Name: Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Lernen Sie die Erfassung und Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies in Amöben mittels Fluoreszenzmikroskopie und Plattenleser-Assays. Diese Methoden ermöglichen qualitative und quantitative Analysen.

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Wir sind dankbar, dass Dr. Karl-Heinz Krause und Vincent Jaquet um Hilfe und Rat, diese Protokolle einzurichten, und danke auch Christoph Bauer und Jérôme Bosset vom Bioimaging Plattform des NFS und Dr. Navin Gopaldass für ihre technische Unterstützung. Die Forschung wird von einem ProDoc Erteilung des Schweizerischen Nationalfonds unterstützt.

1. Visualisierung und qualitative Messung der ROS-Produktion in Phagosomen Die OBG-beschichteten Kügelchen sollten im Voraus vorbereitet werden. Die Perlen Beschichtungsverfahren und Agar Overlay-Technik werden die veröffentlichten Referenzen 5,14 angepasst. <ol><li> 1 ml Suspension von 3,0 um carboxylierten Silica-Kügelchen (ca. 1,8 x 10 9 Perlen) in ein 1,5-ml-Röhrchen, waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 25 mg / ml Cyanamid (die carboxylierten Silicakügelchen aktivieren kovalent vormarkiert BSA zu binden), Inkubation auf einem Rad 15 min. </li><li> 3x Waschen mit 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natrium-Borat, pH 8,0) durch schnelle Runde (Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge für Mini 5 Sekunden oder alternativ Zentrifuge bei 2000 g für 1 min in einer Tischzentrifuge) und Vortexen, um überschüssige Cyanamid zu entfernen. </li><li> Mischen Sie die gewaschenen Perlen mit 500 ul coupling Puffer mit 1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, füllen Sie das Rohr mit Stickstoffgas aus einer Standard-Gas-Dose vor der Deckelung und Inkubation auf einem Rad 14 Stunden (über Nacht) bei RT im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Beads 2x mit 1 ml Löschpuffer (250 mM Glycin in PBS), um nicht umgesetzte OBG zu entfernen, und zweimal mit Kupplungspuffer, um den Löschpuffer durch schnelle Drehung und Verwirbelung zu entfernen. </li><li> 1 ml Kopplungspuffer, enthaltend 50 &amp;mgr; g des Alexa Fluor 594 Succinimidylester an BSA konjugiert. Das Rohr wird vor dem Verschließen mit Stickstoff und Inkubieren auf einem Rad für 1,5 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Waschen Sie die Beads 3x mit 1 ml Puffer Abschrecken durch schnelle Drehung und Wirbeln, um die Reaktion zu stoppen, dann waschen die Beads 3x mit 1 ml PBS durch schnelle Drehung und Vortex. </li><li> Schließlich Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml PBS mit 2 &amp;mgr; l 10% w / v Azid für langfristige Lagerung. Messen Sie die concentration der Raupen in der Suspension mit einer Zählkammer (in der Regel etwa 1-2 x 10 9 Perlen / ml), füllen Sie das Rohr mit Stickstoff vor der Deckelung, und bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Die Beschichtungseffizienz des OBG Fluorescein kann durch Prüfen des Emissionsspektrums mit einer Anregung bei 500 nm getestet werden. Wenn H 2 O 2 in Gegenwart von Meerrettichperoxidase (HRP) oxidiert, die Fluoreszenzintensität des oxidierten Perlen, bei Emissionspeaks (538 nm), ist die 11-12-fach höher als die der nicht-oxidierten beschichteten Perlen. </li><li> Ernte exponentiell wachsenden Dictyostelium-Zellen aus einer 10 cm Petrischale, Platten unterschiedlicher Dichte der Zellen auf 3 cm Gerichte mit einer optisch klaren Kunststoff-oder Glasboden, und wachsen sie über Nacht. Wählen Sie die Gerichte, die etwa 80% konfluent für das Experiment sind. Ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung von Dictyostelium-Zellen wurde veröffentlicht 15. </li><li> Ersetzen Sie das Kulturmedium mit LoFlo Medium (LF-Medium), Inkubation2 h vor dem Experiment, um die extrazellulären und intraendosomal Autofluoreszenz des HL5C Kulturmedium zu verringern. </li><li> Parallel Schmelze 10 ml 1,5% Bacto Agar in LF Medium, gießen Sie die Agar auf eine flache Oberfläche (dh eine Glasplatte von 10 cm x 10 cm), um eine Agar-Schicht etwa 1 mm Dicke zu bilden, warten Sie 10-15 min verfestigt. Schneiden Sie die Agar-Schicht in 2 cm x 2 cm große Quadrate und in LF Medium für die spätere Verwendung. </li><li> Unterdessen bereiten die Spinnplatte oder Weitfeldmikroskop, stellen Sie die Temperatur der Klimakammer bei 22 ° C und die Einstellungen für dieses Experiment. (Siehe weitere Kommentare in der Diskussion). </li><li> Nach 2 Stunden Inkubation absaugen LF Medium von der 3 cm Schale, aber die Zellmonoschicht sollte noch mit einem dünnen Film des Mediums erfasst werden. Verdünnen Sie die beschichteten Kügelchen bis 1,5 x 10 7 Perlen / ml, und fügen Sie 10 ul auf die Zellschicht. </li><li> Nehmen Sie ein Quadrat Agar Blatt, abtropfen überschüssige Flüssigkeit aber feucht halten. Sanft legte the-Agar Quadrat auf der Oberseite der Zellschicht. Den Agar-Quadrat nicht, wenn er sich auf den Zellen liegen. Die Agar-Overlay wird verwendet, um den Kontakt zwischen Perlen und Zellen zu erhöhen, wodurch die Verbesserung der Aufnahme, und es auch leicht komprimiert die Zellen, halten sie besser in der Brennebene des Objektivs. </li><li> Setzen Sie den Deckel auf die Schüssel, legen Sie es auf den Mikroskoptisch, und automatisch Bilder in den Rot-, Grün-und Phasen Kanäle alle 1 min für 2 Stunden oder länger. </li><li> Wählen und konzentrieren sich auf die zelluläre Ereignisse, die den gesamten Prozess der Phagozytose enthalten. Zusammenführen der drei Kanäle optimiert und montieren Sie die Bilder in einen Film mit professionellen Bildbearbeitungssoftware. Quantifizieren Fluoreszenzintensitäten von jeweils ausgewählten Perlen in rot und grün-Kanälen, und das Verhältnis von Grün / Rot wird die dynamische phagosomalen ROS-Produktion der Zellen reflektieren. </li></ol> 2. Quantitative und Medium-Throughput-Messung der intrazellulären Superoxid-Produktion <ol><li> Sammeln one 80% konfluent Gericht aus Dictyostelium in 10 ml HL5C Medium. Centrifuge Dictyostelium-Zellen bei 850 g für 5 min, sorgfältig und vollständig absaugen überschüssiges Medium. Die Zellen in SS6.4 Puffer [0,12 M Sorbitol in Sorensen-Puffer (14,69 mM KH 2 PO 4 und 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], zählen Zellen und zu verdünnen, um eine endgültige Dichte von 6 x 10 6 Zellen / ml (siehe weitere Kommentare in der Diskussion). </li><li> In 50 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung einer undurchsichtigen weißen 96-Well-Platte (siehe zusätzliche Kommentare in der Diskussion). </li><li> Verdünnen DHE Lager (30 mM in DMSO) 500-fach mit SS6.4, Pipette 50 ul verdünnte DHE in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Die Endkonzentration von DHE 30 uM. Die Reaktion beginnt sofort. </li><li> Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten. </li><li> Verwenden Sie den Endpunkt &quot;top Lesen &amp; #34; Modus eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 522 nm nm/605, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C </li></ol> 3. Quantitative und High Throughput Messung der extrazellulären H 2 O 2-Produktion <ol><li> Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. </li><li> Bereiten verdünnten HRP durch Zugabe von 5 ul HRP Lager (100 U / ml in destilliertem Wasser) in 10 ml SS6.4, Vortex oder das Röhrchen gut mischen und auf Eis für die spätere Verwendung zu halten. Die verdünnte Lösung ist HRP bei 0,05 U / ml. </li><li> Bereiten Sie die AUR Reaktionsgemisch durch Mischen der AUR Lager (10 mM AUR in DMSO) und die verdünnte Lösung in HRP SS6.4 Puffer, um die endgültigen Konzentrationen von 6,25 uM und 0,005 U / ml. Als ein Beispiel, um das Reaktionsgemisch für 40 Reaktionen vorzubereiten, mischen Sie 1600 ul SS6.4 mit 400 ul der verdünnten HRP und 2,5 ul AUR-Stammlösung. </li><li> In 50 ul AUR-Mixtur in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette, wenn nötig. Nun ist die Reaktion beginnt. </li><li> Stimuli oder Inhibitoren können an dieser Stelle nach den spezifischen Bedürfnissen zugegeben werden, oder zu anderen Zeitpunkten. </li><li> Verwenden Sie den Endpunkt &quot;top Lesen&quot;-Modus eines Fluoreszenz-Mikroplattenleser, mit Fluoreszenzanregung / Emission bei 530 nm nm/590, lesen Sie alle 2 min für 1 h, mittel-Shake 5 sec / min, bei 22 ° C </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
