Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Dieses Fluoreszenzmikroskopie-Experiment bewertet die Lebensfähigkeit einzelner Bakterien, die mit Wirtszellen assoziiert sind, und bestimmt die Lebensfähigkeit von Bakterien an verschiedenen subzellulären Stellen. Um externe Bakterien zu identifizieren, setzen Sie zunächst die infizierten Zellen einem Fluoreszenzreagenz aus, das spezifisch für die Bakterienpermease, den infizierten Wirt, in Gegenwart von Fluoreszenzfarbstoffen ist, die lebensfähige von nicht lebensfähigen Bakterien auf der Grundlage der bakteriellen Membranintegrität unterscheiden. Um dann anzuzeigen, wo sich Bakterien in den Wirtszellen befinden, inkubieren Sie die infizierten Zellen mit einem fluoreszierend gekoppelten Antikörper gegen einen Marker von Interesse.

Die resultierenden Immunfluoreszenzbilder können den prozentualen Anteil lebensfähiger Bakterien innerhalb und außerhalb der Wirtszellen sowie die subzelluläre Lokalisation von lebensfähigen und nicht lebensfähigen intrazellulären Bakterien bestimmen. Im Gegensatz zu Koloniezahl-Assays, Gentamycin-Schutz-Assays und Elektronenmikroskopie ermöglicht diese Methode eine direkte Beurteilung der Lebensfähigkeit einzelner Bakterien. Es kann auch Aufschluss darüber geben, ob Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Unterschiede in ihrer Lebensfähigkeit aufweisen.

Brittany Johnson, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren, um Zellen auf kreisförmigen Glasdeckgläsern in 24 zu kultivieren, Well-Platten fügen Bakterien von Interesse hinzu und inkubieren für die gewünschte Zeit. Spülen Sie die infizierten Zellen einmal vorsichtig aus. Fügen Sie dann Alexa Fluor 6 4 7 gekoppelten Antikörper oder ein bakterienspezifisches Lektin hinzu, um externe Bakterien zu erkennen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur.

Nach zwei Spülgängen aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 0,5 Milliliter lebende, tote Färbelösung hinzu, die Cytoneun und Propidiumjod enthält. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln und spülen Sie sie dann zweimal mit Magnesiumchlorid aus. Drehen Sie die Deckfolien mit der Vorderseite nach unten auf Glasobjektträger um.

Mit klarem Nagellack versiegeln. Erfassen Sie die Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätzen, die im Textprotokoll beschrieben sind, um die Bakterien zu markieren. 10 Mikrogramm pro Milliliter DPI in mors definiertem Medium zugeben und 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Infizieren Sie nun die anhaftenden Zellen mit DPI-markierten Bakterien. Fixieren Sie die Zellen nicht mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. Spülen Sie die Zellen einmal aus.

Dann Alexa Fluor 6, 4, 7 gekoppelter Antikörper oder Lektin hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei Spülungen mit Mopppuffer fügen Sie einen Alexa Fluor 5 5,5 gekoppelten Antikörper gegen den subzellulären Marker von Interesse hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang. Nach zwei Spülungen mit Mopppuffer waschen Sie die Zellen einmal mit Mopps Magnesiumchlorid. Dann aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 0,4 mikromolare Cyt Green hinzu, inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, rin Sie die Zellen zweimal in Mopps, Magnesiumchlorid.

Dann die Zellen waschen. Noch einmal Magnesiumchlorid für fünf Minuten einwischen. Drehen Sie die Deckgläser mit der Vorderseite nach unten auf die Objektträger, versiegeln Sie sie mit klarem Nagellack und nehmen Sie innerhalb von 30 Minuten Bilder der Objektträger am Fluoreszenzmikroskop auf.

In diesem Experiment wurden menschliche Neutrophile mit Gonorrhoe infiziert. Das Alexa Fluor 6 4 7 gekoppelte Sojabohnenlektin weist extrazelluläre Gonorrhoe nach. Dann starb die grün fluoreszierende Viabilität ab, und das rot fluoreszierende Propidiumiodid wurde in Gegenwart von Saponin hinzugefügt, das Cholesterin sequestriert, um bevorzugt die Plasmamembranen der Wirtszelle zu permieren, aber die Gonorrhoemembran in infizierten Zellen nicht durchdringt, der eukaryotische Zellkern färbt sich sowohl mit Cytoneun als auch mit Propidiumiodid.

Diese Bilder von Gonorrhoe-infizierten Neutrophilen wurden mit den Viabilitätsfarbstoffen cyt talk screen und dpi erstellt. Der Farbstoff Propidiumiodid wurde nicht verwendet, da er am Fluoreszenzmikroskop sowohl im roten als auch im ultravioletten Kanal fluoresziert. Alle Gonorrhoe färben sich mit dpi, aber nur Bakterien mit geschädigten Membranen färben sich mit Ochsengrün.

Das nicht lebensfähige intrazelluläre Bakterium hat einen Ring aus Färbung für CD 63, der das Bakterium umgibt. Dieser Ring zeigt an, dass Primärgranulate an diesem Phagosom angereichert sind. Dem lebensfähigen intrazellulären Bakterium fehlt eine Färbung für CD 63, was darauf hindeutet, dass die primären Granula an seinem Phagosom nicht angereichert sind. Genommen.

Zusammengenommen zeigen die Daten eine Korrelation zwischen der Lebensfähigkeit von Gonorrhoe und Bewohnern in einem primären granulnegativen Phagosom. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Lebensfähigkeit von Bakterien in Wirtszellen bewerten können. Darüber hinaus können Sie die Lebensfähigkeit von Bakterien bestimmen, die in verschiedenen Kompartimenten in Wirtszellen lokalisiert sind, indem Sie Antikörper verwenden, die gegen diese subzellulären Kompartimente gerichtet sind.