Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine einfache und vielseitige Lösung zur Überwachung verschiedener reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und ihrer Lokalisierung zu bieten und weitere Einblicke in ROS-bezogene zelluläre Mechanismen zu liefern. Dies wird durch die Durchführung von drei verschiedenen Assays erreicht, von denen der erste RST grüne oder OB G-beschichtete Kügelchen und Live-Mikroskopie, ob g Fluorescein und Alexa verwendet. Fluor 594 sind über BSA kovalent an die Oberfläche von drei Mikrometer großen Sica-Kügelchen gekoppelt.

Die Fluoreszenzemission des OBG-Fluoresceins zeigt die Oxidation durch ROS an, während das Signal von Alexa Fluor 594 bei der Lokalisierung der Kügelchen hilft und als Kontrolle für die Fluoreszenzquantifizierung dient. Bei der zweiten Methode wird die superoxidempfindliche Sonde Dihydroethidium oder DHE in einem auf Plattenlesern basierenden Assay verwendet. Infolge der Oxidation durch Superoxid ist Ethidium in der Lage, in die Kern- und Mitochondrien-DNA zu interkalieren und hat Anregungs- und Emissionsspitzen bei 522 Nanometern bzw. 605 Nanometern verschoben.

Die Fluoreszenzintensität der AUM entspricht der Menge der Superoxidproduktion, was eine quantitative Messung der intrazellulären Superoxidbildung in den Zellen ermöglicht. Die dritte Methode ist ebenfalls ein auf Plattenlesern basierender Assay. Die Wasserstoffperoxid-empfindliche Sonde plex ultra red oder ein UR wird zur quantitativen Messung der extrazellulären Wasserstoffperoxidproduktion verwendet.

Die Fluoreszenzintensität eines UR OX entspricht der Menge an Wasserstoffperoxid, die außerhalb der Zellen produziert wird. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine Lokalisierung der dynamischen ROS-Erzeugung auf der Grundlage der O-B-G-D-H-E- und a-UR-Assays zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den anderen bestehenden Methoden, wie z.B. Plattenraten-basierten OB-GSAs, besteht darin, dass sie die Al Roth-Erzeugung dynamisch auf Einzelzellebene visualisiert.

Anstelle von Spiegelung und gemitteltem Roth-Signal von einer Population von Zellen. Solche Methoden zur Mittelung der Population neigen dazu, kritische Informationen aufgrund der nicht-synchronen Phagozytose zu verschleiern. Um das Verfahren zur Codierung von Kügelchen mit Oxy, Burt Green oder OBG zu beginnen, geben Sie einen Milliliter einer Suspension aus 3,0 Mikron carboxylierten Siliziumdioxidkügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Drehen Sie das Rohr und entfernen Sie schnell den Überstand. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und wirbeln Sie auf diese Weise vortexen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit PBS.

Entfernen Sie nach der dritten Wäsche den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen. In einem Milliliter PBS, der 25 Milligramm pro Milliliter Cyanid enthält, muss die Cyanidlösung jedes Mal frisch zubereitet werden, bevor sie verwendet wird, 15 Minuten lang auf einem Rad inkubieren. Dadurch werden die carboxylierten Siliziumdioxidkügelchen aktiviert, um nach 15 Minuten kovalent vormarkiertes BSA zu binden, das Röhrchen zu zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.

Geben Sie einen Milliliter Kupplungspuffer hinzu und waschen Sie das Röhrchen dreimal mit Kupplungspuffer durch schnelles Schleudern und Vortexen, um überschüssiges Cyanid zu entfernen, mischen Sie die gewaschenen Kügelchen mit 500 Mikrolitern Kupplungspuffer, der ein Milligramm OBGH enthält, zwei H-F-F-B-S-A und füllen Sie dann das Röhrchen mit Stickstoffgas aus einer handelsüblichen Gasdose. Nachdem das Röhrchen verschlossen wurde, das am folgenden Tag 14 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Rad inkubiert wurde, wird das nicht reaktive OBG abgeschreckt, indem die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter Quenchpuffer durch schnelles Schleudern und Vortexen gewaschen werden, dann zweimal mit Kupplungspuffer gewaschen wird, um den Quenchpuffer zu entfernen. Nach Entfernen des Überstands wird ein Milliliter Kupplungspuffer mit 50 Mikrogramm LOR 594 cin einem mittleren Ester zugegeben, um an BSA zu konjugieren.

Füllen Sie das Röhrchen mit der Stickstoffkappe und inkubieren Sie es 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der 1,5-stündigen Inkubation stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter Quenchpuffer waschen. Anschließend werden die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter PBS gewaschen.

Zum Schluss, Ray, suspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter PBS mit zwei Mikrolitern von 10 % Gewicht pro Volumen. Azid für die Langzeitlagerung. Messen Sie die Konzentration der Kügelchen in der Suspension mit einem Hämozytometer, sie beträgt typischerweise ein bis zwei mal 10 bis zum neunten Kügelchen pro Milliliter.

