Name: Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Lernen Sie Fluoreszenz-Mikroskopie zur Bestimmung der Bakterienlebensfähigkeit in Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung lebender und toter Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten.

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Wir danken Asya Smirnov und Laura Gonyar für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse NIH R00 und R01 TW008042 AI097312 zu AKCMBJ wurde zum Teil durch NIH T32 AI007046 getragen wird.

1. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit Propidiumiodid und SYTO9 <ol><li> Infect adhärenten Zellen, die bis 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckgläsern in 24-Well-Platten mit Bakterien von Interesse sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. </li><li> Spülen Zellen einmal vorsichtig in 0,1 M 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,2, enthaltend 1 mM MgCl 2 (MOPS / MgCl 2). </li><li> Zellen, Inkubation für 10 min im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. </li></ol> HINWEIS: Verhaltens steuert mit lebenden und toten Bakterien, in der Abwesenheit von Wirtszellen, um zu zeigen, dass das Lektin oder Antikörper von Interesse bindet alle Bakterien unabhängig von der Rentabilität (Abbildung 1). <ol start="4"><li> Spülen Zellen zweimal mit MOPS / MgCl 2. </li><li> Saugen medien aus Zellen und 0,5 ml Live / Dead-Färbung Lösung. Live / Dead-Färbung Solution ist 5 uM SYTO9, 30 uM Propidiumiodid und 0,1% Saponin (Endkonzentrationen) in MOPS / MgCl 2. </li><li> Zellen, Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Invert Deckseite nach unten auf Glasobjektträger und Dichtung mit klarem Nagellack. Verwenden Sie keine Montage Medien. </li><li> Erwerben Sie Bilder innerhalb von 30 min, mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätze mit grünen, roten und dunkelroten Bildaufnahme kompatibel. </li></ol> HINWEIS: In der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie verwendet werden. Nach 30 min die Fluoreszenzfarbstoffe beginnen, von den Bakterien austreten und die erfassten Daten nicht mehr genau. Bilder in diesem Artikel gezeigt wurden auf einem Nikon Eclipse-E800 aufrecht Fluoreszenzmikroskop mit Hamamatsu Orca-ER Digitalkamera mit Openlab Software erworben. 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 - - Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlängen von 590 735 nm detektiert, und Falschfarben blau. 580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm Fluoreszenz von Propidiumjodid wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTO9 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. <ol start="10"><li> Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien blau + rot erscheinen führen, nicht lebensfähigen Bakterien interne erscheinen nur rot, erscheinen externen lebensfähigen Bakterien blau + grün, und die interne lebensfähigen Bakterien erscheinen nur grün. Graf von Augen die Zahl der Bakterien, die nicht lebensfähig externe, interne nicht lebensfähig, lebensfähige externe und interne lebensfähig sind. </li><li> Die prozentuale externer lebensfähigen Bakterien, indem die Anzahl von externen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der externen Bakterien (lebensfähigen und nonviLage). Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien von internen Teilen der Anzahl der internen lebensfähigen Bakterien durch die Gesamtzahl der inneren Bakterien (lebensfähigen und nicht lebensfähigen) (Abb. 4). </li><li> Es gibt zwei wesentliche Steuerelemente mit diesem Protokoll durchzuführen. Zuerst überprüfen, dass alle nicht lebensfähigen Bakterien sind Propidiumiodid-positiven und alle lebenden Bakterien sind SYTO9-positiv. Ein mittleren logarithmischen Bakterienkultur (in Abwesenheit von irgendeinem Wirtszellen) zu&gt; 95% SYTO9-positiv sein. In Abbildung 2 ist ein mittel logarithmischen Kultur von N. gonorrhoeae (bei ​​10 8 koloniebildenden Einheiten pro ml) mit Live / Dead Färbelösung inkubiert. Zweitens bestätigen, dass sowohl Propidiumiodid und SYTO9 können permeabilisiert, infizierten Wirtszellen zu gelangen. <ol><li> Um eine Bevölkerung von toten Bakterien zu erzeugen, sammeln 2 x 10 8 Bakterien-Kolonien bildenden Einheiten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 70% Isopropanol und sitzen für 10 min. Pellet die Bakterien in einem Mikrofuge einnd waschen die Bakterien zweimal in PBS, um restliche Isopropanol entfernen. Dann folgen die Schritte Protokoll 1,5-1,7. Werden 5 ul Bakteriensuspension auf einen Objektträger und Overlay mit einem Deckglas. Bild Proben wie in Schritt-Protokoll 1.9. Unter diesen Bedingungen sollte 100% der Bevölkerung Propidiumiodid-positiven (Abbildung 2). In einigen Bakterienarten können Propidiumiodid nicht vollständig überwältigen SYTO9 Färbung, und nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen gelb oder orange. </li><li> Für phagozytischen Zellen wie Neutrophile, setzen die Zellen zu Isopropanol abgetötete Bakterien und sicherzustellen, dass 100% der intrazellulären Bakterien Propidiumiodid-positiven (Abbildung 3). Für nonphagocytic Zellen, die toten Bakterien nicht verinnerlichen kann, kann es ausreichen, infizierten Zellen mit Natriumazid oder anderen zell permeant antimikrobielle Mittel vor dem Hinzufügen von Live / Dead-Färbung Lösung zu behandeln. </li></ol></li></ol> 2. