Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Diese transkriptomische Analyse von menschlichem Prostatakrebsgewebe identifiziert einzelne humane endogene Retrovirus-Expressionsloci, um einen kundenspezifischen Microarray mit hoher Dichte als Screening-Tool für die Entdeckung von Biomarkern zu bewerten. Nachdem der Chirurg das Prostataorgan des Patienten entfernt hat, bereitet der Pathologe das Tumorgewebe und das angrenzende Normalgewebe separat im Labor auf, extrahiert, reinigt und qualifiziert das MR. NA aus dem normalen und tumoralen Gewebe amplifizieren mRNAs mit dem gesamten Transkriptom-Ovationskit und spalten und markieren dann die resultierenden amplifizierten Produkte. Verarbeiten Sie dann nacheinander die H-E-R-V-V-zwei Microarrays durch Befüllen, Hybridisieren, Waschen und Scannen.

Letztendlich können mit Hilfe von Biocomputing-Methoden Sondensätze verfolgt werden, die eine signifikante Signal- und Differentialexpression aufweisen, was zur Identifizierung transkriptionell aktiver individueller Loci führt. Vor vielen Jahren haben wir das Verhalten der IRV W-Familie in verschiedenen Kontexten untersucht, unter anderem anhand von Multipler Sklerose-Proben. Plazenta hoden.

Ich hatte die Idee zu seiner Methode, als wir zu verstehen begannen, dass überlappende oder nicht überlappende Untergruppen von IRV-Elementen innerhalb einer Familie ausgedrückt werden. Je nach Kontext. Der Einsatz von Schiffstechnologie ermöglicht die koordinierte Erkundung mehrerer ihrer Familien und die gleichzeitige Analyse verschiedener Regionen für jeden Ort.

Zum Beispiel US drei und UF-Domäne für LTR, die eine direkte Rolle in der Pathologie unterstützen können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Krebsbereich zu beantworten, z. B. bei der Diagnose von Prostatakrebs, bei dem es den vorhandenen Protein-Biomarkern wie PSA an Spezifität und Sensitivität mangelt. In der Zwischenzeit scheinen nicht-kodierende RNA wie PCA drei vielversprechender zu sein. Die Demonstration des Prostata-Behandlungsverfahrens wird Michel, einem Techniker aus der Pathologieabteilung, verkaufen.

Philippe Per wird die Vorbereitung und Analyse des RNA-Extraktionsziels demonstrieren, während ein Techniker des John Unit Labors das Schiffsverfahren demonstrieren wird. Montieren Sie den gefrorenen Gewebeverlauf vertikal auf einen kleinen OCT-Hügel am Kryostaten. Nehmen Sie einen einzelnen Fünf-Mikrometer-Schnitt, färben Sie ihn mit Blu Udine und führen Sie dann eine schnelle histologische Untersuchung durch, um die Beschaffenheit des Gewebes auf Tumorgewebe zu untersuchen.

Schätzen Sie die Anzahl der turalen Zellen und wählen Sie nur Kerne mit mehr als 80% Tumorzellen aus. Schneiden Sie einen weiteren Fünf-Mikron-Abschnitt ab und färben Sie ihn mit Hämatin, Eoin und Safran. Schneiden Sie nun 15 Abschnitte mit einer Dicke von 30 Mikrometern ab und übertragen Sie sie in ein RNAs-freies Orph-Röhrchen.

Nehmen Sie dann einen letzten Fünf-Mikrometer-Schnitt für die Färbung mit Hämatin, Eoin und Safran, um die Menge der Tumorzellen zu kontrollieren. Am Ende des Vorgangs überträgt trans die Proben auf Trockeneis in das molekularbiologische Labor. Homogenisieren Sie das Gewebe in Triollösung auf Eis mit einer Handschleifmaschine, bis sich das Gewebe vollständig aufgelöst hat.

Inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann 300 Mikroliter Chloroform hinzufügen und 15 Sekunden lang vortexen. Nach zwei Minuten bei Raumtemperatur bei 12.000 g 15 Minuten bei zwei bis acht Grad Celsius zentrifugieren.

Für die RNA überführen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. 750 Mikroliter Isopropanol zugeben, durch Inversion mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben, um die gefällte RNA zu pelletieren, und waschen Sie das RNA-Pellet mit einem Milliliter 80%igem Ethanol.

Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand mit den Spitzen P 1000 und P 10. Lassen Sie das restliche Ethanol an der Luft trocknen.

Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter RNAs freies Wasser hinzu. Übertragen Sie die Proben in einen 70 Grad Celsius heißen Block. Um das Pellet aufzulösen, überprüfen Sie die Qualität der RNA und die RNA-Integrität mit einem Bioanalysator und einem NanoDrop gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Bei einer idealen RNA-Extraktion beträgt die RNA-Integritätszahl in der Regel sieben oder mehr. Fahren Sie mit dem gesamten Transkriptom-Ovations- und RNA-Amplifikationskit gemäß den Anweisungen des Lieferanten fort. Reinigen Sie dann das resultierende einzelsträngige CD-NA-Produkt.