Füllen Sie das Röhrchen mit der Stickstoffkappe und lagern Sie es vier Grad Celsius im Dunkeln. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie exponentiell wachsende Aliumzellen von einer 10 Zentimeter großen Petrischalenplatte ernten. Unterschiedlich dichten der Zellen auf drei Zentimeter große Schalen mit optisch klarem Kunststoff- oder Glasboden und züchten sie über Nacht am nächsten Morgen.

Wählen Sie für die Verwendung im Experiment die Gerichte, die zu etwa 80 % zusammenfließen. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch ein Medium mit niedrigem Durchfluss oder LF und inkubieren Sie es zwei Stunden vor dem Experiment, um die extrazelluläre und intraendosomale Autofluoreszenz des HL fünf C-Kulturmediums zu verringern. Schmelzen Sie 10 Milliliter 1,5%igen BDO-Agar in LF-Medium und gießen Sie den Agar auf eine ebene Fläche, um eine etwa einen Millimeter dicke Agarschicht zu bilden.

Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis sich der Agar verfestigt hat. Schneiden Sie die Agarschicht in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate und legen Sie sie für später in LF-Medium. Gebrauchen. Reparieren Sie das Weitfeldmikroskop.

Stellen Sie die Temperatur der Klimakammer auf 22 Grad Celsius ein und passen Sie die für das Experiment erforderlichen Einstellungen an. Nach zweistündiger Inkubation aspirieren Sie das LF-Medium aus der Drei-Zentimeter-Schale, lassen Sie die Zellmonoschicht jedoch mit einem dünnen Mediumfilm bedeckt. Verdünnen Sie die zuvor vorbereiteten OBG-beschichteten Kügelchen auf 1,5 mal 10 bis die siebten Kügelchen pro Milliliter und geben Sie 10 Mikroliter auf die Zellschicht.

Nehmen Sie ein quadratisches Agarblatt und lassen Sie überschüssige Flüssigkeit abtropfen, aber halten Sie das Agar feucht. Legen Sie das Agarquadrat vorsichtig auf die Zellschicht. Die Agar-Überlagerung erhöht den Kontakt zwischen Kügelchen und Zellen und verbessert so die Aufnahme.

Außerdem werden die Zellen leicht zusammengedrückt, so dass sie besser in der Fokusebene des Objektivs bleiben. Setzen Sie den Deckel auf die Schüssel Für den Erfolg des Experiments. Bewegen Sie das AGA-Overlay nicht, wenn es die Zellen bedeckt, und es ist auch wichtig, sofort mit dem Bildgebungsschritt zu beginnen.

Stellen Sie dann die Schüssel auf den Mikroskoptisch und nehmen Sie automatisch zwei Stunden oder länger im Minutentakt Bilder im Rot-, Grün- und Phasenkanal auf. Um die ROS-Produktion zu messen, wählen Sie zelluläre Ereignisse aus und konzentrieren Sie sich darauf, die den gesamten Prozess der Phagozytose enthalten. Führen Sie mit einer professionellen Bildbearbeitungssoftware die optimierten drei Kanäle zusammen und fügen Sie die Bilder zu einem Film zusammen.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensitäten jeder der ausgewählten Kügelchen im roten und grünen Kanal. Das Verhältnis von Rot zu Grün spiegelt die dynamische FOMO-Produktion der Zellen wider. Um die intrazelluläre Superoxidproduktion zu messen, sammeln Sie zuerst eine 180%ige konfluente Schale von Alium in 10 Millilitern HL Five C Medium, zentrifugieren Sie anschließend Aliumzellen bei 850 mal G für fünf Minuten und aspirieren Sie vorsichtig und vollständig das Medium, resuspendieren Sie Zellen in SS 6.4-Pufferzählzellen und verdünnen Sie sie auf eine endgültige Dichte von sechsmal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter.

Geben Sie 50 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung einer weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platte, verdünnen Sie Dihydroethidium- oder DHE-Stamm 500-fach mit SS 6.4-Puffer. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter des verdünnten DHE in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu dosieren. Die Endkonzentration von DHE beträgt 30 Mikromolaren.

Die Reaktion beginnt sofort. Stimuli oder Inhibitoren können zu diesem Zeitpunkt oder zu anderen Zeitpunkten hinzugefügt werden, je nach spezifischem Bedarf. Inkubieren Sie die Zellen bei mittlerem Schütteln bei 22 Grad Celsius.

Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader eine Stunde lang alle zwei Minuten ab. Verwenden Sie den Endpunkt-Top-Reading-Modus mit Fluoreszenzanregung bei 522 Nanometern und Emission bei 605 Nanometern. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine 96-Well-Platte mit Diumzellen vorbereiten, wie im vorherigen Segment gezeigt.

Bereiten Sie verdünnte Meerrettichperoxidase oder HRP vor, indem Sie fünf Mikroliter HRP-Brühe in 10 Milliliter SS 6.4-Puffer geben. Drehen Sie das Rohr um, um es gut zu vermischen und auf Eis zu halten. Die verdünnte HRP-Lösung liegt bei 0,05 Einheiten pro Milliliter.