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien mit SYTOX Green und DAPI <ol><li> Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &amp;mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium 25 für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. </li><li> Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2. </li><li> Zellen für 10 min Inkubieren bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen. </li><li> Saugen Medien aus Zellen und 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2. </li><li> Zellen, Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min. </li><li&gt; Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop erhalten. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware. </li></ol> HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 590 detektiert - 650 nm und einem Emissionsfilter von 663 bis 735 nm, und falsch-rot gefärbt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt. <ol start="10"><li> Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + grün führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien interne, externe lebensfähigen Bakterien erscheinen rot + blau, und die interne lebensfähigen Bakterien blau erscheinen nur (Abbildung 4). Quantifizierung der Prozent der externen und internen Bakterien als in der Protokoll-ste beschrieben1.11 p. </li><li> Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden. </li></ol> 3. Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien Neben subzelluläre Lokalisierung <ol><li> Etikett Bakterien von Interesse mit 10 &amp;mgr; g / ml DAPI in Morse definiertem Medium für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Zellen infizieren, die haft bis 12 mm runde Glasdeckgläschen in 24-Well-Platten mit DAPI-markierten Bakterien sind. Beheben Sie NICHT die Zellen mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. </li><li> Zellen spülen einmal mit MOPS / MgCl 2. </li><li> Inkubieren 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln mit Alexa Fluor 647-gekoppelten Antikörper oder Lectin, der den Bakterienspezies von Interesse bindet, in MOPS / MgCl 2, externe Bakterien detektieren. Siehe Hinweis im Protokoll 1.3 für Schritt vorgeschlagen Kontrollen. </li><li> Saugen Medien aus Zellen und Zellen spülen zwei times in MOPS / MgCl 2. </li><li> Inkubieren Zellen mit Alexa Fluor 555-gekoppelten Antikörper gegen subzellulären Marker von Interesse für 20 min in MOPS / MgCl 2, enthaltend 0,2% Saponin. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min. </li><li> Saugen Medien aus Zellen und fügen 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl 2. </li><li> Inkubiere Zellen 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Spülen Zellen zwei Mal in MOPS / MgCl 2. </li><li> Waschen der Zellen einmal in MOPS / MgCl 2 für 5 min. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Folien innerhalb von 30 min auf Fluoreszenzmikroskop. Siehe Protokoll 1.9 für Schritt Beschreibung Mikroskop, Digitalkamera und Erfassungssoftware. </li></ol> HINWEIS: Die Fluoreszenz von Alexa Fluor 647 wurde mit einem Filter mit Anregungswellenlänge von 590 festgestellt - 650 nm und Emissionsfilter von 663 bis 735 nm und ist falsch-violett gefärbt. Fluoreszenz-f580 nm und einem Emissionsfilter von 600 - - 660 nm ROM Alexa Fluor 555 wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 540 festgestellt. 495 nm und einem Emissionsfilter von 515 - - 555 nm Fluoreszenz von SYTOX Grün wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 465 festgestellt. 375 nm-Sperrfilter von 400 nm - DAPI-Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Filters mit Anregungswellenlänge von 355 festgestellt. <ol start="14"><li> Grün + blau Dieses Protokoll wird in dem externe Bilder nicht lebensfähigen Bakterien lila + grün erscheinen führen, erscheinen nicht lebensfähigen Bakterien internen, lila + blau erscheinen externen lebensfähigen Bakterien scheinen interne lebensfähigen Bakterien nur blau und subzellulärer Protein scheint rot (Abbildung 4). Quantifizierung der perecent von externen und internen lebensfähigen Bakterien wie in Protokoll beschriebenen Schritte 1.11. </li><li> Die in Protokollschritt 1.12 Kontrollen sollten mit der DAPI / SYTOX Green-Farbstoff-Kombination (Abbildungen 2 und 3) durchgeführt werden. </li><li> InNeben den lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zählung Bakterien, klassifizieren jeweils Bakterien als positiv oder negativ für die Co-Lokalisation mit subzellulärer Marker von Interesse. </li><li> Berechnet den Prozentsatz der lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker durch Dividieren der Anzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl der lebensfähigen Bakterien kolokalisiert. Berechnet den Prozentsatz der nicht lebensfähigen Bakterien, die mit subzellulären Marker indem die Anzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert durch die Gesamtzahl lebensfähiger Bakterien kolokalisiert. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Präsentiert hier sind zwei Protokolle, die DNA-Bindung und Lebensfähigkeit Farbstoffe in Verbindung mit einem fluoreszierenden Lektin zu lebenden und toten Bakterien und menschlichen Zellen im Inneren angebracht identifizieren zu verwenden. Da beide Protokolle effektiv live aus toten Bakterien zu unterscheiden, deren Wahl-Protokoll zu verwenden, hängt von dem Ziel des Experiments. Das erste Protokoll verwendet Propidiumiodid zu nicht lebensfähigen Bakterien und SYTO9 intakte Nachweis von Bakterien zu erkennen. In <stron...