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<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
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<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Verfahren, das OBG-Assay visualisiert dynamisch den Prozess der phagosomalen ROS auf Einzelzellebene, anstelle der Messung einer durchschnittlichen ROS Signal von einer Population von Zellen. Solche Bevölkerungs-Mittelungsverfahren neigen dazu, wichtige Informationen von nicht-synchronen Phagozytose verursacht verschleiern. Wir haben erfolgreich DHE und AUR Assays Dictyostelium angepasst und optimiert die Protokolle. Am wichtigsten ist, wir die angegebenen Typen und subze...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in einer Vielzahl von biologischen Prozessen wie der Wirtsabwehr, Signalisierung, Gewebeentwicklung und Reaktion auf eine Verletzung und Bluthochdruck und Krebs beteiligt. Die gut untersuchten phagosomalen NADPH-Oxidase-Maschinen, um eine schnelle ROS Generation, wie die oxidative burst bekannt gewidmet, um Bakterien in Neutrophilen &#39;Phagosomen 1 aufgenommen zu töten. Darüber hinaus wurde eine Leckage von Elektronen als ein Nebenprodukt der mitochondrialen Atmungskette bisher angenommen lediglich für eine ungeregelte Quelle von ROS sein. Aber vor kurzem wurde es als ein wichtiger Mechanismus, um intraphagosomal Abtötung von Bakterien in Maus-Makrophagen 2 beitragen identifiziert. In den letzten Jahren, die soziale Amöbe Dictyostelium, hat sich zu einem leistungsstarken und beliebten Modell zu Zelle intrinsischen Mechanismen der angeborenen Immunantwort zu untersuchen. Tatsächlich Dictyostelium und Menschenfresszellen teilen sich eine überraschend hohe Niveau der Erhaltung in molecular Maschinen für Bakterien erfassen, Einwirkung und Tötung 3,4 verantwortlich. Die Homologen von Proteinen und Enzymen, um die ROS-Produktion oder Entgiftung, wie NADPH-Oxidase, Katalase, Superoxiddismutasen stehen, kann sowohl in der Human-und Dictyostelium gefunden werden. Als die am besten untersuchten Amöbe Dictyostelium stellt mehrere einzigartige Vorteile gegenüber Säugermodellsystem. Sie wachsen bei Raumtemperatur ohne die Notwendigkeit für CO 2, mit einer Verdopplungszeit von 8-10 Stunden. Sie können leicht als adhärente oder Suspensionskulturen gehalten werden. Darüber hinaus dank ihrer vollständig sequenziert und annotierte haploiden Genom, und einfach genetische Manipulation, Dictyostelium hat sich zu einem sehr attraktiven experimentellen Modellorganismus. In früheren Studien verschiedene chlorierte und fluorierte Derivate von Fluorescein-Fluoreszenz, die nach der Oxidation durch ROS emittieren (kollektiv als OxyBurst Grün, OBG bekannt), wurden als ROS-Reporter verwendet. Handy-permeant esterified Derivate zur zytoplasmatischen ROS zu messen, während die Zell-impermeante Dextran-oder Protein-gekoppelten Derivate zur extrazellulären ROS messen. Insbesondere haben OBG BSA-beschichteten Kügelchen bereits zur phagosomalen ROS-Produktion in Säugerzellen 5 zu erkennen. Allerdings kann die Mikroplatten-Reader-Ansatz geben nur eine gemittelte ROS Erzeugungskurve aus einer Population von Zellen. Mit der vorliegenden Protokolls unter Verwendung Dictyostelium, eine professionelle Phagozyten und optimierte Versuchsbedingungen erhalten wir stabile und effiziente Phagozytose ohne jede Konjugation Opsonin auf die Perlen. DHE in verschiedenen Modellsystemen, wie Säuger Neutrophilen und Makrophagen verwendet worden, um zu erkennen ROS 6-9. Inzwischen gibt es einige Kontroversen über die Spezifität und Sensitivität der Methode 8,10. Als verbesserte