Eine Next-Generation Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll zur Biomarker-Studien
23. September 2014
Das Protokoll zielt auf die Optimierung der Konstruktion und Qualität der Gewebe-Mikroarrays für Biomarker-Forschung. Es umfasst Aspekte der Planung und Design, digitale Pathologie, virtuellen Schiebe Anmerkungen und automatisierte Gewebeanordnungs.
Ziel des folgenden Vorgehens ist es, optimale bzw. zielgerichtete Gewebe-Microarrays für den späteren Einsatz in der Biomarkerforschung zu konstruieren. Zunächst wird ein digitales Objektträgerarchiv aus repräsentativen Gewebeobjektträgern generiert. Histologische Areale von Interesse werden auf den digitalen Objektträgern annotiert, um die genauen Regionen der entsprechenden Spenderblöcke zu spezifizieren, die auf den Gewebemikrostrahlenblock übertragen werden sollen.
Nachdem das Design und die Layouts der Gewebe-Microarrays erstellt wurden, werden die Spenderblöcke automatisch gestanzt und die Ursache in die Gewebe-Microarrays geladen. Mit diesem präzisen, schnellen und automatisierten Ansatz der nächsten Generation können präzise histologische Bereiche oder sogar bestimmte Zellgruppen genau erfasst und auf einen Gewebe-Microarray übertragen werden. Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden des Gewebemikrorings, wie z.B. der Verwendung eines hausgemachten oder halbautomatischen Geräts, ist eindeutig die histologische Genauigkeit.
Dies wird durch die Kombination der Stärken der digitalen Pathologie mit histologischer Expertise und auch automatisiertem Gewebemikroring erreicht, die das Verfahren heute von Kalin Hamman und Jose Galvan demonstrieren. Zwei technische Unterstützung durch unser Labor Mit der Scan-Software. Wählen Sie zunächst den Automatikmodus für das Hellfeld-Scannen.
Klicken Sie dann auf Scan-Optionen, um die Parameter für die Folienqualität anzupassen. Wählen Sie nun, ob Sie die Objektträgerscans lokal oder im Web speichern möchten, indem Sie auf Serverparameter klicken und das Scanziel auf das Case Center setzen. Bereiten Sie nun die Dias vor, bevor Sie sie in das Magazin einlegen. Überprüfen Sie beim Scanner, ob die Dias sauber sind.
Bei Bedarf reinigen Mit Ethanol können bis zu 25 Dias in jedes Magazin eingelegt werden und der Scanner kann mit bis zu 10 Magazinen bestückt werden. Mehrere Magazine werden gestapelt, wenn sie geladen sind. Nachdem die Folien geladen sind, geben Sie alle Folien und Dateinamen an, und legen Sie den Speicherordner in der Fallmitte fest.
Beginnen Sie nun mit dem Scannen der Folie, indem Sie auf den grünen Pfeil klicken. In diesem Abschnitt werden die Stellen, von denen Gewebeproben auf den Objektträger gestanzt werden, durch Anmerkungen zum digitalen Objektträger festgelegt. Beginnen Sie mit dem Öffnen des digitalen Folienordners.
In der Anzeigesoftware können Änderungen am Ordner selbst vorgenommen werden. Notizen können hinzugefügt werden, die Folien können neu angeordnet werden und Benutzerrechte können ebenso wie Anhänge festgelegt werden. Beginnen Sie nun mit dem Kommentieren der Folien, indem Sie auf eine klicken.
Es wird im Viewer angezeigt. Im Viewer. Verwenden Sie das Vergrößerungswerkzeug, um den Objektträger zu bewerten und die interessanten Bereiche für die Integration in die TMA der nächsten Generation zu finden.
Wählen Sie mit dem TMA-Anmerkungswerkzeug die Größe des gewünschten Kerns und die Farbe der Anmerkung aus. Hängen Sie diese Anmerkung an eine Folie an, indem Sie auf die Folie klicken. Verschieben Sie dann die Annotation in die gewünschten histologischen Strukturen.
Diese Annotationen markieren die Stanzstellen auf dem entsprechenden Gewebeblock. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Folien mit Anmerkungen versehen sind. Eine alternative Option für die Gewebeursache besteht darin, sie zur molekularen Analyse in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen zu schicken.
Kommentieren Sie die Folien mit einer anderen Farbmarkierung, um diese Punkte von denen zu unterscheiden, die die TMA sind. Nachdem Sie alle Anmerkungen erstellt haben, speichern Sie eine Tabellenkalkulationsdatei, die eine Liste aller Folien mit den entsprechenden Anmerkungen und den Anmerkungsfarben enthält. Beginnen Sie mit der Mikrorekonstruktion des Gewebes, indem Sie die entsprechenden Paraffingewebeblöcke für alle annotierten digitalen Objektträger entnehmen, und so weiter.