Es ist eine dynamische Interaktion und Ko-Evolution zwischen Bakterien und den Gastgebern in dem sie wohnen. Bakterien haben die Einhaltung Organellen, die Sekretion Systeme und / oder die Fähigkeit, Giftstoffe, die ihre produktiven Infektion von Wirts phagocytic und nicht-Fresszellen aktivieren produzieren entwickelt. Die Bakterien müssen auch Erkennung und antimikrobiellen Aktivitäten von dem Immunsystem des Wirts zu kämpfen. Das Immunsystem des Wirts wird der angeborenen und erworbenen Komponenten einschließlich der physikalischen und chemischen Barrieren, Immunzellen, die das Komplementsystem und andere Komponenten, der humoralen Immunität besteht. Während viele Bakterien sind empfindlich gegen Tötung und der Freigabe durch Reaktion der mehrschichtigen Immun haben einige pathogene und opportunistische Bakterien Mechanismen, die eine Vielzahl von Wirtszellen zu infizieren und zu untergraben Freigabe durch die Wirtsimmunantwort 1 entwickelt. Neisseria gonorrhoeae ist ein Beispiel für ein bakterielles Pathogen dass ist sehr geeignet ist, in seiner menschlichen Wirt. N bestehen. gonorrhoeae kolonisiert leicht luminalen Oberflächen der Schleimhaut-Epithelzellen des Urogenitaltrakts, des Rachens, der Bindehaut und Rektum. Colonization löst die reichlich Rekrutierung von Neutrophilen bei Schleimhautstellen. Neutrophile Granulozyten sind professionelle Phagozyten, die eine Vielzahl von antimikrobiellen Prozesse zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen, aber N. gonorrhoeae ist in der Lage zu überleben, in der Gegenwart von Neutrophilen 2-5. Verstehen, wie bakterielle Erreger wie N. gonorrhoeae zu untergraben, zu unterdrücken, und die Entführung der Immunantwort, um letztlich in der Regel feindlichen Host-Umgebungen zu überleben, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Versuchsprotokollen häufig verwendet, um bakterielle Überleben in Wirtszellen zu untersuchen sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl in Assays wird eine Population von infizierten Zellen lysiert (z. B. mit einem Detergens whICH die Bakterien resistent sind), um die Bakterien zu befreien. Die Lysate werden verdünnt und auf Agar-basierten Medien ausplattiert und koloniebildende Einheiten in den Lysaten werden für jeden Zeitpunkt und / oder experimentellen Bedingungen aufgeführt. Dieser Ansatz berichtet die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation, ist aber nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen intra-und extrazelluläre Überleben. Eine Variation der Koloniezahl-Assay, der Gentamicin-Schutz-Assay misst speziell intrazelluläre Überleben der Bakterien, basierend auf der Unfähigkeit der Antibiotika Gentamicin, die eukaryotische Zellmembran 6 kreuzen. Allerdings ist dieser Test von den Bakterien empfänglich für die Tötung von Gentamicin (oder einem anderen Antibiotikum, das ähnlich eukaryotischen Membran impermeant ist) und die Unfähigkeit des Antibiotikums, um den Zugriff auf interne Bakterien. Daher kann ein Gentamicin-Schutz-Assay nicht effektiv zur Prüfung aller Bakterienarten oder bei der Prüfung überlebenden Bakterien in hochpinocytic Zellen wie Neutrophilen. Keiner dieser Ansätze zeigt die subzelluläre Lokalisation oder andere Verhalten einzelner Bakterien (z. B. wenn die Bakterien bilden Aggregate oder Mikrokolonien, die unterschiedlich von einzelnen Bakterienzellen verhalten). Eine andere häufig verwendete