Bereiten Sie das Plex Ultra Red oder ein UR-Reaktionsgemisch vor, indem Sie den UR-Stamm und die verdünnte HRP-Lösung in den SS 6.4-Puffer bis zu einer Endkonzentration von 6,25 mischen. Mikromolar a UR und 0,005 Einheiten pro Milliliter. HRP Geben Sie 50 Mikroliter einer UR-Mischung in jede Vertiefung

Die Reaktion beginnt sofort. Stimuli oder Inhibitoren können zu diesem Zeitpunkt oder zu anderen Zeitpunkten hinzugefügt werden, je nach spezifischem Bedarf. Inkubieren Sie die Zellen bei mittlerem Schütteln bei 22 Grad Celsius.

Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader eine Stunde lang alle zwei Minuten ab. Verwenden Sie den Endpunkt-Top-Reading-Modus mit Fluoreszenzanregung bei 530 Nanometern und Emission bei 590 Nanometern. Die Beschichtungseffizienz des OBG-Fluoresceins wird getestet, indem die beschichteten Kügelchen in vitro mit Wasserstoffperoxid und HRP oxidiert werden und das Emissionsspektrum durch Anregung bei 500 Nanometern überprüft wird.

Wie in dieser Grafik gezeigt, weisen die oxidierten Kügelchen einen signifikanten Emissionspeak bei 538 Nanometern auf, verglichen mit dem von nicht oxidierten Kügelchen mit einem Intensitätsverhältnis von mindestens dem 11- bis 12-fachen. Die Bildung von ROS in Phagosomen in Diumzellen kann qualitativ und dynamisch mikroskopisch sichtbar gemacht werden, wie in diesem repräsentativen Zeitrafferfilm gezeigt, der in der ersten Minute nach dem Aufwärtstrend 40 Minuten lang mit sechsfacher Vergrößerung aufgenommen wurde. Durch Phagozytose änderte sich die Fluoreszenz von OBG-Fluoreszenz-beschichteten Kügelchen von rot zu leuchtend orange, was darauf hindeutet, dass ROS wahrscheinlich direkt in den Phagosomen produziert wurden.

Die intrazelluläre Superoxid- und extrazelluläre Wasserstoffperoxidproduktion wird quantitativ mit dem DHE- bzw. einem UR-Assay gemessen. Eine Zusammenfassung der biochemischen Reaktionen im Zusammenhang mit diesen beiden Assays wird gezeigt. Superoxid wird durch Superoxiddismutase oder SOD in Wasserstoffperoxid umgewandelt und Wasserstoffperoxid wird durch Katalase im DHE-Assay in Wasser und Sauerstoff umgewandelt.

Ein Mikroplatten-Reader wird für die quantitative Messung von intrazellulärem Superoxid mit mittlerem Durchsatz verwendet. Ein repräsentatives Experiment zeigt, dass bei Stimulation mit LPSA-Lipopolysaccharid aus E. coli die dynamische Superoxidproduktion aus AX zwei Zellen signifikant höher ist als das Basalniveau aus nicht stimulierten AX zwei Zellen und der Hintergrund der Reaktion im Puffer, die Abnahme der blauen Fluoreszenz und die Zunahme der roten Fluoreszenz umgekehrt korreliert sind. Erwartungsgemäß.

Die Lokalisierung der R os-Produktion, gemessen mit dem DHE-Assay, wird durch die folgenden Ergebnisse bestätigt. Zusätzlich erhöhte die Zugabe von D-E-D-T-C-A-Membran permeidischer Superoxiddismutase-Inhibitor das DHE-Signal in einer dosisabhängigen Weise, was darauf hindeutet, dass D-E-D-T-C die Akkumulation des Superoxiddismutase-Substrats verursachte. Alternativ hatte die Zugabe eines Membran-IMP-Wasserstoffperoxid-Quenchers keinen Einfluss auf die Superoxidproduktion im A-UR-Assay.

Ein Mikroplatten-Reader wird für die quantitative Messung der extrazellulären Wasserstoffperoxidproduktion mit mittlerem Durchsatz verwendet. Ein repräsentatives Experiment zeigt, dass bei Stimulation mit LPS die dynamische Wasserstoffperoxidproduktion aus AX zwei Zellen signifikant höher ist als das Basalniveau aus nicht stimulierten AX zwei Zellen und die Hintergrundreaktion bei Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von D-E-D-T-C oder Katalase, das A UR-Signal dosisabhängig abnimmt, was auf die Hemmung der Wasserstoffperoxidproduktion aus intrazellulärem Superoxid bzw. die Depletion von extrazellulärem Wasserstoffperoxid zurückzuführen ist. Die Behandlungen mit D-E-D-T-C und Katalase bestätigten ausdrücklich, dass die DHE- und a-UR-Assays spezifisch verschiedene Arten und subzelluläre Lokalisationen von ROS Indicum messen.

Andere Methoden, wie z.B. die Spiegelung der Ross-Generierung während einer Infektion mit pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterien, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie der Dictal-Hengst auf verschiedene Bakterieninfektionen in Bezug auf die Verlustgenerierung reagiert. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Bakterien wie Mikrobakterien marum äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die entsprechende BSL-Richtlinie.