Werden die Spenderblöcke genannt. Sortieren Sie die Blöcke in der gleichen Reihenfolge wie die digitalen Folien. Vergewissern Sie sich, dass jeder Block mindestens vier Millimeter dick ist.
Wenn nicht, muss das Gewebe am Computer neu erfunden werden. Öffnen Sie den Gewebe-Microarray der Software und geben Sie einen Namen für das Projekt an. Gehen Sie zum Werkzeugwechsel und wählen Sie den gewünschten Werkzeugdurchmesser aus.
Laden Sie nun bis zu 12 Empfängerblöcke in die Maschine. Notieren Sie sich die Blocknamen. Sie sollten aus Gründen der Konsistenz alle mit demselben Nummerierungssystem beschriftet werden.
Weisen Sie dann in der Software jedem der Blöcke den entsprechenden Namen zu, um ein TMA-Layout zu erstellen. Erstellen Sie zunächst ein neues TMA-Design, indem Sie die Anzahl der Zeilen, Spalten, leeren Zeilen und den Abstand der Stempel zuweisen. Speichern Sie das Layout und ordnen Sie es dem Baustein zu.
Wiederholen Sie dann den Vorgang für den nächsten Block. Bei einem neuen Layout oder dem gleichen Layout können die Kerngrößen zwischen den Empfängerblöcken variiert werden. Laden Sie anschließend bis zu 60 Spenderblöcke in die Maschine.
In jede Reihe passen bis zu 10 Blöcke. A bis F.Verbleibende Donorblöcke werden später in die Software geladen. Geben Sie jedem Spenderblock einen identifizierenden Namen.
Von jedem Block wird automatisch ein Bild erfasst. Richten Sie nun die digitalen Objektträger an den entsprechenden Spenderblöcken aus. Wählen Sie zunächst einen Block aus.
Klicken Sie dann auf Folie und vergleichen Sie die Folien- und Blockbilder nebeneinander. Wählen Sie Referenzpunkte auf dem Bild des Spenderblocks aus, die bestimmten Punkten auf der entsprechenden digitalen Folie entsprechen. Klicken Sie dann auf Weiter und die Anmerkungen wandern auf das Bild des Spenderblocks.
Wenn die Anmerkungen korrekt sind, klicken Sie auf die einzelnen Anmerkungen, um die Position zu bestätigen. Klicken Sie dann auf Start. Dies veranlasst den Microarray, ein Loch am Referenzpunkt im Empfängerblock zu bohren, dann an der gleichen Stelle ein Loch aus dem Spenderblock zu stanzen und den Kern auf den Empfängerblock zu übertragen.
Um Kerne für ein PCR-Röhrchen zu sammeln, klicken Sie auf das PCR-Werkzeug für den Block. Bis zu vier Annotationen können verwendet werden, um dem Röhrchen Gewebe zuzuführen. Sobald sie eingestellt sind, klicken Sie auf Start und der Spender wird aufgerufen und die Sonde geladen.
Nachdem die Maschine Kerne gebohrt und gestanzt hat, aktualisieren Sie das Bild des Spenderblocks. Fahren Sie mit dem Wiederholen des Ausrichtens und Kommentieren für den nächsten Block fort. Dann kernen Sie es.
Tun Sie dies weiterhin für jeden einzelnen Spenderblock. Das wird in der TMA sein. Wenn der erste Satz von 60 Spenderblöcken fertig ist, entladen Sie sie und laden Sie 60 weitere Blöcke ein.
Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Spenderblöcke angeordnet sind. Nachdem Sie ca. 500 Kerne entnommen haben, reinigen Sie den Bohrer und das Stanzwerkzeug wird zum Einsatz. Wenn die Arrays fertiggestellt sind, exportieren Sie das Projekt.
Eine Tabellenkalkulationsdatei mit den Projektdaten befindet sich im Exportordner. Es zeigt die Position jeder Probe innerhalb jedes TMA-Blocks an. Speichern Sie dann die Spenderblockbilder mit überlagerten Anmerkungen als JPEG-Dateien in den Exportordner.
Damit ist der Prozess zum Generieren des TMA-Blocks abgeschlossen. Dieses TMA-Layout zeigt sechs NG TMA-Blöcke, die in zwei Kopien für 12 endgültige Blöcke erstellt wurden, um das Array zu füllen. Jeder Tumorblock enthielt 402 Gewebeflecken und jeder normale Gewebeblock enthielt 268 Flecken.