Ansatz, um die Lebensfähigkeit der einzelnen internen und externen Bakterien zu untersuchen ist dünn Schnitt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Diese Vorgehensweise ist, dass sie Informationen über die Lage der Bakterien in Wirtszellen (zB Phagosom, Zytoplasma, Autophagosom), die durch Immunelektronenmikroskopie mit Gold-gekoppelten Antikörper gegen subzellulärer Marker untersucht werden kann vorteilhaft. Allerdings ist die Elektronenmikroskopie nicht besonders bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien empfindlich. Wenn eingebetteten Abschnitte mit Uranylacetat, Bleicitrat oder andere elektronendichte Reagenzien gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet sind elektronendichte Bakterien lebensfähig und als elektrotron-Lucent nicht lebensfähigen 7,8. Überschätzt jedoch diese Annahme Lebensfähigkeit der Bakterien, da nur jene toten Bakterien mit schwer gestört Membranen und frei von Zytoplasma elektronenleuchtenden angezeigt. Darüber hinaus können einige Bakterienarten eine Reihe von Elektronendichten in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsphase anzuzeigen, was es schwierig macht, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Als Alternative oder zusätzlich zu diesen verbreiteten Methoden hier stellen wir Protokolle und Gründe für die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Lebensfähigkeit der Bakterien zeigen, um das Überleben von Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Extrazelluläre Bakterien zu identifizieren, werden infizierte Zellen zuerst mit einem fluoreszierenden Reagenz, wie ein Lectin oder Bakterien-spezifischen Antikörper ausgesetzt. Die infizierten Zellen werden dann permeabilisiert und DNA-spezifische Farbstoffe, die differentiell zugänglich Bakterien mit intakten Membranen gegen abgebaut, als Ersatz für die Lebensfähigkeit von Bakterien ausgesetzt sind. In der ersten protocol, identifiziert die durchlässige Membran Farbstoff SYTO9 die Gesamtbakterienpopulation, während Propidiumiodid ist nur für jene Bakterien, die Membranen beeinträchtigt haben, und werden daher als nicht lebensfähig. Propidiumiodid und SYTO9 verwendet worden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien in Biofilmen zu bewerten, zu unterscheiden von nicht-pathogenen pathogenen Bakterien und aufzählen tragfähige Wasser übertragene Bakterien 9-12. In der zweiten Protokoll, 4 &#39;, 6&#39;-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert Gesamt Bakterien, während SYTOX Grün ist nur für den nicht lebensfähigen Bevölkerung. Die Lebensfähigkeit Farbstoffpaare können mit Immunfluoreszenz an Position jedes Bakterium im Vergleich zu einem Protein von Interesse beispielsweise um Bakterien subzelluläre Lokalisierung definieren bestimmen, kombiniert werden. Die Verwendung dieser Assays bietet wichtige Einblicke in die Interaktionen, die in Bakterienabtötung oder Überleben während der Infektion der Wirtszellen führen. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit der BeurteilungN. gonorrhoeae, die innerhalb und primären humanen neutrophilen Granulozyten, auch in verschiedenen Populationen von neutrophilen Phagosomen 5,13,14 angebracht ist. Allerdings können diese Protokolle angewendet werden, um die Lebensfähigkeit von gram-positiven und gram-negative Bakterien in professionellen Phagozyten, nicht-professionellen Phagozyten und Protozoen 15-24 beurteilen.

