zwei Minuten lang bei 1200 G in einer Zentrifuge drehen. Scannen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenz-Microarray-Scanner mit einer Auflösung von 10 Millimetern.

Die Laser- und PMT-Einstellungen sollten so stark wie möglich sein und gleichzeitig sicherstellen, dass keine Sättigung beobachtet wird. Öffnen Sie das Image in Array Pro 3.2. Richten Sie die Array-Vorlage entsprechend der Array-Map ein, die die Positionen der Antikörper-Spots anzeigt.

Richten Sie jeden Vorlagenkreis sorgfältig an der entsprechenden Stelle im Bild aus und extrahieren Sie die Intensität jedes Punktes zur weiteren Analyse in eine Excel-Datei. Ein Antikörper-Mikroarray, das 48 identische Subar-Arrays mit 26 Antikörpern gegen 20 Serumglykoproteine und Biotin enthält. BSA wurde wie in diesem Video beschrieben entworfen und hergestellt, um die Bedeutung des Blockierungsverfahrens zu untersuchen.

Bei der Analyse von Glykoprotein-Profilen wurden zwei identische Microarray-Objektträger erzeugt. Eine war nicht chemisch blockiert, während die andere Kontrollprobe auf die Subar-Arrays in den Spalten eins und drei aufgebracht wurde, und eine gepoolte HCC-Serumprobe wurde auf die Subar-Arrays aufgebracht. In den Spalten zwei und 4 22.

Biotinylierte Lektine, die für verschiedene Glykane spezifisch sind, wurden dann auf jedes Subarray aufgebracht, wie in diesen Bildern der Subar-Arrays gezeigt. Lektine, die an die Bindung von Antikörpern in den Kontrollsäulen gebunden waren, ergaben einen hohen Hintergrund, der nicht von den mit Serum beladenen Säulen in den nicht blockierten Microarrays zu unterscheiden war. Als das gleiche Experiment jedoch an einem chemisch blockierten Antikörper-Microarray-Objektträger durchgeführt wurde, gab es keine oder nur eine sehr geringe Bindung zum Einfangen von Antikörpern in den Kontrollsäulen und eine hohe Antigenbindung in den mit Serum beladenen Säulen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das chemische Blockierungsverfahren ein kritischer Schritt für die Messung von Glykanen auf Antikörper-eingefangenen Glykoproteinen ist. Nach Befolgung des Protokolls können Glykosylierungsprofile von 22 Glykoproteinen im HCC-Serum erhalten werden, sobald sie gemeistert sind. Diese Technik kann in acht Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Antikörper können, wenn sie modifiziert sind, ihre Affinität zu ihren Antigenen und anderen Eigenschaften verlieren.

Es ist also wichtig, dies im Hinterkopf zu behalten und mehrere verschiedene Antikörper in verschiedenen Antikörperquellen zu verwenden, indem Sie diesem Verfahren folgen. Andere Messungen wie der Nachweis jeder Proteinkonzentration mit demselben Mikrostrahlenträger können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Veränderung der Glykosylierung auf die Änderung der Proteinexpressionsniveaus oder ausschließlich auf die Veränderung der Glykosylierung auf jedem einzelnen Protein zurückzuführen ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit erregerhaltigen Serumproben äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzhandschuhe getroffen werden sollten.