Version Amplex Red, der Fluoreszenzintensität von AUR weniger empfindlich auf pH-Wert, die es geeignet macht, um zu messenROS in nicht neutrale oder schwach sauren Milieus. AUR wurde kürzlich in mehreren Säugetiersystemen 11,12 aufgebracht, aber ihre Verwendung in Säuger-Modelle, die ziemlich oft erforderlich schwach sauren Wachstumsmedien, wurde noch nicht berichtet worden. Darüber hinaus gibt es keine veröffentlichten Protokoll quantitativ und dynamisch zu messen ROS-Produktion und Lokalisierung in der sozialen Amöbe Dictyostelium. Das Ziel der dargestellte Satz von Protokollen ist, eine einfache und vielseitige Lösung für verschiedene ROS und deren Lokalisation überwachen und weitere Einblicke in ROS bezogenen zellulären Mechanismen. Für die OBG-Test, haben wir Live-Mikroskopie, um den gesamten Prozess der phagosomalen ROS Generation nach Aufnahme von OBG-beschichtete Beads Dictyostelium-Zellen zu überwachen, und ein neuer Ansatz, den Mechanismus der intraphagosomal Abtötung von Bakterien zu untersuchen. Wir haben mittel-Durchsatz DHE und AUR-Assays in Dictyostelium optimiert, um die intrazelluläre Superoxid messenide und extrazellulären H 2 O 2-Produktion, bzw. mit Hilfe LPS als potenter Stimulator ROS. Beachten Sie, dass LPS wurde kürzlich gezeigt, dass die bakterizide Aktivität von Dictyostelium Richtung Phagozytose Bakterien 13 zu erhöhen. Zusätzlich Behandlung mit DEDTC und Katalase ausdrücklich bestätigt, dass diese beiden Methoden speziell messen verschiedene Typen und subzellulärer Lokalisierungen von ROS in Dictyostelium. Schließlich kann der Test zur OBG anhaftendem phagozytische Zelle ferner opsonisierender der Kügelchen mit Liganden für die phagozytische Rezeptoren von tierischen Zellen angepasst werden. Im Prinzip können die DHE und AUR-Assays auch fein abgestimmt für Messungen in anhaftendem oder nicht-adhärenten Zell unter geeigneten experimentellen Bedingungen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylierte Siliziumdioxidkügelchen</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>FürMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>FürMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Diethyldithiocarbamat (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyanamid</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Schale 35 mm, hoch</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Boden aus optisch klarem Kunststoff</td></tr><tr><td>MatTek Schale 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Boden aus einem Glasdeckglas</td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Weiß 96 Well Platte</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

erfassen, visualisieren und quantifizierung der generierung von reaktiven sauerstoffspezies in einem modellsystem amoeba

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von reaktiven und kurzlebigen, sauerstoffhaltigen Moleküle, die dynamisch ineinander oder entweder katalytisch oder spontan eliminiert. Aufgrund der kurzen Lebensdauer der meisten ROS und der Vielfalt ihrer Quellen und subzellulärer Lokalisierungen kann ein vollständiges Bild nur durch sorgfältige Messungen mit einer Kombination von Protokollen erhalten werden. Hier präsentieren wir eine Reihe von drei verschiedenen Protokolle mit OxyBurst Green (OBG)-beschichteten Perlen oder Dihydroethidium (DHE) und Amplex UltraRed (AUR), qualitativ und quantitativ zu überwachen verschiedenen ROS in professionellen Phagozyten wie Dictyostelium. Wir optimierten die Perlen Beschichtungsverfahren und gebrauchten OBG-beschichteten Perlen und Live-Mikroskopie intraphagosomal ROS Generation auf Einzelzellebene dynamisch visualisieren. Wir identifizierten Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli als potenter Stimulator für ROS Generation in Dictyostelium. Darüber hinaus haben wir dntwickelt Echtzeit, Mitteldurchsatz-Assays mit DHE und AUR zur ​​quantitativen Messung der intrazellulären Superoxid-und extrazellulären H 2 O 2-Produktion auf.