<table><tbody><tr><td>21 G 3/4 Schmetterlingsnadeln für die Blutentnahme</td><td>Becton Dickinson 367251</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen mit Natriumheparin 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriles Wasser für die Bewässerung</td><td>Baxter</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>RDCD0200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS no Ca2+ oder Mg2+</td><td>Thermo</td><td>Scientific SH3002802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll-Lösung</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm runde Glasdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gepooltes Humanserum</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Mediatech</td><td>15-040-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Humanes Interleukin-8</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL/CF</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 oder L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 oder L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka Analytisch</td><td>47036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-gekoppeltes Sojabohnen-Lektin</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Maus Anti-CD63</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>H5C6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Antikörper-Markierungskit</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämazytometer Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-mikroskopie-methoden zur bestimmung der lebensfähigkeit der bakterien in verbindung mit säugerzellen

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Aktuelle Protokolle, um diese Fragen zu beantworten sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl und Gentamicin-Schutztests beurteilen nur die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation und sind nicht in der Lage, einzelne Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen. Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen und einzelne Informationen hinsichtlich ihrer Lokalisation in Wirtszellen. Allerdings Bakterien zeigen oft eine Reihe von Elektronendichten, was eine Bewertung der Rentabilität schwierig. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. Diese Tests wurden ursprünglich entwickelt, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae in primären humanen neutrophilen Granulozyten zu bewerten, sondern sollte einpplicable einem Bakterium-Wirt-Interaktion. Diese Protokolle kombinieren membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoffen (SYTO9 und 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol [DAPI]), die alle Bakterien färben, mit Membran-undurchlässig Fluoreszenzfarbstoffen (Propidiumiodid und SYTOX Grüne), die nur zugänglich sind nicht lebensfähige Bakterien. Vor der eukaryotischen Zelle Permeabilisierung wird ein Antikörper oder fluoreszierenden Reagens zugegeben, um extrazelluläre Bakterien zu identifizieren. So sind diese Tests unterscheiden die Lebensfähigkeit der Bakterien an und innen eukaryotischen Zellen haften. Ein Protokoll wird auch für die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoffe in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern gegen eukaryotische Zellmarker, um die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Bakterien zu bestimmen. Die in diesem Artikel behandelt bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe sind eine sensible Ergänzung und / oder Alternative zu traditionellen Mikrobiologie Techniken, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu bewerten und Informationen, wo Bakterien in Wirtszelle überlebens.

