Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen
5. September 2013
Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.
Dieses Fluoreszenzmikroskopie-Experiment bewertet die Lebensfähigkeit einzelner Bakterien, die mit Wirtszellen assoziiert sind, und bestimmt die Lebensfähigkeit von Bakterien an verschiedenen subzellulären Stellen. Um externe Bakterien zu identifizieren, setzen Sie zunächst die infizierten Zellen einem Fluoreszenzreagenz aus, das spezifisch für die Bakterienpermease, den infizierten Wirt, in Gegenwart von Fluoreszenzfarbstoffen ist, die lebensfähige von nicht lebensfähigen Bakterien auf der Grundlage der bakteriellen Membranintegrität unterscheiden. Um dann anzuzeigen, wo sich Bakterien in den Wirtszellen befinden, inkubieren Sie die infizierten Zellen mit einem fluoreszierend gekoppelten Antikörper gegen einen Marker von Interesse.
Die resultierenden Immunfluoreszenzbilder können den prozentualen Anteil lebensfähiger Bakterien innerhalb und außerhalb der Wirtszellen sowie die subzelluläre Lokalisation von lebensfähigen und nicht lebensfähigen intrazellulären Bakterien bestimmen. Im Gegensatz zu Koloniezahl-Assays, Gentamycin-Schutz-Assays und Elektronenmikroskopie ermöglicht diese Methode eine direkte Beurteilung der Lebensfähigkeit einzelner Bakterien. Es kann auch Aufschluss darüber geben, ob Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Unterschiede in ihrer Lebensfähigkeit aufweisen.
Brittany Johnson, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren, um Zellen auf kreisförmigen Glasdeckgläsern in 24 zu kultivieren, Well-Platten fügen Bakterien von Interesse hinzu und inkubieren für die gewünschte Zeit. Spülen Sie die infizierten Zellen einmal vorsichtig aus. Fügen Sie dann Alexa Fluor 6 4 7 gekoppelten Antikörper oder ein bakterienspezifisches Lektin hinzu, um externe Bakterien zu erkennen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Nach zwei Spülgängen aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 0,5 Milliliter lebende, tote Färbelösung hinzu, die Cytoneun und Propidiumjod enthält. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln und spülen Sie sie dann zweimal mit Magnesiumchlorid aus. Drehen Sie die Deckfolien mit der Vorderseite nach unten auf Glasobjektträger um.
Mit klarem Nagellack versiegeln. Erfassen Sie die Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätzen, die im Textprotokoll beschrieben sind, um die Bakterien zu markieren. 10 Mikrogramm pro Milliliter DPI in mors definiertem Medium zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Infizieren Sie nun die anhaftenden Zellen mit DPI-markierten Bakterien. Fixieren Sie die Zellen nicht mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. Spülen Sie die Zellen einmal aus.
Dann Alexa Fluor 6, 4, 7 gekoppelter Antikörper oder Lektin hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei Spülungen mit Mopppuffer fügen Sie einen Alexa Fluor 5 5,5 gekoppelten Antikörper gegen den subzellulären Marker von Interesse hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang. Nach zwei Spülungen mit Mopppuffer waschen Sie die Zellen einmal mit Mopps Magnesiumchlorid. Dann aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 0,4 mikromolare Cyt Green hinzu, inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, rin Sie die Zellen zweimal in Mopps, Magnesiumchlorid.
Dann die Zellen waschen. Noch einmal Magnesiumchlorid für fünf Minuten einwischen. Drehen Sie die Deckgläser mit der Vorderseite nach unten auf die Objektträger, versiegeln Sie sie mit klarem Nagellack und nehmen Sie innerhalb von 30 Minuten Bilder der Objektträger am Fluoreszenzmikroskop auf.
In diesem Experiment wurden menschliche Neutrophile mit Gonorrhoe infiziert. Das Alexa Fluor 6 4 7 gekoppelte Sojabohnenlektin weist extrazelluläre Gonorrhoe nach. Dann starb die grün fluoreszierende Viabilität ab, und das rot fluoreszierende Propidiumiodid wurde in Gegenwart von Saponin hinzugefügt, das Cholesterin sequestriert, um bevorzugt die Plasmamembranen der Wirtszelle zu permieren, aber die Gonorrhoemembran in infizierten Zellen nicht durchdringt, der eukaryotische Zellkern färbt sich sowohl mit Cytoneun als auch mit Propidiumiodid.