Die Erzeugung von ROS in Phagosomen qualitativ und dynamisch durch Mikroskopie (File S1) visualisiert werden. Die rote Fluoreszenz von Alexa Fluor 594 emittiert ist pH-unempfindlich und bleibt in der Umgebung phagosomalen konstant, während die Oxidation von OBG erhöht die Fluoreszenz im grünen Kanal. Die Emissionsspektren von in vitro oxidiert und oxidierte OBG-beschichteten Kügelchen sind in Fig. 1B verglichen wird, zeigt eine deutliche Erhöhung der Intensität nach der Oxidati...

Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine einfache und vielseitige Lösung zur Überwachung verschiedener reaktiver Sauerstoffspezies oder ROS sowie deren Lokalisation bereitzustellen und weitere Einblicke in ROS-bezogene zelluläre Mechanismen zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem drei verschiedene Assays durchgeführt werden, wobei der erste RST Green oder OB G beschichtete Kügelchen und Live-Mikroskopie nutzt, und Fluorescein sowie Alexa Fluor 594 kovalent über BSA an die Oberfläche von drei Mikrometer großen Sica-Kügelchen gebunden werden.Die Fluoreszenzemission von OBG-Fluorescein zeigt die Oxidation durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) an, während das Signal von Alexa Fluor 594 die Lokalisierung der Partikel ermöglicht und als Kontrolle für die Fluoreszenzquantifizierung dient. Die zweite Methode nutzt die Superoxid-empfindliche Sonde Dihydroethidium oder DHE in einem plattenbasierten Assay. Als Ergebnis der Oxidation durch Superoxid kann Ethidium in nukleäre und mitochondriale DNA interkalieren und weist verschobene Anregungs- und Emissionsmaxima bei 522 Nanometern bzw. 605 Nanometern auf.Die Fluoreszenzintensität von AUM entspricht der Menge an erzeugtem Superoxid und ermöglicht so die quantitative Messung der intrazellulären Superoxidbildung in den Zellen. Die dritte Methode ist ebenfalls ein auf einem Plattenlesegerät basierender Test. Die auf Wasserstoffperoxid empfindliche Sonde Plex Ultra Red oder aUR wird zur quantitativen Bestimmung der extrazellulären Wasserstoffperoxidproduktion verwendet.Die fluoreszierende Intensität eines UR-OX entspricht der Menge an außerhalb der Zellen produzierten Wasserstoffperoxids. Es werden Ergebnisse erzielt, die die Lokalisation dynamischer ROS-Produktion basierend auf dem O-B-G-D-H-E und UR-Assays zeigen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen bestehenden Verfahren wie plattenbasierten OB-GSAs besteht darin, dass sie die Al-Roth-Produktion auf Einzelzellniveau dynamisch visualisiert. Statt ein gespiegeltes und gemitteltes Roth-Signal aus einer Zellpopulation zu erhalten. Solche Methoden der Populationsmittelung neigen dazu, wichtige Informationen aufgrund asynchroner Phagozytose zu verschleiern. Um mit der Prozedur zur Markierung von Kügelchen mit Oxy, Burt Green oder OBG zu beginnen, geben Sie ein Milliliter einer Suspension von 3,0-Mikrometer-Carboxyl-Silikakügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie das Gefäß kurz und entfernen Sie anschließend den Überstand. Geben Sie ein Milliliter PBS hinzu und wirbeln Sie es auf diese Weise um. Waschen Sie die Perlen dreimal mit PBS. Nach der dritten Wäsche das Überstand entfernen und die Kügelchen resuspendieren. In einem Milliliter PBS, das 25 Milligramm pro Milliliter Cyanid enthält, muss die Cyanidlösung vor jedem Gebrauch frisch hergestellt werden; 15 Minuten lang auf einem Rotationsgerät inkubieren. Dadurch werden die carboxylierten Silica-Kügelchen aktiviert, um nach der Inkubation von 15 Minuten vormarkiertes BSA kovalent zu binden. Anschließend das Gefäß zentrifugieren und den Überstand entfernen.Ein Milliliter