Die skizzierten Protokolle wurden verwendet, um das Überleben von N. prüfen gonorrhoeae nach Einwirkung von primären humanen Neutrophilen 5,26. Neutrophile wurden mit N. infiziert gonorrhoeae und verarbeitet mit Protokoll 1, mit dem grün-fluoreszierenden Farbstoff SYTO9 Lebensfähigkeit und die rote fluoreszierende Propidiumiodid (Abbildung 4A). Die Farbstoffe wurden in Gegenwart von Saponin, die Cholesterin sequestriert, um vorzugsweise permeabilisiert Wirt...

Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Dieses Experiment mittels Fluoreszenzmikroskopie bewertet die Vitalität einzelner Bakterien, die mit Wirtszellen assoziiert sind, und bestimmt die Bakterienvitalität in verschiedenen subzellulären Lokalisationen. Zunächst, um externe Bakterien zu identifizieren, werden die infizierten Zellen einem fluoreszierenden Reagenz ausgesetzt, das spezifisch für die Bakterienpermease ist, wobei der infizierte Wirt in Gegenwart fluoreszierender Farbstoffe gehalten wird, die aufgrund der Integrität der bakteriellen Membran zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Bakterien unterscheiden. Anschließend, um anzugeben, wo sich die Bakterien innerhalb der Wirtszellen befinden, werden die infizierten Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen einen Marker der Untersuchungsinteresse inkubiert.Die resultierenden immunfluoreszenten Bilder ermöglichen die Bestimmung des Prozentsatzes an lebensfähigen Bakterien innerhalb und außerhalb von Wirtszellen sowie die subzelluläre Lokalisation von lebensfähigen im Vergleich zu nicht lebensfähigen intrazellulären Bakterien. Im Gegensatz zu Koloniezählassays, Gentamycin-Schutzassays und der Elektronenmikroskopie erlaubt diese Methode eine direkte Beurteilung der Lebensfähigkeit einzelner Bakterien. Außerdem kann sie Aufschluss darüber geben, ob Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Unterschiede in ihrer Lebensfähigkeit aufweisen.Brittany Johnson, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Geben Sie Bakterien der gewünschten Art zu Zellen, die auf runden Glasdeckeln in 24-Loch-Platten kultiviert werden, und inkubieren Sie für die gewünschte Zeit. Spülen Sie die infizierten Zellen einmal vorsichtig. Anschließend fügen Sie einen mit Alexa Fluor 647 gekoppelten Antikörper oder ein bakterienspezifisches Lektin hinzu, um externe Bakterien nachzuweisen, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.Nach zwei Spülgängen das Medium abpipettieren und 0,5 Milliliter einer Live-Dead-Färbelösung, die Cyto Nine und Propidiumiodid enthält, hinzufügen. Die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, dann zweimal mit MOPS-Magnesiumchlorid spülen. Die Deckgläser umdrehen und mit der Zellseite nach unten auf Objektträger aufsetzen.Versiegeln Sie mit klarem Nagellack. Nehmen Sie die Bilder innerhalb von 30 Minuten mit einem Fluoreszenzmikroskop auf, das über die im textbasierten Protokoll beschriebenen Filteranlagen verfügt, um die Bakterien zu markieren. Geben Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter DPI in das definierte Mors-Medium hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.Infizieren Sie nun die anhaftenden Zellen mit DPI-markierten Bakterien. Fixieren Sie die Zellen nicht mit Aldehyden oder organischen Lösungsmitteln. Spülen Sie die Zellen einmal ab.Danach Alexa Fluor 647-markiertes Antikörper oder Lektin hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach zwei Waschungen mit MOPS-Puffer, ein Alexa Fluor 555-markiertes Antikörper gegen den gewünschten subzellulären Marker hinzufügen und 20 Minuten inkubieren. Nach zwei erneuten Waschungen mit MOPS-Puffer, die Zellen einmal mit MOPS-Magnesiumchlorid waschen. Dann das Medium absaugen und 0,4 Mikromolar Cyt Green zugeben, anschließend die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, danach die Zellen zweimal mit MOPS-Magnesiumchlorid spülen.Waschen Sie die Zellen anschließend erneut für fünf Minuten in MOPS-Magnesiumchlorid. Legen Sie die Deckgläser umgekehrt mit der Zellseite nach unten auf Objektträger und verschließen Sie sie mit klarem Nagellack. Nehmen Sie innerhalb von 30 Minuten Bilder der Präparate am Fluoreszenzmikroskop auf.In diesem Experiment wurden humane Neutrophile mit Gonorrhoe infiziert. Das mit Alexa Fluor 647 gekoppelte Sojabohnen-Lektin markiert die extrazelluläre Gonorrhoe. Anschließend wurden die grün fluoreszierende Vitalfarbe und das rot fluoreszierende Propidiumiodid in Gegenwart von Saponin hinzugefügt, das Cholesterin bindet und dadurch vorzugsweise die Plasmamembranen der Wirtszellen permeabilisiert, jedoch nicht die Membran der Gonokokken in infizierten Zellen durchdringt. Der eukaryotische Zellkern färbt sich dabei sowohl mit dem Cyto-Nin als auch mit Propidiumiodid an.Diese Bilder von Gonorrhoe-infizierten Neutrophilen wurden mithilfe der Vitalitätsfarbstoffe Cyt Talk Screen und DPI erzeugt. Der Propidiumiodid-Farbstoff wurde nicht verwendet, da er sowohl im roten als auch im ultravioletten Kanal des Fluoreszenzmikroskops fluoresziert. Alle Gonokokken färben mit DPI, aber nur Bakterien mit geschädigten Membranen färben mit Ox Green. Die nichtlebensfähigen intrazellulären Bakterien weisen einen ringförmigen Nachweis für CD 63 auf, der die Bakterien umgibt. Dieser Ring weist darauf hin, dass primäre Granula an diesem Phagosom angereichert sind. Das lebensfähige intrazelluläre Bakterium zeigt keinen Nachweis für CD 63, was darauf hindeutet, dass keine Anreicherung primärer Granula an seinem Phagosom erfolgt. Aufgenommen.Insgesamt zeigen die Daten eine Korrelation zwischen der Lebensfähigkeit von Gonokokken und deren Aufenthalt in einem primären, granulären negativen Phagosom. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man die Lebensfähigkeit von Bakterien in Wirtszellen beurteilt. Außerdem werden Sie in der Lage sein, die Lebensfähigkeit von Bakterien, die in verschiedenen Kompartimenten der Wirtszellen lokalisiert sind, mithilfe von Antikörpern, die gegen diese subzellulären Kompartimente gerichtet sind, zu bestimmen.