Überprüfen Sie die Ausbeute und Größenverteilung des einzelsträngigen CDNA mit einem Bioanalysator und einem NanoDrop gemäß den Herstellerangaben. Die Größenverteilung von amplifizierter CD NA sollte typischerweise zwischen 101 und 500 Basen lang sein, mit einem Peak von etwa 600 Basen und eine glockenförmige Gesamtverteilung aufweisen. Neben der Fragmentierung der CDNA werden 6,6 Mikroliter Fragmentierungsmischung zu zwei Mikrogramm CD NA in 30 Mikrolitern gegeben, geschleudert und 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Dann die DNA bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten inaktivieren und auf Eis halten. Aliquotieren Sie einen Mikroliter des fragmentierten CDNA für die Agilent-basierte Verifizierung der Größenverteilung. Die einzige DNA-Behandlung homogenisiert die CD-NA-Größenverteilung auf etwa 100 Nukleotide, bevor sie hybridisiert wird.

Überprüfen Sie die Größenverteilung der einzelsträngigen CD-NA mit einem Bioanalysator von Pfizer pre-wet. Der HERV-Genchip mit 200 Mikrolitern Vorhybridisierung. Mischen und bei 50 Grad Celsius, 60 U/min 10 Minuten inkubieren.

Fügen Sie 131 Mikroliter Hybridisierungsmischung zu den 69 Mikrolitern fragmentiertem und markiertem CD NA bei Raumtemperatur und in der Natur für zwei Minuten bei 95 Grad Celsius hinzu. Dann fünf Minuten lang bei 50 Grad Celsius inkubieren und fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Entleeren Sie nun den vorbenetzten HERV-Genchip und laden Sie das 200 Mikroliter Targetpräparat.

Harte Stellen auf die beiden SEPTA auftragen, hybridisieren bei 50 Grad Celsius, 60 U/min für 18 Stunden. Entleeren Sie den HERV-Genchip und füllen Sie die Sonde. Werden Sie mit 250 Mikrolitern Waschpuffer angeordnet, 600 Mikroliter SAPE-Lösungsmischung und 600 Mikroliter Antikörperlösungsmischung an den Positionen Nummer eins und Nummer zwei platziert, 800 Mikroliter Array-Haltepuffer an der Position platziert.

Nummer drei, drücken Sie die Nadeln nach unten. Weisen Sie jedem Modul den richtigen Chip zu. Wählen Sie das Protokoll FS 4 5 0 0 0 4 und führen Sie jedes Modul gemäß den Anweisungen der Software aus.

Tragen Sie harte Stellen auf die SEPTA auf, um ein Auslaufen zu verhindern. Legen Sie dann den Chip in den Autoloader oder alternativ direkt in den Scanner ein. Starten Sie den Scanvorgang.

Nachdem Sie die CEL-Dateien des Chip-Dots gescannt haben, überprüfen Sie das Bild und richten Sie das Raster an der Stelle aus, um die Sondenzellen zu identifizieren. Unterziehen Sie die Chips auch mehreren Qualitätskontrollmessungen. Normalisieren Sie nun die Chips und wenden Sie einen hierarchischen Clustering-Ansatz an, um den Datensatz zu untersuchen. Nach der Normalisierung wurde eine signifikante Analyse durchgeführt, um nach differentiell exprimierten Genen aus dem Microarray-Verfahren zu suchen, und es folgte eine Korrektur der falschen Entdeckungsrate bei fünf Match-Pair-Tumor- und normalen Prostata-RNA-Proben.

Dies führte zur Identifizierung von 207 HERV-Sondensets mit differentiellen Expressionswerten. Eine weitere Analyse von 35 zusätzlichen Match-Pair-Proben aus anderen Krebsgeweben identifizierte 44 prostataspezifische HERV-Sondensets. Dies sind die 10 relevantesten HERV-Strukturen.

Schließlich kann die Funktionsanalyse in einer dedizierten Schnittstelle durchgeführt werden, die aus annotierten Sequenzen von Interesse besteht, die durch ein H-E-R-V-W-Element veranschaulicht werden, das aus den Top 10 der identifizierten proviralen Strukturen ausgewählt wurde, oben mit seinen speziellen spezifischen Sonden markiert ist, die auf dem H-E-R-V-V-zwei Array vorhanden sind und mit den funktionellen retroviralen Regionen LTR-Gag POLE N markiert sind, und mit einem Schwerpunkt auf den fünf Prime-LTRU-drei und U fünf Subdomänen, und das anschließende Design von PCR-Primern für die RT-PCR-Validierung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die kritischen Schritte bei der Proben- und Zielvorbereitung beherrschen können, die Qualitätsvoraussetzungen für den erfolgreichen Einsatz von Mikrostrahlen für die Erde sowie für die konventionelle Entdeckung von Biomarkern sind. Wir haben einen Microarray mit hoher Dichte im Ametri-Format entwickelt, mit dem Ziel, die Expression einzelner Loci optimal zu charakterisieren, um besser zu verstehen, ob sie aktiv sein können, wenn die NA-Transkription im trockenen Non-Con-Bereich erfolgt oder die kodierende Genexpression moduliert.

Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der chronischen und infektiösen Krankheiten den Weg, da die systematische Identifizierung aktiver Voci genetische, virale und umweltbedingte Hypothesen als auslösende Faktoren bei verschiedenen Pathologien vereinheitlichen kann. Die Arbeit mit einer begrenzten Anzahl von Proben in einem technischen Proof-of-Concept-Experiment kann schwierig sein, um Biomarker erfolgreich zu entdecken, Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wie z. B. die Einhaltung eines statistisch validierten Arbeitsablaufs, einschließlich der Robustheit der Methode, und eine repräsentative Stichprobe der Zielpatientenpopulation.