Kopplungspuffer hinzufügen und die Perlen dreimal durch kurzes Zentrifugieren und Vortexen mit Kopplungspuffer waschen, um überschüssiges Cyanid zu entfernen. Die gewaschenen Perlen mit 500 Mikroliter Kopplungspuffer versetzen, der ein Milligramm OBGH zwei H-F-F-B-S-A enthält, und das Gefäß anschließend mit Stickstoffgas aus einer Standard-Gasflasche füllen. Nach dem Verschließen des Gefäßes 14 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einer Rollvorrichtung inkubieren. Am folgenden Tag nicht umgesetztes OBG abspalten, indem die Perlen zweimal mit je einem Milliliter Puffer zum Abblocken durch kurzes Zentrifugieren und Vortexen gewaschen werden; danach zweimal mit Kopplungspuffer waschen, um den Abblockpuffer zu entfernen. Nach dem Absaugen des Überstandes ein Milliliter Kopplungspuffer mit 50 Mikrogramm LOR 594 in einem mittleren Ester hinzufügen, um mit BSA zu konjugieren.Füllen Sie das Gefäß mit Stickstoffkappe und inkubieren Sie es 1,5 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Rotator. Am Ende der 1,5-stündigen Inkubation beenden Sie die Reaktion, indem Sie die Kügelchen dreimal mit je einem Milliliter Puffer zum Abbrechen der Reaktion waschen. Anschließend waschen Sie die Kügelchen dreimal mit je einem Milliliter PBS. Schließlich, Ray, suspendieren Sie die Perlen in einem Milliliter PBS mit zwei Mikrolitern 10 %iger (Gewicht pro Volumen) Azid-Lösung zur Langzeitlagerung. Bestimmen Sie die Konzentration der Perlen in der Suspension mit einem Hämozytometer; sie beträgt typischerweise ein bis zwei mal 10 hoch 9 Perlen pro Milliliter.Füllen Sie das Gefäß mit einer Stickstoffkappe und lagern Sie es bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie exponentiell wachsende Alium-Zellen von einer 10 cm großen Petrischale gewinnen. Säen Sie unterschiedliche Zelldichten auf 3 cm großen Schalen mit einem optisch klaren Kunststoff- oder Glasboden aus und kultivieren Sie sie über Nacht, am folgenden Morgen.Wählen Sie die Schalen aus, die für das Experiment etwa zu 80 % konfluent sind. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch Low-Flow- oder LF-Medium und inkubieren Sie zwei Stunden vor dem Experiment, um die extrazelluläre und intraendosomale Autofluoreszenz des HL-five-C-Kulturmediums zu verringern. Schmelzen Sie 10 Milliliter 1,5 % BDO-Agar in LF-Medium und gießen Sie den Agar auf eine flache Oberfläche, um eine etwa einen Millimeter dicke Agarschicht zu bilden.Warten Sie 10 bis 15 Minuten, bis das Agar erstarrt ist. Schneiden Sie die Agarschicht in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate und legen Sie sie für die spätere Verwendung in LF-Medium. Reparieren Sie das Weitfeldmikroskop.Stellen Sie die Temperatur der Umweltkammer auf 22 Grad Celsius ein und passen Sie die für das Experiment erforderlichen Einstellungen an. Nach zweistündiger Inkubation saugen Sie das LF-Medium von der Dreizentimeter-Schale ab, lassen jedoch die Zellmonolage mit einem dünnen Mediumfilm bedeckt. Verdünnen Sie die zuvor hergestellten OBG-beschichteten Perlen auf 1,5 × 10⁷ Perlen pro Milliliter und geben Sie 10 Mikroliter auf die Zellschicht.Nehmen Sie ein rechteckiges Agar-Blatt und lassen Sie überschüssige Flüssigkeit ab, behalten Sie das Agar jedoch feucht. Legen Sie das Agar-Quadrat vorsichtig auf die Zellschicht. Die Agar-Überlagerung erhöht den Kontakt zwischen Perlen und Zellen und verbessert dadurch die Aufnahme.Es komprimiert die Zellen außerdem leicht und hält sie so besser in der Fokusebene des Objektivs. Legen Sie den Deckel auf die Petrischale, um den Erfolg des Experiments sicherzustellen. Bewegen Sie die AGA-Abdeckung nicht, wenn