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir beschreiben einen alternativen Ansatz, um die Auszählung von...

A Functional Whole Blood Assay zur Rentabilität von Mykobakterien Measure, mit Reporter-Gene BCG oder M. Tb (BCG Tagged Lux / M. Tb Lux)

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Dieser Artikel stellt zwei Protokolle vor: eines, um anaerobe Bakterien zu messen, die erfolgreich in den Wirt eindringen und darin überleben können, und das andere, um anaerobe Bakterien zu visualisieren, die mit Wirtszellen interagieren. Diese Studie kann auf jede kultivierbare anaerobe und jeden eukaryotischen Zelltyp angewendet werden.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Hierin wird ein Verfahren zur Bestimmung der Assoziation und Konkurrenz zwischen den Königreichen (bakteriell und pilzlich) für die Adhärenz an virusinfizierten HeLa-Zell-Monoschichten beschrieben. Dieses Protokoll kann auf mehrere Kombinationen von Prokaryoten, Eukaryoten und Viren ausgeweitet werden.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Verwendung der Einzelzellfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung der bakteriellen Konkurrenz in der Kokultur.

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Lernen Sie Fluoreszenz-Mikroskopie zur Bestimmung der Bakterienlebensfähigkeit in Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht die direkte Visualisierung lebender und toter Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten.

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

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