Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Dieses Experiment mittels Fluoreszenzmikroskopie bewertet die Vitalität einzelner Bakterien, die mit Wirtszellen assoziiert sind, und bestimmt die Bakterienvitalität in verschiedenen subzellulären Lokalisationen. Zunächst, um externe Bakterien zu identifizieren, werden die infizierten Zellen einem fluoreszierenden Reagenz ausgesetzt, das spezifisch für die Bakterienpermease ist, wobei der infizierte Wirt in Gegenwart fluoreszierender Farbstoffe gehalten wird, die aufgrund der Integrität der bakteriellen Membran zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Bakterien unterscheiden. Anschließend, um anzugeben, wo sich die Bakterien innerhalb der Wirtszellen befinden, werden die infizierten Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen einen Marker der Untersuchungsinteresse inkubiert.

Die resultierenden immunfluoreszenten Bilder ermöglichen die Bestimmung des Prozentsatzes an lebensfähigen Bakterien innerhalb und außerhalb von Wirtszellen sowie die subzelluläre Lokalisation von lebensfähigen im Vergleich zu nicht lebensfähigen intrazellulären Bakterien. Im Gegensatz zu Koloniezählassays, Gentamycin-Schutzassays und der Elektronenmikroskopie erlaubt diese Methode eine direkte Beurteilung der Lebensfähigkeit einzelner Bakterien. Außerdem kann sie Aufschluss darüber geben, ob Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Unterschiede in ihrer Lebensfähigkeit aufweisen.

Brittany Johnson, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Geben Sie Bakterien der gewünschten Art zu Zellen, die auf runden Glasdeckeln in 24-Loch-Platten kultiviert werden, und inkubieren Sie für die gewünschte Zeit. Spülen Sie die infizierten Zellen einmal vorsichtig. Anschließend fügen Sie einen mit Alexa Fluor 647 gekoppelten Antikörper oder ein bakterienspezifisches Lektin hinzu, um externe Bakterien nachzuweisen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Nach zwei Spülgängen das Medium abpipettieren und 0,5 Milliliter einer Live-Dead-Färbelösung, die Cyto Nine und Propidiumiodid enthält, hinzufügen. Die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, dann zweimal mit MOPS-Magnesiumchlorid spülen. Die Deckgläser umdrehen und mit der Zellseite nach unten auf Objektträger aufsetzen.

Versiegeln Sie mit klarem Nagellack. Nehmen Sie die Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das über die im textbasierten Protokoll beschriebenen Filteranlagen verfügt, um die Bakterien zu markieren. Geben Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter DPI in das definierte Mors-Medium hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Infizieren Sie nun die anhaftenden Zellen mit DPI-markierten Bakterien. Fixieren Sie die Zellen nicht mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. Spülen Sie die Zellen einmal ab.

Danach Alexa Fluor 647-markiertes Antikörper oder Lektin hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei Waschungen mit MOPS-Puffer, ein Alexa Fluor 555-markiertes Antikörper gegen den gewünschten subzellulären Marker hinzufügen und 20 Minuten inkubieren. Nach zwei erneuten Waschungen mit MOPS-Puffer, die Zellen einmal mit MOPS-Magnesiumchlorid waschen. Dann das Medium absaugen und 0,4 Mikromolar Cyt Green zugeben, anschließend die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, danach die Zellen zweimal mit MOPS-Magnesiumchlorid spülen.

Waschen Sie die Zellen anschließend erneut für fünf Minuten in MOPS-Magnesiumchlorid. Legen Sie die Deckgläser umgekehrt mit der Zellseite nach unten auf Objektträger und verschließen Sie sie mit klarem Nagellack. Nehmen Sie innerhalb von 30 Minuten Bilder der Präparate am Fluoreszenzmikroskop auf.

In diesem Experiment wurden humane Neutrophile mit Gonorrhoe infiziert. Das mit Alexa Fluor 647 gekoppelte Sojabohnen-Lektin markiert die extrazelluläre Gonorrhoe. Anschließend wurden die grün fluoreszierende Vitalfarbe und das rot fluoreszierende Propidiumiodid in Gegenwart von Saponin hinzugefügt, das Cholesterin bindet und dadurch vorzugsweise die Plasmamembranen der Wirtszellen permeabilisiert, jedoch nicht die Membran der Gonokokken in infizierten Zellen durchdringt. Der eukaryotische Zellkern färbt sich dabei sowohl mit dem Cyto-Nin als auch mit Propidiumiodid an.

Diese Bilder von Gonorrhoe-infizierten Neutrophilen wurden mithilfe der Vitalitätsfarbstoffe Cyt Talk Screen und DPI erzeugt. Der Propidiumiodid-Farbstoff wurde nicht verwendet, da er sowohl im roten als auch im ultravioletten Kanal des Fluoreszenzmikroskops fluoresziert. Alle Gonokokken färben mit DPI, aber nur Bakterien mit geschädigten Membranen färben mit Ox Green.

Die nichtlebensfähigen intrazellulären Bakterien weisen einen ringförmigen Nachweis für CD 63 auf, der die Bakterien umgibt. Dieser Ring weist darauf hin, dass primäre Granula an diesem Phagosom angereichert sind. Das lebensfähige intrazelluläre Bakterium zeigt keinen Nachweis für CD 63, was darauf hindeutet, dass keine Anreicherung primärer Granula an seinem Phagosom erfolgt. Aufgenommen.

Insgesamt zeigen die Daten eine Korrelation zwischen der Lebensfähigkeit von Gonokokken und deren Aufenthalt in einem primären, granulären negativen Phagosom. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man die Lebensfähigkeit von Bakterien in Wirtszellen beurteilt. Außerdem werden Sie in der Lage sein, die Lebensfähigkeit von Bakterien, die in verschiedenen Kompartimenten der Wirtszellen lokalisiert sind, mithilfe von Antikörpern, die gegen diese subzellulären Kompartimente gerichtet sind, zu bestimmen.