sie die Zellen bedeckt, und beginnen Sie zudem unmittelbar mit dem Abbildungsschritt.Als Nächstes stellen Sie die Petrischale auf den Mikroskopständer und nehmen automatisch alle Minute über einen Zeitraum von zwei Stunden oder länger Bilder in den roten, grünen und Phasenkanälen auf. Um die ROS-Produktion zu messen, wählen Sie zelluläre Ereignisse aus, die den gesamten Phagozytosevorgang umfassen, und fokussieren Sie darauf. Mit professioneller Bildverarbeitungssoftware kombinieren Sie die optimierten drei Kanäle und fügen die Bilder zu einem Film zusammen.Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensitäten der ausgewählten Kügelchen in den roten und grünen Kanälen. Das Verhältnis von rot zu grün spiegelt die dynamische FOMO R os-Produktion der Zellen wider. Um die intrazelluläre Superoxidproduktion zu messen, sammeln Sie zunächst eine 180 % konfluente Petrischale mit Alium in 10 Milliliter HL-5C-Medium, zentrifugieren die Alium-Zellen bei 850 ×g für fünf Minuten und aspirieren das Medium vorsichtig und vollständig. Resuspendieren Sie die Zellen in SS-6,4-Puffer, zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie auf eine Enddichte von 6 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Fügen Sie 50 µL Zellsuspension in jedes Brunnen einer weißen, undurchsichtigen 96-Loch-Platte hinzu, und verdünnen Sie die Dihydroethidium- oder DHE-Stammlösung 500-fach mit SS 6,4-Puffer. Anschließend geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 µL der verdünnten DHE-Lösung in jedes Brunnen der 96-Loch-Platte. Die endgültige Konzentration von DHE beträgt 30 µmol/L.Die Reaktion beginnt unmittelbar. Stimulanzien oder Inhibitoren können zu diesem Zeitpunkt oder zu anderen Zeitpunkten je nach spezifischen Anforderungen hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Zellen unter mittlerem Schütteln bei 22 Grad Celsius.Lesen Sie alle zwei Minuten über einen Zeitraum von einer Stunde die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader ab. Verwenden Sie den Endpunkt-Top-Reading-Modus mit einer Fluoreszenzanregung bei 522 Nanometern und Emission bei 605 Nanometern. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine 96-Well-Platte mit Dium-Zellen wie im vorherigen Abschnitt gezeigt vorbereiten.Stellen Sie verdünnte Meerrettichperoxidase oder HRP her, indem Sie fünf Mikroliter HRP-Stammlösung zu 10 Millilitern SS-6,4-Puffer hinzufügen. Den Probengefäß umdrehen, um gut zu mischen, und auf Eis lagern. Die verdünnte HRP-Lösung hat eine Konzentration von 0,05 Einheiten pro Milliliter.Bereiten Sie die Plex-Ultra-Rot- oder eine UR-Reaktionsmischung vor, indem Sie die UR-Stammlösung und die verdünnte HRP-Lösung in SS-6,4-Puffer mischen, um Endkonzentrationen von 6,25 µM a UR und 0,005 Einheiten pro Milliliter HRP zu erreichen. Geben Sie 50 Mikroliter der UR-Mischung in jedes Loch.Die Reaktion beginnt unmittelbar. Stimuli oder Inhibitoren können zu diesem Zeitpunkt oder zu anderen Zeitpunkten je nach spezifischen Anforderungen hinzugefügt werden. Inkubieren Sie die Zellen unter leichtem Schütteln im Medium bei 22 Grad Celsius.Die Fluoreszenz alle zwei Minuten über einen Zeitraum von einer Stunde mit einem fluoreszenzbasierten Mikroplattenreader messen. Den Endpunkt-Top-Reading-Modus verwenden, mit einer Fluoreszenzanregung bei 530 Nanometern und Emission bei 590 Nanometern. Die Beschichtungseffizienz der OB g-Fluorescein wird getestet, indem Wasserstoffperoxid und HRP verwendet werden, um die beschichteten Perlen in vitro zu oxidieren, und das Emissionsspektrum bei einer Anregung von 500 Nanometern überprüft wird.Wie in diesem Diagramm gezeigt, weisen die oxidierten Perlen im Vergleich zu nicht oxidierten Perlen eine signifikante Emissionspeak bei 538 Nanometern mit einem Intensitätsverhältnis von mindestens 11 bis 12-fach auf. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Phagosomen von Dium-Zellen kann qualitativ und dynamisch mittels Mikroskopie visualisiert werden, wie in diesem repräsentativen Zeitrafferfilm gezeigt, der über 40 Minuten mit einer sechsfachen Vergrößerung während der ersten Minute nach der Aufnahme aufgezeichnet wurde. Durch Phagozytose änderte sich die Fluoreszenz der mit OBG-Fluorescein beschichteten Perlen von rot zu hellorange, was darauf hindeutet, dass ROS wahrscheinlich direkt innerhalb der Phagosomen gebildet wurden.Die intrazelluläre Superoxid- und die extrazelluläre Wasserstoffperoxiderzeugung werden quantitativ mittels der DHE- und der UR-Assays gemessen. Eine Übersicht über die biochemischen Reaktionen, die mit diesen beiden Assays verknüpft sind, ist dargestellt. Im DHE-Assay wird Superoxid durch Superoxiddismutase (SOD) in Wasserstoffperoxid umgewandelt, und Wasserstoffperoxid wird durch Katalase in Wasser und Sauerstoff umgewandelt.Ein Mikroplattenreader wird für die quantitativen Messungen mittlerer Durchsatzleistung von intrazellulärem Superoxid verwendet. Ein repräsentatives Experiment zeigt, dass die dynamische Superoxidproduktion in AX2-Zellen nach Stimulation mit LPSA-Lipopolysaccharid aus E. coli signifikant höher ist als das Grundniveau in nicht stimulierten AX2-Zellen und die Hintergrundreaktion im Puffer. Der Rückgang der blauen Fluoreszenz und der Anstieg der roten Fluoreszenz sind umgekehrt korreliert. Wie erwartet.Die Lokalisation der durch den DHE-Assay gemessenen ROS-Produktion wird durch die folgenden Ergebnisse bestätigt. Die zusätzliche Zugabe des membranpermeablen Superoxiddismutase-Inhibitors D-E-D-T-C-A erhöhte das DHE-Signal dosisabhängig, was darauf hinweist, dass D-E-D-T-C-A die Anreicherung des Substrats der Superoxiddismutase verursachte. Im Gegensatz dazu hatte die Zugabe eines membranimpermeablen Wasserstoffperoxid-Quenchers keinen Einfluss auf die Superoxid-Produktion im A-UR-Assay.Ein Mikroplattenreader wird für die quantitativen Messungen mit mittlerer Durchsatzleistung der extrazellulären Wasserstoffperoxid-Produktion verwendet. Ein repräsentatives Experiment zeigt, dass die dynamische Wasserstoffperoxid-Produktion aus AX-zwei-Zellen nach Stimulation mit LPS signifikant höher ist als das Grundniveau aus nicht stimulierten AX-zwei-Zellen und die Hintergrundreaktion. Bei Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von D-E-D-T-C oder Katalase nimmt das A-UR-Signal dosisabhängig ab, was auf die Hemmung der Wasserstoffperoxid-Produktion aus intrazellulärem Superoxid bzw. auf den Abbau von extrazellulärem Wasserstoffperoxid zurückzuführen ist. Die Behandlungen mit D-E-D-T-C und Katalase bestätigten eindeutig, dass die DHE- und A-UR-Assays unterschiedliche Typen und subzelluläre Lokalisationen von ROS Indicum messen. Dieser Vorgehensweise folgend.Andere Methoden, wie beispielsweise das Spiegeln der Ross-Generierung während einer Infektion mit pathogenen oder nichtpathogenen Bakterien, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie Dictal-Hengste auf unterschiedliche bakterielle Infektionen hinsichtlich der Verlustgenerierung reagieren. Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Bakterien wie Microbacteria marum äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie entsprechende BSL-2-Maßnahmen stets beachtet werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

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