Diese Bilder von Gonorrhoe-infizierten Neutrophilen wurden mit den Viabilitätsfarbstoffen cyt talk screen und dpi erstellt. Der Farbstoff Propidiumiodid wurde nicht verwendet, da er am Fluoreszenzmikroskop sowohl im roten als auch im ultravioletten Kanal fluoresziert. Alle Gonorrhoe färben sich mit dpi, aber nur Bakterien mit geschädigten Membranen färben sich mit Ochsengrün.
Das nicht lebensfähige intrazelluläre Bakterium hat einen Ring aus Färbung für CD 63, der das Bakterium umgibt. Dieser Ring zeigt an, dass Primärgranulate an diesem Phagosom angereichert sind. Dem lebensfähigen intrazellulären Bakterium fehlt eine Färbung für CD 63, was darauf hindeutet, dass die primären Granula an seinem Phagosom nicht angereichert sind. Genommen.
Zusammengenommen zeigen die Daten eine Korrelation zwischen der Lebensfähigkeit von Gonorrhoe und Bewohnern in einem primären granulnegativen Phagosom. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Lebensfähigkeit von Bakterien in Wirtszellen bewerten können. Darüber hinaus können Sie die Lebensfähigkeit von Bakterien bestimmen, die in verschiedenen Kompartimenten in Wirtszellen lokalisiert sind, indem Sie Antikörper verwenden, die gegen diese subzellulären Kompartimente gerichtet sind.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt Protokolle zur Beurteilung der Lebensfähigkeit einzelner Bakterien, die mit Wirtszellen assoziiert sind, mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Bestimmung der bakteriellen Lebensfähigkeit an verschiedenen subzellulären Standorten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Bakterielle Pathogenese
- Fluoreszenzmikroskopie
- Zelluläre Interaktionen
Hintergrund
- Das Verständnis des bakteriellen Überlebens in Wirtszellen ist entscheidend für die Untersuchung von Infektionen.
- Fluoreszierende Farbstoffe können zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Bakterien unterscheiden.
- Traditionelle Methoden liefern möglicherweise keine direkten Einschätzungen der individuellen bakteriellen Lebensfähigkeit.
- Diese Studie zielt darauf ab, das Verständnis des bakteriellen Verhaltens innerhalb von Wirtszellen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Beurteilung der bakteriellen Lebensfähigkeit in Wirtszellen.
- Erforschung der Lokalisierung von lebensfähigen versus nicht lebensfähigen Bakterien.
- Bereitstellung einer genaueren Alternative zu bestehenden Methoden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit.
Verwendete Methoden
- Exposition infizierter Zellen gegenüber fluoreszierenden Reagenzien, die spezifisch für bakterielle Permease sind.
- Verwendung fluoreszierender Farbstoffe zur Unterscheidung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Bakterien.
- Inkubation mit fluoreszent gekoppelten Antikörpern zur Identifizierung bakterieller Standorte.
- Analyse immunfluoreszenter Bilder zur Bestimmung der bakteriellen Lebensfähigkeit.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht eine direkte Beurteilung der individuellen bakteriellen Lebensfähigkeit.
- Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in der Lebensfähigkeit basierend auf der subzellulären Lokalisation.
- Die Immunfluoreszenz-Bildgebung bietet eine klare Visualisierung der Bakterien.
- Dieser Ansatz übertrifft traditionelle Methoden bei der Beurteilung der bakteriellen Lebensfähigkeit.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist effektiv für die Untersuchung der bakteriellen Lebensfähigkeit in Wirtszellen.
- Fluoreszenzmikroskopie kann wichtige Einblicke in die bakterielle Pathogenese liefern.
- Diese Studie verbessert das Verständnis mikrobielle Überlebensstrategien.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