Nachdem 60 Spenderblöcke annotiert waren, wurde die Ursache gestanzt. Die Kernübertragungszeit betrug ca. 12 Sekunden. Der Kernverlust war minimal, und die Gesamtzeit für ein Array, dieses Projekt, betrug insgesamt etwa 24 Stunden.
Dies beinhaltete die Zeit, die benötigt wurde, um die Ursache für die nachfolgende molekulare Analyse nach dem Prozess von N-G-T-M-A zu stanzen. Andere Methoden, wie die Immunhistochemie in der Zytohybridisierung und sogar spezielle Färbungen, können auf diese Gewebe-Microarrays angewendet werden, um einige Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene oder Proteine in verschiedenen Geweben exprimiert oder sogar verändert werden.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion und Optimierung von Gewebemikroarrays für die Biomarker-Forschung. Es integriert digitale Pathologie und automatisiertes Gewebearraying, um die histologische Genauigkeit zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biomarker-Forschung
- Gewebemikroarray-Technologie
- Digitale Pathologie
Hintergrund
- Gewebemikroarrays sind wesentlich für die Hochdurchsatz-Biomarker-Analyse.
- Digitale Diaarchive ermöglichen eine präzise Annotation histologischer Bereiche.
- Automatisierte Prozesse verbessern die Effizienz und Genauigkeit bei der Gewebeprobenahme.
- Histologische Expertise ist entscheidend für die optimale Gewebeauswahl.
Zweck der Studie
- Konstruktion gezielter Gewebemikroarrays für die Biomarker-Forschung.
- Verbesserung der Genauigkeit der Gewebeprobenahme durch Automatisierung.
- Stromlinienförmiger Prozess der digitalen Diaannotation und Gewebeübertragung.
Verwendete Methoden
- Erstellung digitaler Diaarchive aus repräsentativen Gewebedias.
- Annotation histologischer Interessensbereiche auf digitalen Dias.
- Automatisiertes Punchen von Donorblöcken zur Erstellung von Gewebemikroarrays.
- Verwendung von Software für TMA-Design und Layout-Management.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Konstruktion von Gewebemikroarrays mit hoher histologischer Genauigkeit.
- Effiziente Übertragung gezielter Gewebeproben auf Empfängerblöcke.
- Verbesserter Workflow durch Automatisierung und Integration digitaler Pathologie.
- Erstellung eines umfassenden Projektdaten-Spreadsheets für weitere Analysen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert signifikant die Qualität der Gewebemikroarrays.
- Die Kombination von digitaler Pathologie mit automatisierten Techniken liefert präzise Ergebnisse.
- Dieser Ansatz ist vorteilhafter als traditionelle Methoden der Gewebemikroarray-Konstruktion.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Next-generation tissue microarray (ngTMA) technology addresses the critical need for precise, reproducible tissue sampling in biomarker discovery and validation. By integrating digital pathology with automated arraying, ngTMA enhances histological accuracy and throughput, directly supporting target validation and assay development workflows. This approach reduces biological noise in preclinical models, improving predictive confidence in lead identification and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing specific histological regions such as tumor center, invasion front, and metastatic sites for functional target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise annotation of tissue zones, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating standardized tissue spots from annotated regions, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated punching and digital slide matching, ensuring consistent sample preparation across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by incorporating multiple tissue types/histological zones (e.g., tumor, lymph node, liver metastases, normal tissue) from patient samples.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by producing multiple ngTMA copies for parallel analysis in immunohistochemistry, in situ hybridization, and special stains.
Pipeline & Workflow Integration
ngTMA integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work by providing quantitative, spatially resolved tissue outputs that support hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through precise capture of histological areas of interest via digital annotation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via automated arraying of annotated regions producing standardized tissue spots.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions through digital slide annotation and project data export for further analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by enabling application of IHC, ISH, and special stains on ngTMAs to assess protein/gene expression across tissue zones.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through the production of multiple ngTMA copies and digital slide archiving for future studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, digital pathology, and tissue microarray design.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including automated tissue arrayer, slide scanner, and web-based annotation platform.
- Cross-team standardization requirements for annotation protocols, block labeling, and data management.
- Adaptation considerations across model systems such as varying tissue types, core sizes, and patient sample volumes.
- Practical limitations supported by source material including annotation time (2-3 min/case), scanning requirements (3 overnight runs for 134 patients), and arraying time (15-20 hr).
