Eine Next-Generation Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll zur Biomarker-Studien

Ziel des folgenden Vorgehens ist es, optimale bzw. zielgerichtete Gewebe-Microarrays für den späteren Einsatz in der Biomarkerforschung zu konstruieren. Zunächst wird ein digitales Objektträgerarchiv aus repräsentativen Gewebeobjektträgern generiert. Histologische Areale von Interesse werden auf den digitalen Objektträgern annotiert, um die genauen Regionen der entsprechenden Spenderblöcke zu spezifizieren, die auf den Gewebemikrostrahlenblock übertragen werden sollen.

Nachdem das Design und die Layouts der Gewebe-Microarrays erstellt wurden, werden die Spenderblöcke automatisch gestanzt und die Ursache in die Gewebe-Microarrays geladen. Mit diesem präzisen, schnellen und automatisierten Ansatz der nächsten Generation können präzise histologische Bereiche oder sogar bestimmte Zellgruppen genau erfasst und auf einen Gewebe-Microarray übertragen werden. Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden des Gewebemikrorings, wie z.B. der Verwendung eines hausgemachten oder halbautomatischen Geräts, ist eindeutig die histologische Genauigkeit.

Dies wird durch die Kombination der Stärken der digitalen Pathologie mit histologischer Expertise und auch automatisiertem Gewebemikroring erreicht, die das Verfahren heute von Kalin Hamman und Jose Galvan demonstrieren. Zwei technische Unterstützung durch unser Labor Mit der Scan-Software. Wählen Sie zunächst den Automatikmodus für das Hellfeld-Scannen.

Klicken Sie dann auf Scan-Optionen, um die Parameter für die Folienqualität anzupassen. Wählen Sie nun, ob Sie die Objektträgerscans lokal oder im Web speichern möchten, indem Sie auf Serverparameter klicken und das Scanziel auf das Case Center setzen. Bereiten Sie nun die Dias vor, bevor Sie sie in das Magazin einlegen. Überprüfen Sie beim Scanner, ob die Dias sauber sind.

Bei Bedarf reinigen Mit Ethanol können bis zu 25 Dias in jedes Magazin eingelegt werden und der Scanner kann mit bis zu 10 Magazinen bestückt werden. Mehrere Magazine werden gestapelt, wenn sie geladen sind. Nachdem die Folien geladen sind, geben Sie alle Folien und Dateinamen an, und legen Sie den Speicherordner in der Fallmitte fest.

Beginnen Sie nun mit dem Scannen der Folie, indem Sie auf den grünen Pfeil klicken. In diesem Abschnitt werden die Stellen, von denen Gewebeproben auf den Objektträger gestanzt werden, durch Anmerkungen zum digitalen Objektträger festgelegt. Beginnen Sie mit dem Öffnen des digitalen Folienordners.

In der Anzeigesoftware können Änderungen am Ordner selbst vorgenommen werden. Notizen können hinzugefügt werden, die Folien können neu angeordnet werden und Benutzerrechte können ebenso wie Anhänge festgelegt werden. Beginnen Sie nun mit dem Kommentieren der Folien, indem Sie auf eine klicken.

Es wird im Viewer angezeigt. Im Viewer. Verwenden Sie das Vergrößerungswerkzeug, um den Objektträger zu bewerten und die interessanten Bereiche für die Integration in die TMA der nächsten Generation zu finden.

Wählen Sie mit dem TMA-Anmerkungswerkzeug die Größe des gewünschten Kerns und die Farbe der Anmerkung aus. Hängen Sie diese Anmerkung an eine Folie an, indem Sie auf die Folie klicken. Verschieben Sie dann die Annotation in die gewünschten histologischen Strukturen.

Diese Annotationen markieren die Stanzstellen auf dem entsprechenden Gewebeblock. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Folien mit Anmerkungen versehen sind. Eine alternative Option für die Gewebeursache besteht darin, sie zur molekularen Analyse in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen zu schicken.

Kommentieren Sie die Folien mit einer anderen Farbmarkierung, um diese Punkte von denen zu unterscheiden, die die TMA sind. Nachdem Sie alle Anmerkungen erstellt haben, speichern Sie eine Tabellenkalkulationsdatei, die eine Liste aller Folien mit den entsprechenden Anmerkungen und den Anmerkungsfarben enthält. Beginnen Sie mit der Mikrorekonstruktion des Gewebes, indem Sie die entsprechenden Paraffingewebeblöcke für alle annotierten digitalen Objektträger entnehmen, und so weiter.

Werden die Spenderblöcke genannt. Sortieren Sie die Blöcke in der gleichen Reihenfolge wie die digitalen Folien. Vergewissern Sie sich, dass jeder Block mindestens vier Millimeter dick ist.

Wenn nicht, muss das Gewebe am Computer neu erfunden werden. Öffnen Sie den Gewebe-Microarray der Software und geben Sie einen Namen für das Projekt an. Gehen Sie zum Werkzeugwechsel und wählen Sie den gewünschten Werkzeugdurchmesser aus.

Laden Sie nun bis zu 12 Empfängerblöcke in die Maschine. Notieren Sie sich die Blocknamen. Sie sollten aus Gründen der Konsistenz alle mit demselben Nummerierungssystem beschriftet werden.

Weisen Sie dann in der Software jedem der Blöcke den entsprechenden Namen zu, um ein TMA-Layout zu erstellen. Erstellen Sie zunächst ein neues TMA-Design, indem Sie die Anzahl der Zeilen, Spalten, leeren Zeilen und den Abstand der Stempel zuweisen. Speichern Sie das Layout und ordnen Sie es dem Baustein zu.

Wiederholen Sie dann den Vorgang für den nächsten Block. Bei einem neuen Layout oder dem gleichen Layout können die Kerngrößen zwischen den Empfängerblöcken variiert werden. Laden Sie anschließend bis zu 60 Spenderblöcke in die Maschine.

In jede Reihe passen bis zu 10 Blöcke. A bis F.Verbleibende Donorblöcke werden später in die Software geladen. Geben Sie jedem Spenderblock einen identifizierenden Namen.

Von jedem Block wird automatisch ein Bild erfasst. Richten Sie nun die digitalen Objektträger an den entsprechenden Spenderblöcken aus. Wählen Sie zunächst einen Block aus.

Klicken Sie dann auf Folie und vergleichen Sie die Folien- und Blockbilder nebeneinander. Wählen Sie Referenzpunkte auf dem Bild des Spenderblocks aus, die bestimmten Punkten auf der entsprechenden digitalen Folie entsprechen. Klicken Sie dann auf Weiter und die Anmerkungen wandern auf das Bild des Spenderblocks.

Wenn die Anmerkungen korrekt sind, klicken Sie auf die einzelnen Anmerkungen, um die Position zu bestätigen. Klicken Sie dann auf Start. Dies veranlasst den Microarray, ein Loch am Referenzpunkt im Empfängerblock zu bohren, dann an der gleichen Stelle ein Loch aus dem Spenderblock zu stanzen und den Kern auf den Empfängerblock zu übertragen.

Um Kerne für ein PCR-Röhrchen zu sammeln, klicken Sie auf das PCR-Werkzeug für den Block. Bis zu vier Annotationen können verwendet werden, um dem Röhrchen Gewebe zuzuführen. Sobald sie eingestellt sind, klicken Sie auf Start und der Spender wird aufgerufen und die Sonde geladen.

Nachdem die Maschine Kerne gebohrt und gestanzt hat, aktualisieren Sie das Bild des Spenderblocks. Fahren Sie mit dem Wiederholen des Ausrichtens und Kommentieren für den nächsten Block fort. Dann kernen Sie es.

Tun Sie dies weiterhin für jeden einzelnen Spenderblock. Das wird in der TMA sein. Wenn der erste Satz von 60 Spenderblöcken fertig ist, entladen Sie sie und laden Sie 60 weitere Blöcke ein.

Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Spenderblöcke angeordnet sind. Nachdem Sie ca. 500 Kerne entnommen haben, reinigen Sie den Bohrer und das Stanzwerkzeug wird zum Einsatz. Wenn die Arrays fertiggestellt sind, exportieren Sie das Projekt.

Eine Tabellenkalkulationsdatei mit den Projektdaten befindet sich im Exportordner. Es zeigt die Position jeder Probe innerhalb jedes TMA-Blocks an. Speichern Sie dann die Spenderblockbilder mit überlagerten Anmerkungen als JPEG-Dateien in den Exportordner.

Damit ist der Prozess zum Generieren des TMA-Blocks abgeschlossen. Dieses TMA-Layout zeigt sechs NG TMA-Blöcke, die in zwei Kopien für 12 endgültige Blöcke erstellt wurden, um das Array zu füllen. Jeder Tumorblock enthielt 402 Gewebeflecken und jeder normale Gewebeblock enthielt 268 Flecken.

Nachdem 60 Spenderblöcke annotiert waren, wurde die Ursache gestanzt. Die Kernübertragungszeit betrug ca. 12 Sekunden. Der Kernverlust war minimal, und die Gesamtzeit für ein Array, dieses Projekt, betrug insgesamt etwa 24 Stunden.

Dies beinhaltete die Zeit, die benötigt wurde, um die Ursache für die nachfolgende molekulare Analyse nach dem Prozess von N-G-T-M-A zu stanzen. Andere Methoden, wie die Immunhistochemie in der Zytohybridisierung und sogar spezielle Färbungen, können auf diese Gewebe-Microarrays angewendet werden, um einige Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene oder Proteine in verschiedenen Geweben exprimiert oder sogar verändert werden.